Een abonnement op JoVE is vereist om deze inhoud te bekijken. Log in of start vandaag met uw gratis proefperiode.

Methodenartikel

Directe herprogrammering van menselijke fibroblasten in myoblasten om therapieën voor neuromusculaire aandoeningen te onderzoeken

6.4K weergaven

⸱

DOI:

10.3791/61991

⸱

3 april 2021

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Center for Gene Therapy, The Research Institute at Nationwide Children’s Hospital, 2Center for Cardiovascular Research, The Research Institute at Nationwide Children’s Hospital, 3The Heart Center, Nationwide Children’s Hospital, 4Division of Genetic and Genomic Medicine, Nationwide Children’s Hospital, 5Department of Human Genetics, The University of Utah School of Medicine, 6Department of Pediatrics, The Ohio State University

In dit artikel

Samenvatting

Dit protocol beschrijft de omzetting van huidfibbroblasten in myoblasten en hun differentiatie in myotubes. De cellijnen zijn afgeleid van patiënten met neuromusculaire aandoeningen en kunnen worden gebruikt om pathologische mechanismen te onderzoeken en therapeutische strategieën te testen.

Samenvatting

Onderzoeken naar zowel de pathofysiologie als therapeutische doelen in spierdystrofieën zijn belemmerd door de beperkte proliferatieve capaciteit van menselijke myoblasten. Er zijn verschillende muismodellen gemaakt, maar ze vertegenwoordigen niet echt de menselijke fysiopathologie van de ziekte of zijn niet representatief voor het brede spectrum van mutaties bij mensen. De vereeuwiging van menselijke primaire myoblasten is een alternatief voor deze beperking; het is echter nog steeds afhankelijk van spierbiopsieën, die invasief zijn en niet gemakkelijk beschikbaar zijn. Huidbiopten zijn daarentegen gemakkelijker te verkrijgen en minder invasief voor patiënten. Fibroblasten afgeleid van huidbiopten kunnen worden vereeuwigd en getransdifferentieerd in myoblasten, waardoor een bron van cellen met een uitstekend myogen potentieel wordt geboden. Hier beschrijven we een snelle en directe herprogrammeringsmethode van fibroblast in een myogene afstamming. Fibroblasten worden getransduceerd met twee lentivirussen: hTERT om de primaire cultuur te vereeuwigen en een tet-inducerende MYOD, die bij toevoeging van doxycycline de omzetting van fibroblasten in myoblasten induceert en vervolgens myotubes rijpt, die late differentiatiemarkers uitdrukken. Dit snelle transdifferentiatieprotocol is een krachtig instrument om pathologische mechanismen te onderzoeken en innovatieve gengebaseerde of farmacologische biotherapieën voor neuromusculaire aandoeningen te onderzoeken.

Inleiding

Cellulaire modellen die rechtstreeks uit menselijke weefsels worden verkregen, zijn nuttig om veel menselijke genetische aandoeningen te modelleren, met het voordeel dat ze de oorspronkelijke genomische context hebben en in veel gevallen dezelfde moleculaire en cellulaire kenmerken reproduceren die bij de patiënten worden waargenomen. Op het gebied van neuromusculaire aandoeningen zijn spierbiopten een grote bron van menselijke myoblasten geweest en hebben ze geholpen bij de opheldering van pathologische mechanismen. Bovendien zijn ze een belangrijk hulpmiddel voor in vivo testen van geneesmiddelen en gentherapieën. Aan de ene kant is de afleiding van myoblasten uit spierfragmenten relatief eenvoudig. Aan de andere kant zijn de cultuur en het onderhoud van primaire myoblasten uitdagend, vanwege hun beperkte proliferatiesnelheid en replicatieve senescentie in vitro1. Een alternatief voor deze beperkingen is het vereeuwigen van myoblasten met het inbrengen van de menselijke telomerase (hTERT) en/of cycline-afhankelijke kinase 4 (CDK4) genen2,3, met behoud van skeletspierkenmerken4. Niettemin is de obtentie van primaire myoblasten nog steeds afhankelijk van spierbiopsie, een chirurgische procedure met nadelen voor de patiënten, die in veel gevallen hun spieren in geavanceerde degeneratie hebben. De spier van deze patiënten bestaat dus uit een aanzienlijk deel van het fibrotische en/of vetweefsel en levert minder spiercellen op, waardoor de cellen eerder moeten worden gezuiverd tot de vereeuwiging.

In tegenstelling tot spierbiopten zijn huidbiopten toegankelijker en minder schadelijk voor patiënten. Primaire fibroblasten kunnen in vitroworden afgeleid uit huidfragmenten . Hoewel fibroblasten niet voornamelijk worden beïnvloed door mutaties die neuromusculaire aandoeningen veroorzaken, kunnen ze worden getransdifferentieerd in myoblasten. Dit kan worden bereikt door het inbrengen van het Myod-gen, een myogene transcriptiefactor5. In dit manuscript beschrijven we het protocol om getransdifferentieerde myoblasten te verkrijgen, van de oprichting van fibroblastenculturen tot de obtentie van gedifferentieerde myostubes (een representatieve samenvatting van de methode is afgebeeld in figuur 1).

Preklinisch testen van therapeutische strategieën is afhankelijk van cellulaire en dierlijke modellen met mutaties die vergelijkbaar zijn met de mutaties die bij menselijke patiënten worden gevonden. Hoewel de ontwikkeling van diermodellen haalbaarder is geworden met de opmars van genbewerkingstechnologieën zoals CRISPR/Cas96, is het nog steeds uitdagend en kostbaar. Van patiënten afgeleide cellijnen zijn dus een toegankelijke optie om modellen te hebben, die het grote spectrum van mutaties van ziekten zoals Duchenne spierdystrofie (DMD) bestrijken. Obtention en creatie van celmodellen zijn cruciaal voor de ontwikkeling van gepersonaliseerde therapieën voor dergelijke pathologieën.

Onder gepersonaliseerde therapieën die zijn onderzocht, exon skipping strategieën is een van de veelbelovende voor verschillende spierdystrofieën7,8. Deze strategie bestaat uit het produceren van een korter maar functioneel eiwit. Dit wordt uitgevoerd door de exon-definitie te verbergen voor het spliceosome, waardoor de gemuteerde exon wordt uitgesloten van de laatste boodschapper. Dit is een veelbelovende technologie die is goedgekeurd door de FDA voor DMD. Zo beschrijven we in dit protocol ook methoden om myoblasten te transfecteren met twee verschillende exon skipping gerelateerde technologieën: antisense oligonucleotiden (AON) en U7snRNA-adeno-geassocieerd virus (AAV). AON-transfectie is een goed hulpmiddel voor de eerste screening van verschillende sequenties die zijn ontworpen om exon skipping9te bevorderen. De activiteit van AON's is echter van voorbijgaande aard. Om een aanhoudende expressie van antisense sequenties te verkrijgen, onderzochten we ook kleine nucleaire RNA's (snRNA's) in combinatie met AAV, waardoor nucleaire lokalisatie en opname in de splicingmachines mogelijk werd10. U7 is een snRNA dat betrokken is bij de verwerking van histon mRNA dat kan worden ontworpen om eiwitten te binden die het naar het spliceosome zullen leiden en antisense sequenties11zullen leveren. Het gebruik van gewijzigde U7-snRNA 's in combinatie met AAV-vectoren overwint beperkingen van AION 's , wat resulteert in een voortdurende expressie van de AION 's en een betere transductie van aandachtsweefsels12. We gebruiken cellen afgeleid van DMD-patiënten voor dit protocol om de exon-skippingstrategie te illustreren.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Protocol

Alle experimenten en biopsieën werden uitgevoerd volgens de ethische regels van de betrokken instellingen onder de goedkeuring van de Nationwide Children's Hospital Institutional Review Board.

1. Initiatie van de huidfibbroblastencultuur

  1. Oprichting van de fibroblastencultuur
    1. Aliquot 10 ml fibroblastmedium (tabel 1) in conische buizen van 15 ml. De huidbiopsie moet in dit medium worden geplaatst en getransporteerd. De biopsie kan bij 4 °C worden bewaard totdat deze wordt verwerkt, bij voorkeur op dezelfde dag.
      OPMERKING: Gebruik de huidbiopsie binnen 24-36 uur om mogelijke groei van besmetting te voorkomen.
    2. Aspirateer het medium uit de buis en spoel de biopsie drie keer af met 10 ml 1X PBS (kamertemperatuur). Laat na de derde wasbeurt de PBS in de tube.
    3. Giet de PBS en de schil uit op een schaal van 10 cm2.
    4. Snijd met steriele scalpels de biopsie in zo kleine fragmenten.
    5. Breng met behulp van een pipet een individueel huidfragment over en laat het vallen in een schone schaal van 10 cm2. Plaats 10 tot 12 fragmenten per schaal.
    6. Aspirateer het teveel aan PBS van rond elk fragment. Wees voorzichtig om het fragment niet aan te zuigen.
    7. Bedek de gerechten gedeeltelijk met het deksel en laat de huidfragmenten 5-20 minuten drogen. Laat de fragmenten niet overmatig drogen.
    8. Zodra de fragmenten droog zijn, kantelt u de schaal op 45 graden en voegt u langzaam 12 ml fibroblastmedium toe aan de hoek. Laat de schaal zakken en verspreid de media voorzichtig, zodat de fragmenten niet door de media worden optillen.
    9. Doe de borden in de incubator (37 °C, 5% CO2). Vervang de media in 5-7 dagen en eenmaal per week erna.
    10. Observeer de fibroblasten die uit het fragment tevoorschijn komen (figuur 2) en passeer, eenmaal samenvloeiend, de cellen in 75 cm2 kolven. Verwijder het medium, spoel de cellen af met PBS en voeg 1 ml 0,25 % trypsine toe. Incubeer bij 37 °C gedurende 5 minuten of totdat alle cellen zijn opgetild. Voeg 10 ml fibroblast groeimedium toe om de trypsine te remmen en breng de cellen over naar een nieuwe kolf.
      OPMERKING: Voor passagenummernomenclatuur wordt P1 vastgesteld wanneer de eerste fibroblasten die uit de huidbiopsie zijn ontstaan, worden overgebracht naar een nieuwe kolf voor proliferatie.
  2. Cryopreservatie van primaire fibroblastlijnen
    1. Zodra de 75 cm2 kolf samenvloeit, spoelt u deze af met 10 ml 1X PBS en aspireert u PBS.
    2. Voeg 3 ml trypsine van 0,25 % toe aan het celoppervlak. Plaats de kolf 5 minuten in de couveuse. Controleer de kolven onder de microscoop om te zien of de cellen zijn opgetild. Zo niet, plaats de kolf dan nog eens 5 minuten terug in de couveuse.
    3. Zodra de cellen zijn losgemaakt, voegt u 7 ml fibroblastmedia toe aan de kolf en pipet op en neer om de cellen opnieuw te gebruiken. Verzamel de cellen in een conische buis van 50 ml.
    4. Bereid 100 μL aliquot trypanblauw en verwijder 100 μL uit het monster dat cryopreserveerd is, meng met de trypan blauw. Plaats het mengsel op de hemocytometer om te tellen. Tel de cellen in vier verschillende velden van de hemocytometer onder de microscoop. Als u het totale aantal cellen wilt berekenen, gebruikt u de formule: (getelde cellen/100) * cultuurvolume.
    5. Draai de conische buizen 10 minuten op 300 x g bij kamertemperatuur of 4 °C.
    6. Aspirateer het medium en resuspendeer de cellen in het juiste volume vriesmedium: 1 ml per elke 1 miljoen cellen/flacon. Pipet op en neer om 1 ml te homogeniseren en te verdelen over elk gelabeld cryovial.
    7. Plaats de flacons in de vriesbak en laat de flacons 's nachts invriezen met een snelheid van 1 °C/min bij een vriezer van -80 °C.
    8. Breng de injectieflacons de volgende dag over in een vloeibare stikstoftank of -150 °C vriezer.

2. Oprichting van de cellijn FibroMyoblasts (FM)

  1. Zaad primaire fibroblasten bij ongeveer 30% van de samenvloeiing in twee putten van een 12-put plaat (2 x 104 cellen / put) om ongeveer 50% van de samenvloeiing de volgende dag.
  2. Voeg voor lentivirale transductie 2 tot 5 x 109 vg (virale genoomdeeltjes) hTERT-puromycine lentivirus toe in 400 μL fibroblastmedium. Voeg aan de tweede put slechts 400 μL fibroblastmedium toe. Voeg de volgende dag 1 ml media toe.
    OPMERKING: Plasmiden voor de productie van lentivirus werden verkregen van de groep die het Chaouch et al, 2009-document publiceerde. Ze worden ook individueel beschreven in Aure et al, 200713 voor hTERT plasmid en Barde et al, 200614 voor het Tet-on systeem dat wordt gebruikt voor het ontwerp van MyoD plasmide. Ze werden verkregen dankzij een material transfer agreement met Genethon, Frankrijk (neem contact op met Dr. Vincent Mouly om deze plasmiden te verkrijgen - vincent.mouly@upmc.fr). Kortom, de hTERT bestaat uit hTERT variant 1 aangedreven door een CMV promotor, terwijl de puromycine wordt aangedreven door een PGK promotor. De MyoD plasmide bevat een MyoD variant 1 aangedreven door een CMV promotor onder controle van de repressor rtTA2. Deze plasmid bevat ook de hygromycine selectie uitgedrukt dankzij de SV40 promotor.
    Lentivirussen werden geproduceerd met behulp van regelmatige lentivirale productie (zie Wang en McManus JoVe protocol15). Kort, MDL-helper, Rev-Helper, SVS-G-helper werden getransfecteerd via calciumchloride neerslag ook van hTERT of MyoD plasmiden. Na 48 uur werd het supernatant verzameld en daarna nog eens drie dagen. Alle supernatant werd vervolgens geconcentreerd door ultracentrifugatie. De pellet werd vervolgens geresuspendeerd in Tris-HCL+NaCl+EDTA buffer. Titer schatting werd geëvalueerd door standaard lentivirus qPCR assay.
  3. Een of twee dagen later, breng de cellen over in een 6-put plaat en kweek ze tot het bereiken van 60-70% samenvloeiing.
  4. Vul het fibroblastmedium aan met 1 μg/ml puromycine en voeg 2 ml toe aan elke put.
  5. Houd de cellen onder selectie totdat alle cellen in de controleput dood zijn (tot 12 dagen), en verander de media elke 2-3 dagen. Passage de cellen van de 6-put plaat in twee 10 cm2 gerechten voor verdere proliferatie.
  6. Vries flacons fibroblasten in na selectie. Label als F(hTer).
  7. Zaad hTERT-uitdrukkende fibroblasten (F(hTer)) bij ongeveer 30% samenvloeiing in fibroblastmedium, in twee putten van een plaat met 12 putten, om de volgende dag ongeveer 50% samenvloeiing te hebben.
  8. Meng voor lentivirustransductie 2 tot 5 x 109 vg MyoD-hygromycineB lentivirus in 400 μl fibroblastmedium en voeg toe aan de respectieve putten; voeg aan de derde put 400 μl fibroblast medium toe. Voeg de volgende dag 1 ml medium toe.
  9. Breng een of twee dagen later de cellen over in een plaat met 6 putten en groei tot 60-70% samenvloeiing.
  10. Vul het fibroblast groeimedium aan met hygromycine B (400 μg/ml) en voeg 2 ml toe aan elke put.
  11. Houd de cellen onder selectie totdat alle cellen in de controleput dood zijn (tot 12 dagen), en verander de media elke 2-3 dagen.
  12. Vries flacons fibroblasten in na selectie. Label als FM gevolgd door het celidentificatienummer/-naam.

3. Transdifferentiatieprotocol

  1. Zaad getransduceerde FM op 10 cm2 gerechten met 30-40% samenvloeiing. Zaai in een 12-putplaat 6 x 104 cellen (dit is afhankelijk van de individuele cellijn).
    OPMERKING: Voor immunostaining, zaadcellen op glazen coverslips of kamerglijbanen bedekt met Matrigel. Verdun Matrigel om 1:10 in DMEM medium, voeg een volume toe dat genoeg is om het oppervlak te bedekken en laat de dia's een uur op kamertemperatuur zitten. Aspirateer vlak voor het zaaien van de cellen.
  2. Voor myoblastinductie, wanneer de fibroblasten 70% samenvloeiing bereikten(figuur 3A),spoel het celoppervlak af met PBS en voeg verse myoblastmedia toe, aangevuld met verse 8 μg/ml doxycycline.
    OPMERKING: Het succes van differentiatie wordt gecompromitteerd voorbij 80% samenvloeiing.
  3. Na twee tot drie dagen later zijn cellen voor 90-95% samenvloeiend en zal hun morfologie zijn veranderd (figuur 3B). Spoel het celoppervlak af met PBS en voeg verse differentiatiemedia toe, aangevuld met vers 8 μg/ml doxycycline.
  4. Blijf elke 2-3 dagen van medium veranderen zonder te passeren totdat myotubes zijn vastgesteld (bevestigen via morfologie) (Figuur 3C).
  5. Zeven tot tien dagen na het starten van myotube-differentiatie moeten cellen volledig worden gedifferentieerd en kunnen ze losraken of sterven. Voordat dit gebeurt, oogst myotubes voor verdere analyse.
    OPMERKING: Het verloop van de myotube-vorming hangt af van de cellijn. Mutaties in spiergerelateerde eiwitten kunnen interfereren met het myogene potentieel. Wanneer myotubes helder beginnen te lijken en er wit uitzien aan de randen, is dit een signaal dat ze beginnen los te maken (figuur 4).
  6. Om myotubes te oogsten, verzamel je media en breng je deze over in een conische buis van 50 ml. Het medium kan myotubes bevatten die zijn losgemaakt.
  7. Spoel de myotubes af met 5 ml PBS en breng PBS over naar de buis van 50 ml.
  8. Voeg 3 ml trypsine van 0,25 % toe aan het celoppervlak. Plaats de schaal 5 minuten in de couveuse. Controleer de schaal onder de microscoop om te zien of de cellen zijn opgetild. Zo niet, plaats het dan nog eens 5 minuten terug in de incubator.
  9. Zodra de cellen zijn losgemaakt, voegt u 7 ml fibroblastmedia toe aan de schaal en pipet op en neer om de cellen opnieuw te gebruiken. Verzamel de cellen in de conische buis van 50 ml.
  10. Centrifugeren bij 1.200 x g gedurende 7 min bij 4 °C.
  11. Trek de vloeistof voorzichtig aan, zonder de pellet te storen. Bewaar de pellets bij -80 °C tot verdere verwerking.

4. Immunostaining van gedifferentieerde myotubes

OPMERKING: Voor immunostainring, kweek de cellen in glazen coverslips of kamerdia's zoals hierboven vermeld.

  1. Zodra myotubes volledig zijn gedifferentieerd, aspireer je de media en spoel je de dia's voorzichtig af met PBS. Aspirate PBS uit.
  2. Voeg verse 4% PFA (500 μL per put van een plaat van 12 putten) toe en broed gedurende 10 minuten op kamertemperatuur. Aspirate PFA uit.
  3. Afspoelen met 1 ml PBS.
  4. Incubeer met 0,2 M glycine bij kamertemperatuur, gedurende 10 minuten. Aspirate glycine uit.
  5. Permeabiliseer met PBS 0,5% TritonX-100 (300 μL/put van een 12-putplaat), gedurende 10 minuten met zachte agitatie.
  6. Blok met 300 μL/put van blokkerende oplossing, gedurende 10 minuten met zachte agitatie.
  7. Incub met primair antilichaam verdund 1:50 in 300 μL blokkeeroplossing, gedurende 2 uur bij kamertemperatuur, met zacht schudden.
  8. Spoel drie keer met 1 ml/put PBS gedurende 5 minuten, met zacht schudden.
  9. Incubatie met secundair antilichaam verdund 1:500 in 300 μL blokkeeroplossing, gedurende 1 uur, bij kamertemperatuur, met zacht schudden. Bedek de plaat met aluminiumfolie.
  10. Spoel drie keer met 1 ml/put PBS gedurende 5 minuten, met zacht schudden.
  11. Incubeer met DAPI verdund in PBS gedurende 10 minuten. Spoel drie keer met 1 ml/put PBS.
  12. Voeg een druppel montagemedium toe aan een glazen glijbaan. Verwijder de afdeklip met een tang en plaats deze met het gezicht naar beneden op de druppel montagemedium.
  13. Schuif omkeren op een keukenpapier en druk voorzichtig op om bellen en overtollig montagemedium te verwijderen.
  14. Sluit de dia's af met nagellak en bewaar ze op 4 °C tot de afbeelding.

5. Antisense oligonucleotide transfectie

OPMERKING: Het onderstaande protocol is voor de transfectie van een plaat met 6 putten. Pas de volumes dienovereenkomstig aan voor kleinere of grotere platen. De transfectie gebeurt in 100% samenvloeiende myoblasten wanneer de cellen klaar zijn voor de differentiatiestap.

  1. Aspirateer de myoblast groeimedia en spoel de cellen af met 1 ml PBS.
  2. Voeg 500 μL/put OptiMEM-media toe en incubeer gedurende 1 uur bij 37 °C.
  3. Verdun het antisense oligonucleotide (AON) in 100 μL OptiMEM tot de gewenste eindconcentratie (d.w.z. 50 nM, 100 nM, 200 nM, 500 nM). Incubeer op kamertemperatuur gedurende 5 minuten.
    OPMERKING: Dit protocol is geoptimaliseerd voor 2'omethyl-fosforothioaat AON's.
  4. Meng de lipofectamine met OptiMEM (eindvolume van 100 μL) om een uiteindelijke verhouding van 1:1 (μg DNA: μL lipofectamine) te geven. Incubeer op kamertemperatuur gedurende 5 minuten.
  5. Combineer de verdunde lipofectamine met de verdunde AON. Meng zachtjes door te pipetten en incubeer gedurende 20 minuten op kamertemperatuur om complexe vorming mogelijk te maken. Vermijd luchtbellen.
  6. Voeg 200 μL lipofectamine en AON mix toe aan de respectievelijke putten. Incubeer de cellen 's nachts bij 37 °C, 5% CO2.
  7. Verwijder de volgende dag de transfectiemix en voeg 2 ml warme differentiatiemedia toe, aangevuld met doxycycline.
  8. Verzamel cellen ten minste drie dagen later voor RNA-extractie of zeven tot 21 dagen in geval van eiwitanalyse.
    OPMERKING: De dagen van differentiatie die nodig zijn om RNA en/of eiwitexpressie te detecteren, kunnen dienovereenkomstig variëren tot het gen van belang of de cellijn. In het geval van DMDis het mogelijk om het mRNA binnen drie dagen te detecteren. Dystrofine eiwit detectie vereist ten minste zeven dagen. Dit is afhankelijk van de mobiele lijn. Hoge concentraties AON en transfectiereagens kunnen de transdifferentiatie beïnvloeden.

6. AAV1-U7 transductie

OPMERKING: Dit protocol is geoptimaliseerd voor platen met 6 putten. Pas de volumes proportioneel aan het cultuuroppervlak aan. De transductie gebeurt in 100% samenvloeiende myoblasten wanneer de cellen klaar zijn voor de differentiatiestap. AAV1 is het AAV-serotype met de beste transductiecapaciteit van gekweekte myoblasten.

  1. Aspirateer het myoblast groeimedium en spoel de cellen af met 1 ml PBS.
  2. Verdun 0,5-1 x 1011 virale deeltjes AAV1-U7 in 700 μL warme differentiatiemedia aangevuld met doxycycline.
    OPMERKING: We gebruiken qPCR om de virale concentratie te bepalen. De hoeveelheid virus die moet worden gebruikt, kan variëren afhankelijk van de kwantificeringsmethode en moet eerder worden bepaald met behulp van een reporter-test.
  3. Voeg de virale mix toe aan de put door deze homogeen te laten vallen.
  4. Voeg de volgende dag 1,3 ml warme differentiatiemedia toe, aangevuld met doxycycline.
  5. Verzamel de cellen ten minste drie dagen later voor RNA-extractie of zeven tot 21 dagen in geval van eiwitanalyse.

7. RNA-extractie

OPMERKING: Al het materiaal dat tijdens deze stap wordt gebruikt, moet RNase-vrij zijn.

  1. Voeg 500 μL TRIzol per pellet toe en pipet meerdere keren op en neer om ervoor te zorgen dat cellen homogeen worden gelyseerd.
  2. Breng de cel lysaat over in een tube van 1,5 ml en geïncubeerd gedurende 5 minuten bij kamertemperatuur.
  3. Voeg 100 μL chloroform toe en schud handmatig gedurende 15 s. Incubeer gedurende 5 minuten op kamertemperatuur.
  4. Centrifugeren bij 12.000 x g gedurende 15 min bij 4 °C. Verzamel de waterige fase (bovenste) en breng deze over in een nieuwe buis van 1,5 ml.
  5. Voeg voor 1 volume van de waterfase 1 volume ethanol 100% toe en meng door pipetten.
    OPMERKING: We raden kolomzuivering en concentratie aan.
  6. Breng het monster over in een Zymo-Spin IC-kolom in een verzamelbuis en centrifugeer op 12.000 x g gedurende 30 s. Gooi de doorstroming weg.
  7. Voor DNase I-vergisting in de kolom wast u de kolom voor met 400 μL RNA Wash Buffer. Centrifugeren bij 12.000 x g voor 30 s. Gooi de doorstroming weg.
  8. Bereid 40 μL DNase-reactiemix per monster. Meng 5 μL DNase I met 35 μL DNA Digestion Buffer.
  9. Voeg de mix direct toe aan de kolommatrix. Incubeer bij kamertemperatuur gedurende 15 minuten.
  10. Voeg 400 μL RNA Prep Buffer toe aan de kolom en centrifugeer bij 12.000 x g gedurende 30 s. Gooi de doorstroming weg.
  11. Voeg 700 μL RNA Wash Buffer toe aan de kolom en centrifugeer op 12.000 x g gedurende 30 s. Gooi de doorstroming weg.
  12. Voeg 400 μL RNA Wash Buffer toe aan de kolom en centrifugeer gedurende 2 minuten op 12.000 x g om volledige verwijdering van de wasbuffer te garanderen. Breng de kolom voorzichtig over in een RNase-vrije buis van 1,5 ml.
  13. Voeg 15 μL nucleasevrij water rechtstreeks toe aan de kolommatrix. Incubeer gedurende 5 minuten en centrifugeer gedurende 1 minuut op 12.000 x g.
    OPMERKING: Verzamel het geëtste RNA en pas het opnieuw toe op de kolom om de opbrengst te verhogen. Centrifugeer gedurende 1 minuut op 12.000 x g.
  14. Plaats monsters op ijs en kwantificeer de monsters in een Nanodrop.
  15. Bewaar monsters bij -80 °C.

8. RT-PCR-analyse

OPMERKING: In deze stap presenteren we een suggestie van reagentia om de expressie van dystrofine mRNA te detecteren, maar het kan gemakkelijk worden aangepast aan andere reagentia naar keuze.

  1. Omgekeerde transcriptie
    1. Ontdooi alle reagentia en houd ze in het ijs.
    2. Bereid een mengsel voor met 4 μL 5x reactiebuffer, 2 μL dNTP-mix (10 mM), 1 μL RiboLock RNase-remmer en 1 μL RevertAid RT.
    3. Meng de buis voorzichtig en centrifugeer kort.
    4. Voeg in PCR-buizen van 0,2 ml het juiste volume RNA toe om 1 μg per reactie te hebben. Voeg nucleasevrij water q.s.p 12 μL toe. Voeg één buis zonder omgekeerde transcriptase toe als negatieve controle en één buis met nucleasevrij water in plaats van RNA.
    5. Verdeel 8 μL reactiemix per buis. Het totale volume is 20 μL.
    6. Plaats buizen in een thermocycler en incubeer gedurende 5 min bij 25 °C gevolgd door 60 min bij 42 °C. Stop de reactie door 5 minuten op 70 °C te verwarmen.
    7. Plaats de buizen op ijs of bij -20 °C voor langere opslag.
  2. Pcr
    OPMERKING: Ontwerp primers bij voorkeur op exons-knooppunten.
    1. Vortex reagentia en draai naar beneden voor gebruik.
    2. Bereid een mastermix voor met 0,5 μL voorwaartse primer (25 μM), 0,5 μL reverse primer (25 μM), 12,5 μL 2x PCR Master Mix en 8,5 μL nucleasevrij water per monster.
    3. Aliquot 22 μL master mix in een tube voor elk monster.
    4. Voeg 3 μL cDNA (150 ng) toe aan de betreffende PCR-buis. Voeg 3 μL nucleasevrij water toe aan de pcr-negatieve controlebuis.
    5. Vortex en draai de PCR-buizen naar beneden.
    6. Incubeer de buizen in een thermocycler bij 95 °C gedurende 3 min, 95 °C gedurende 30 s, (Tm-5) °C gedurende 30 s, 72 °C gedurende (1 min/kb) 34 keer, 72 °C gedurende 5 minuten.
      OPMERKING: De optimale gloeitemperatuur kan empirisch worden bepaald. Trek voor de voorgestelde hoofdmix 5 °C af van de smelttemperatuur van de primer.
    7. Laad 12 μL van de PCR-reactie op een agarosegel en vries de monsters in bij -20 °C.

9. Detectie van dystrofine expressie door Western Blotting

OPMERKING: Dit protocol is geoptimaliseerd voor dystrofine, een groot membraaneiwit. Voor verschillende eiwitten kunnen specifieke aandoeningen nodig zijn.

  1. Eiwitextractie
    1. Verzamel na 7-21 dagen differentiatie cellen met 5 ml PBS met 100 μL 0,5 M EDTA en 50 μL proteaseremmers. Incubeer bij 37 °C totdat de cellen losraken. Centrifugeren bij 1.200 x g gedurende 5 min bij 4 °C. Knip de pellet in door de buis in vloeibare stikstof te dompelen. Bewaar de pellet bij -80 °C of ga verder met de lysestap.
    2. Bereid lysisbuffer voor door 1% digitonine, 1% proteaseremmer, 10% fosfataseremmer en basisbuffer toe te voegen aan het totale volume (60 μL per celpellet).
    3. Voeg 60 μL lysisbuffer toe aan de celpellet, op ijs. Sonicaat gedurende 5 s. Laat 8 s op ijs zitten. Herhaal de sonicatie- en ruststappen twee keer.
    4. Incubeer monsters op ijs gedurende 30 minuten.
    5. Centrifugeren bij 14.000 x g gedurende 20 min bij 4 °C.
    6. Breng de supernatant over op schone buizen.
    7. Kwantificeer monsters door middel van bicinchoninic acid (BCA) test, volgens de instructies van de fabrikant.
    8. Meng de eiwitoplossing met het juiste volume Laemmli-buffer. Maak aliquots van 100 μg. Stel indien nodig het volume in op 25 μl met basislysebuffer. Bewaar monsters bij -80 °C.
  2. Westerse vlekken
    1. Ontdooi monsters op ijs.
    2. Denatureren de monsters bij 100 °C gedurende 5 minuten, koel ze vervolgens af in ijs, draai naar beneden.
    3. Verdun de 20X Tris-acetaat SDS loopbuffer in 200 ml dH2O en voeg 500 μL antioxidant toe.
    4. Bereid de 3-8% Tris-acetaat polyacrylamide gel voor door de kam te verwijderen en te spoelen met dH2O. Monteer de gel in het elektroforeseapparaat. Vul de binnenkamer met een lopende buffer.
    5. Laad 5 μL eiwitladder en 25 μL monster in de gel. Vul de buitenkamer met lopende buffer.
    6. Loop bij 80 V gedurende 1 uur bij 4 °C. Vervolgens bij 120 V gedurende 2 uur bij 4 °C.
    7. Bereid 3 L 1X transferbuffer voor met 150 ml 20X methanol, 150 ml 20X transferbuffer en 2.700 ml dH2O. Koel het af tot 4 °C.
    8. Snijd 4 stuks filterpapier en een stuk nitrocellulosemembraan. Week het papierfilter en het membraan in een lade met transferbuffer.
    9. Verwijder de gel voorzichtig uit de behuizing en monteer deze in het transferapparaat met filterpapier, membraan en sponzen. De gel wordt aan de negatieve kant en het membraan aan de positieve kant geplaatst.
    10. Loop transfer op 300 mA, roeren, bij 4 °C, 's nachts.
    11. Blokkeer het membraan in 10 ml blokkerende buffer gedurende 1 uur met zachte agitatie, bij kamertemperatuur.
    12. Bereid primaire antilichaamoplossing voor met 10 ml blokkerende buffer en 50 μL dystrofineantilichaam (1:200).
    13. Gooi de blokkeringsbuffer weg en voeg de primaire antilichaamoplossing toe. Incubeer met zachte agitatie gedurende ten minste 2 uur bij kamertemperatuur of 's nachts bij 4 °C.
    14. Spoel het membraan drie keer met 0,1% Tween PBS, gedurende 5 minuten met zachte agitatie.
    15. Bereid secundaire antilichaamoplossing met behulp van 10 ml blokkeringsoplossing, 2 μL antilichaam tegen konijnen (1:5000) en 20 μL van 0,2% Tween.
    16. Voeg de secundaire antilichaamoplossing toe aan het membraan. Incubeer gedurende 1 uur met zachte agitatie, bedekt met aluminiumfolie om te beschermen tegen licht.
    17. Gooi de antilichaamoplossing weg en spoel het membraan 3 keer af met 0,1% Tween PBS, gedurende 5 minuten met zachte agitatie, beschermd tegen licht.
    18. Belichting en beeld van het membraan op een beeldapparaat.
    19. Beits het membraan voor totaal eiwit met Revert 700 Total Protein-vlek, volgens de instructies van de fabrikant.
      OPMERKING: Dystrofinedetectie door western blotting hangt af van de leeftijd/mutatie van de patiënt en het vermogen van de cel om te fuseren en voldoende tijd te houden om voldoende dystrofine op te hopen.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Resultaten

Dit protocol laat zien hoe je menselijke huid-afgeleide fibroblastculturen vaststellen en omzetten in myoblasten en vervolgens in gedifferentieerde myotubes. Dit type cellijn is uiterst nuttig voor de studie van neuromusculaire aandoeningen en in vitro testen van potentiële therapieën.

Een schematische weergave van de fibroblastconversie wordt weergegeven in figuur 1. Figuur 2A toont een stukje huid en de fibroblasten die eru...

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Discussie

Om FM-cellijnen van goede kwaliteit te verkrijgen, zijn sommige stappen van cruciaal belang. Hoe eerder de huidbiopsie wordt verwerkt, hoe groter de kans op het verkrijgen van gezonde fibroblasten. Het passageaantal fibroblastenculturen is ook belangrijk. Primaire cellen hebben een beperkte proliferatieve capaciteit en na vele passages komen ze binnen in replicatieve senescentie. Het is dus beter om een voorraad fibroblasten te hebben met een laag passagenummer en cellen zo snel mogelijk te transformeren.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Openbaarmakingen

Nationwide Children's Hospital heeft het exon 2 skipping programma dat hierin wordt beschreven in licentie gegeven aan Audentes Therapeutics. K.M.F. en N.W. hebben royaltybetalingen ontvangen als gevolg van deze licentie.

Dankbetuigingen

We willen Dr. Vincent Mouly bedanken voor het delen van zijn kennis in het verleden over het model. Dit werk is ondersteund door het Us National Institutes of Health National Institute of Neurological Disorders and Stroke (R01 NS043264 (K.M.F., en R.B.W.)), de Us National Institutes of Health National Institute of Arthritis and Musculoskeletal and Skin Diseases (NIAMS) (P50 AR070604-01 (K.M.F., K.M., R.N., en N.W.). N.W. heeft fellowship-steun ontvangen van de Ohio State University /Nationwide Children's Hospital Muscle Group en de Philippe Foundation. Dit werk werd ook ondersteund door interne discretionaire fondsen en een deel van het exon 2 overslaande werk werd ook ondersteund door CureDuchenne (K.M.F.) en Association Francaise Contre Les Myopathies. IRB-nummer: IRB #: IRB10-00358/ CR00005138 en IBCSC#: IBS00000123.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel
NaamBedrijfCatalogusnummerOpmerkingen
100 mm schaalCorning430167
0,25% Trypsin-EDTA, fenol roodThermo Fisher2500056
10X fosfaat gebufferde zoutoplossing (PBS)Fisher ScientificBP3994
12-wells plaatCorning3513
20X Transfer bufferThermo FisherNP00061
20X Tris-acetaat SDS lopende bufferThermo FisherLA0041
3-8% Tris-Acetaat gelThermo FisherEA0378BOX
75 cm2 flaconCorning430641U
Antibioticum-Antimicotic 100XThermo Fisher15240062
Anti-myosine zware ketting, sarcomeer antilichaamDevelopmental Studies Hybridome BankMF20 supernatantVerdunning 1:50
AntioxidantThermo FisherNP0005
BCA Eiwit AssayThermo Fisher23227
ChloroformSigma-AldrichC2432
DAPIThermo FisherD3571Verdunning 1:1000
DigitoninMillipore Sigma300410250MG
Dimethyl sulfoxideSigma-AldrichD2438
DMEM, Hoge glucose, GlutaMAX supplement, PyruvaatThermo Fisher10569044
DNAse I set (250U)Zymo Research CorporationE1010
Doxycycline HydrochlorideFisher ScientificBP2653-5
Dup2 menselijke primersFw_5' GCTGCTGAAGTTTGTTGG
TTTCTC 3'		Rv_5' CTTTTGGCAGTTTTTGCC
CTGT 3'
Dystrophin antilichaamAbcamab15277Verdunning 1:200
Fetaal bovien serumThermo Fisher16000
GlycineSigma-AldrichG8898
Geit anti-muis, Alexa Fluor 488Thermo FisherA11001Verdunning 1:1000
Halt Protease inhibitor cocktail 100XThermo Fisher78430
HemocytometerHausser Scientific3100
Hygromycin BThermo Fisher10687010
IRDye 680RD geit anti-Konijn IgG (H+L)Li-Cor926-68071Verdunning 1:5000
Lab-Tek II CC2 kamer plaat systeemThermo Fisher15852
LaemmliBioworld105700201
Lipofectamine 3000 Transfectie ReagensThermo FisherL3000008
Matrigel GFR membraan matrixCorning354230
MethanolFisher ScientificA412P-4
Mr. Frosty Bevries ContainerThermo Fisher51000001
Nitrocellulose membraan 0,45 µmGE Healthcare Life Sciences10600002
Normal Goat serum controlThermo Fisher10000C
Odyssey Blocking Buffer (PBS)Li-Cor927-40003Blocking buffer voor Western blot
Opti-MEM I Gereduceerd Serum MediumThermo Fisher11058021
ParaformaldehydeSigma-Aldrich158127
PCR master mixThermo FisherK0172
Fosfatase inhibitorThermo FisherA32957
Precision Plus Protein Dual Color StandaardsBio Rad1610374
PuromycinThermo FisherA1113803
Revert 700 Totaal Eiwit Stain voor Western Blot NormalisatieLi-Cor926-11021
RevertAid kitThermo FisherK1691
RNA Clean & Concentrator-25Zymo Research CorporationR1018
ScalpelsAspen Surgical372611
Skeletal Muscle Cell Differentiatie mediumPromocellC23061
Skeletal Muscle Cell Groei mediumPromocellC23060
Triton X-100Acros Organics215682500
TRIzol reagensThermo Fisher15596026
Tween 20Fisher ScientificBP337500
Ultra lage temperatuur vriezerThermo Scientific7402
UltraPure 0,5M EDTA, pH 8,0Thermo Fisher15575020
Vectashield antifade bevestigingsmediumVector LabsH1000

Referenties

  1. Bigot, A., et al. Replicative aging down-regulates the myogenic regulatory factors in human myoblasts. Biology of the Cell. 100 (3), 189-199 (2008).
  2. Mamchaoui, K., et al. Immortalized pathological human myoblasts: Towards a universal tool for the study of neuromuscular disorders. Skeletal Muscle. 1 (34), (2011).
  3. Pantic, B., et al. Reliable and versatile immortal muscle cell models from healthy and myotonic dystrophy type 1 primary human myoblasts. Experimental Cell Research. 342 (1), 39-51 (2016).
  4. Thorley, M., et al. Skeletal muscle characteristics are preserved in hTERT/cdk4 human myogenic cell lines. Skeletal Muscle. 6 (1), 43(2016).
  5. Chaouch, S., et al. Immortalized skin fibroblasts expressing conditional MyoD as a renewable and reliable source of converted human muscle cells to assess therapeutic strategies for muscular dystrophies: Validation of an exon-skipping approach to restore dystrophin in duchen. Human Gene Therapy. 20 (7), 784-790 (2009).
  6. Zarei, A., Razban, V., Hosseini, S. E., Tabei, S. M. B. Creating cell and animal models of human disease by genome editing using CRISPR/Cas9. The Journal of Gene Medicine. 21 (4), 3082(2019).
  7. Echevarría, L., Aupy, P., Goyenvalle, A. Exon-skipping advances for Duchenne muscular dystrophy. Human molecular genetics. 27 (2), 163-172 (2018).
  8. Hwang, J., Yokota, T. Recent advancements in exon-skipping therapies using antisense oligonucleotides and genome editing for the treatment of various muscular dystrophies. Expert reviews in molecular medicine. 21, 5(2019).
  9. Wein, N., et al. Efficient Skipping of Single Exon Duplications in DMD Patient-Derived Cell Lines Using an Antisense Oligonucleotide Approach. Journal of Neuromuscular Diseases. 4 (3), 199-207 (2017).
  10. De Angelis, F. G., et al. Chimeric snRNA molecules carrying antisense sequences against the splice junctions of exon 51 of the dystrophin pre-mRNA induce exon skipping and restoration of a dystrophin synthesis in Δ48-50 DMD cells. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 99 (14), 9456-9461 (2002).
  11. Gorman, L., Suter, D., Emerick, V., Schümperli, D., Kole, R. Stable alteration of pre-mRNA splicing patterns by modified U7 small nuclear RNAs. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 95 (9), 4929-4934 (1998).
  12. Wein, N., et al. Translation from a DMD exon 5 IRES results in a functional dystrophin isoform that attenuates dystrophinopathy in humans and mice. Nature Medicine. 20 (9), 992-1000 (2014).
  13. Auré, K., Mamchaoui, K., Frachon, P., Butler-Browne, G. S., Lombès, A., Mouly, V. Impact on oxidative phosphorylation of immortalization with the telomerase gene. Neuromuscular Disorders. 17 (5), 368-375 (2007).
  14. Barde, I., et al. Efficient control of gene expression in the hematopoietic system using a single Tet-on inducible lentiviral vector. Molecular Therapy. 13 (2), 382-390 (2006).
  15. Wang, X., McManus, M. Lentivirus production. Journal of Visualized Experiments. (32), e1499(2009).
  16. Amack, J. D., Mahadevan, M. S. Myogenic defects in myotonic dystrophy. Developmental Biology. 265 (2), 294-301 (2004).

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Herprints en machtigingen

Trefwoorden

Fibroblast reprogrammeringMyoblast differentiatieLentivirale transductiehTERT immortalisatieMYOD inductieDoxycycline behandelingMyotubusvormingHuidbiopsie
Directe herprogrammering van menselijke fibroblasten in myoblasten om therapieën voor neuromusculaire aandoeningen te onderzoeken
Neem contact met ons op
Aanbevelen aan bibliotheek

Privacy

Gebruiksvoorwaarden

Beleid

Copyright © 2026 MyJoVE Corporation. Alle rechten voorbehouden.