Gebruik van Grafix voor de detectie van transiënte interactoren van Saccharomyces cerevisiae Spliceosome Subcomplexen

Samenvatting

Hier beschrijven we het gebruik van Grafix (Gradient Fixation), een glycerol gradiënt centrifugatie in de aanwezigheid van een crosslinker, om interacties te identificeren tussen splicingfactoren die tijdelijk binden aan het spliceosoomcomplex.

Samenvatting

Pre-mRNA splicing is een zeer dynamisch proces dat veel moleculaire herschikkingen van de spliceosoomsubcomplexen omvat tijdens assemblage, RNA-verwerking en afgifte van de complexe componenten. Glycerol gradiënt centrifugatie is gebruikt voor de scheiding van eiwit of RNP (RiboNucleoProtein) complexen voor functionele en structurele studies. Hier beschrijven we het gebruik van Grafix (Gradient Fixation), dat voor het eerst werd ontwikkeld om macromoleculaire complexen te zuiveren en te stabiliseren voor cryo-elektronenmicroscopie met één deeltje, om interacties te identificeren tussen splicingfactoren die tijdelijk binden aan het spliceosoomcomplex. Deze methode is gebaseerd op het centrifugeren van monsters in een toenemende concentratie van een fixatiereagens om complexen te stabiliseren. Na centrifugering van gisttotaalextracten geladen op glycerolgradiënten, worden teruggewonnen fracties geanalyseerd door dot blot voor de identificatie van de spliceosoomsubcomplexen en bepaling van de aanwezigheid van individuele splicingfactoren.

Inleiding

Splicing is een zeer dynamisch proces dat vereist dat een veelheid aan factoren op een gecoördineerde manier wordt gebonden en vrijgegeven. Deze splicingfactoren omvatten RNA-bindende eiwitten, ATPasen, helicases, eiwitkinasen en fosfatasen, ubiquitine-ligases, onder andere^1,2,3; en om de moleculaire herschikkingen mogelijk te maken, binden sommige van deze factoren zeer tijdelijk aan de spliceosoomsubcomplexen, waardoor de isolatie en identificatie van deze RNP-intermediaire complexen zeer uitdagend is.

Hier gebruikten we de Grafix-methode^4,5 om de interactie van de gistsplitsingsfactor Cwc24 met het^{B-actcomplex 6} te stabiliseren om de identificatie van andere factoren die gelijktijdig aan dat subcomplex gebonden zijn mogelijk te maken en te bepalen of het ubiquitineligase Prp19 een rol speelt bij de binding of afgifte van Cwc24 aan het Nineteen (NTC) -complex en aan het 5'-uiteinde van het intron voordat activering en de eerste transesterificatiereactie plaatsvindt plaats. Het voordeel van het blootstellen van de macromoleculen aan een toenemende concentratie van de crosslinker langs de glycerolgradiënt is dat het inter-complexen crosslinks^4,5en dus de vorming van aggregaten vermijdt.

Deze methode werd gebruikt als aanvulling op eiwitcoimmunoprecipitatie en pull-down assays, die, ondanks het feit dat ze de isolatie van grote complexen mogelijk maken, mogelijk niet betrouwbaar zijn voor het handhaven van voorbijgaande interacties binnen grote dynamische complexen^7,8. Het gebruik van fixatiereagentia in de glycerolgradiënt stabiliseert de binding van dergelijke factoren, waardoor de bevestiging van interacties van specifieke eiwitten met splicing subcomplexen mogelijk is. Omdat de gekozen crosslinker chemisch onomkeerbaar was, werden eiwitten die aanwezig waren in de teruggewonnen fracties geanalyseerd door dot blot na de gradiëntcentrifugatie.

Protocol

1. Gist totaalextractpreparaat

1. Kweek de gistcellen die een van de splicingfactoren tot expressie brengen die zijn gefuseerd met het TAP-label⁹ in 1 L YNB-glu media (Giststikstofbasis aangevuld met 2% m / v glucose) met de juiste aminozuren of nucleïnebasen, in dit geval adenine (20 μg / ml), leucine (30 μg / ml), tryptofaan (30 μg / ml), tot OD₆₀₀ = 1,0.
2. Verzamel de cellen uit de 1 L-cultuur door ze in drie centrifugeflessen van 500 ml te centrifugeren bij 17.000 x g gedurende 10 minuten bij 4 °C en was tweemaal met koud steriel water van 10 ml.
3. Resuspend de verzamelde gistcellen in 1/10 van het celvolume van koude buffer A (10 mmol L^-1 HEPES pH = 7,9, 1,5 mmol L^-1 MgCl₂, 50 mmol L^-1 KCl, 5% v/v glycerol, 0,5 mmol L^-1 DTT, EDTA-vrije proteaseremmer Cocktail).
4. Vries kleine druppels celsuspensie in vloeibare stikstof. De kleine druppels kunnen worden verkregen door de geresuspendeerde celoplossing te pipetteren en 50 μL rechtstreeks in vloeibare stikstof te laten vallen.
   LET OP: Vloeibare stikstof kan verwondingen veroorzaken bij contact met de huid of ogen. Hanteer met behulp van geschikte veiligheidsuitrusting.
   OPMERKING: Het protocol kan hier worden gepauzeerd. De bevroren druppels celsuspensie kunnen worden bewaard bij -80 °C.
5. Bereid gistcellen lysaten door gedurende 3 minuten in een Ball Mill-apparaat gedurende zes cycli bij 20 Hz / s te malen.
   OPMERKING: Dompel na elke cyclus de container met de bevroren cellen onder in vloeibare stikstof om smelten te voorkomen. Het protocol kan hier worden gepauzeerd. De bevroren extracten kunnen bewaard worden bij -80 °C. Gist splicing extracten kunnen ook worden bereid met behulp van homogenisatoren om sferoplasten¹⁰te lyseren, of met behulp van mortel en stamper^11,12.
6. Smelt het extract door de buisjes met ze in water op kamertemperatuur te leggen en af en toe te schudden.
7. Centrifuge-extracten bij 45.000 x g gedurende 1 uur bij 4 °C.
8. Kwantificeer het eiwitgehalte van het geklaarde supernatant volgens de BCA-methode¹³.
9. Bereid aliquots van de extracten, vries ze snel in vloeibare stikstof en bewaar ze bij -80 °C.
   OPMERKING: Het protocol kan hier worden gepauzeerd.

2. Glycerol gradiënt voorbereiding

1. Bereid twee glyceroloplossingen in buffer A, één met 10% v/v en één met 30% v/v glycerol.
2. Voeg het crosslinkingmiddel glutaaraldehyde toe aan 0,1% v/v in de 30% v/v glyceroloplossing en meng om te homogeniseren.
   LET OP: Behandel glutaaraldehyde in de zuurkast met behulp van de juiste veiligheidsuitrusting.
3. Voeg 6 ml van de koude 10% v/v glyceroloplossing toe aan de onderkant van de centrifugebuis van 12 ml (14 x 89 mm).
4. Voeg 6 ml van de koude 30% v/v glyceroloplossing aangevuld met glutaaraldehyde toe met een spuit bevestigd aan een lange naald die is geleverd met het Gradient Master-apparaat aan de onderkant van de buis, net onder de 10% v/v glyceroloplossing.
   OPMERKING: Als alternatief kan de 10% v/v glyceroloplossing zorgvuldig worden gepipeerd op de bovenkant van de 30% v/v glycerol/glutaaraldehyde-oplossing.
5. Gebruik het Gradient Master-apparaat om een continu dichtheidsgradiënt te genereren.
   OPMERKING: In het Gradient Master-apparaat worden de buizen in een geschikt rack geplaatst en kort gedraaid, volgens de aanbevelingen van de fabrikant voor het bepalen van de parameters (tijd / hoek / snelheid). In dit werk gebruikten we: 2:25 min/81,5°/11 rpm.
6. Voeg voorzichtig 200 μL van een 7% v/v glycerol/buffer A kussen toe aan de bovenkant vlak voor de toevoeging van de celextracten.
   OPMERKING: De glycerolconcentratie van het kussen moet lager zijn dan de minder geconcentreerde glyceroloplossing die wordt gebruikt om de lineaire gradiënt te creëren.

3. Extracten centrifugatie

1. Laad ongeveer 2 mg totaal eiwit op de bovenkant van elke 12 ml lineaire glycerolgradiënt 10% -30% glutaaraldehyde met kussen.
2. Plaats de buizen in een voorgekoelde zwenkbakrotor.
   OPMERKING: Behandel de buizen voorzichtig om mengen vóór ultracentrifugatie te voorkomen.
3. Centrifugeer bij 194.000 x g gedurende 16 uur bij 4 °C.
4. Aliquot elke buis van 12 ml in vierentwintig fracties van 500 μL met behulp van een aangepast EconoSysteem of door zorgvuldig pipetteren.
   OPMERKING: Een aangepast EconoSysteem bestaat uit een peristaltische pomp, de UV-detector en de fractiecollector die is aangesloten op de buisperforeerinrichting. Het sedimentatieprofiel kan worden gemonitord door de absorptie bij 280 nm te meten.
5. Gebruik een 40% v/v glyceroloplossing door de peristaltische pomp om de glycerol 10%-30% gradiënt van de buis naar de fractiecollector te duwen.
   OPMERKING: Het protocol kan hier worden gepauzeerd. Bewaar de fracties bij -80 °C tot gebruik.
6. Laad 50 μL van elke fractie rechtstreeks op nitrocellulosemembranen op een dot blot of slot blot-apparaat. Detecteer eiwit door immunoblot met behulp van antilichaam tegen CBP (1:6.000, om het CBP-gedeelte van de TAP-tag te detecteren) en anti-konijn IgG geconjugeerd met Mierikswortelperoxidase (1:15.000) als secundair antilichaam.

Resultaten

Om het sedimentatieprofiel van Cwc24-TAP te analyseren en te bepalen of de Grafix-methode effectief was om de binding aan splicing-subcomplexen te stabiliseren, scheidden we totale gistextracten van cellen die Cwc24-TAP tot expressie brengen door middel van centrifugering op glycerolgradiënten, in de aan- of afwezigheid van glutaaraldehyde als een crosslinking agent. Monsters van vierentwintig 500 μL-fracties werden vervolgens geanalyseerd door slotvlek met antilichaam tegen het CBP-gedeelte van de TAP-tag. De resultaten...

Discussie

Eiwit-eiwit en ribonucleïnezuur-eiwit interacties kunnen worden gestabiliseerd met behulp van crosslinking middelen. Het is belangrijk dat het resulterende complex stabiel is om ultracentrifugatie op glycerolgradiënt te weerstaan. Bovendien moeten de buffervoorwaarden de interactie mogelijk maken, maar streng genoeg zijn om niet-specifieke binding te voorkomen. In de hier getoonde experimenten gebruikten we een bufferoplossing die al was vastgesteld voor in vitro splicingreacties¹⁵.

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel

Naam	Bedrijf	Catalogusnummer	Opmerkingen
Anti-Calmodulin Binding Protein Epitope	Millipore	07-482
ECL anti-Rabbit IgG	GE Healthcare	NA934
EconoSystem	Bio-Rad	1-800-424-6723	Onderdelen van de EconoSystem die zijn gebruikt: peristaltische pomp, de UV-detector en de fractiecollector
EDTA-vrije Protease Inhibitor Cocktail	Roche	11873580001
Fractieherstelsysteem	Beckman Coulter	270-331580	Buisdoorboorapparaat dat was verbonden met de onderdelen van de EconoSystem
Gradient Master Model 107ip	Biocomp	107-201M
Mixer Mill MM 200	Retsch	207460001	Balmolenapparaat
Rotor F12-6x500Lex	Thermo Scientific	096-062375
Sorvall RC 6 Plus Centrifuge	Thermo Scientific	36-101-0816
Swinging Bucket Rotor P40ST	Hitachi
Ultracentrifuge CP 80 NX	Hitachi	901069
Ultra-Clear Centrifuge Tubes (14 x 89 mm)	Beckman Coulter	344059