Toepassing van muis parthenogenetische haploïde embryonale stamcellen als een substituut van sperma

Samenvatting

Dit artikel is bedoeld om het gebruik van parthenogenetische haploïde embryonale stamcellen aan te tonen als vervanging voor sperma voor de bouw van semi-gekloonde embryo's.

Samenvatting

In organismen met seksuele voortplanting zijn kiemcellen de bron van totipotente cellen die zich ontwikkelen tot nieuwe individuen. Bij muizen creëert de bevruchting van een oöcyt door een spermatozoon een totipotente zygote. Onlangs hebben verschillende publicaties gemeld dat haploïde embryonale stamcellen (hemoc's) een substituut kunnen zijn voor gametische genomen en kunnen bijdragen aan embryo's, die zich ontwikkelen tot muizen. Hier presenteren we een protocol om parthenogenetische hemoc's toe te passen als vervanging van sperma om embryo's te construeren door intracytoplasmatische injectie in oöcyten. Dit protocol bestaat uit stappen voor het voorbereiden van hemAC's als spermavervanging, voor injectie van hemC-chromosomen in oöcyten en voor de kweek van semi-gekloonde embryo's. De embryo's kunnen vruchtbare semi-gekloonde muizen opleveren na embryotransfer. Het gebruik van hemac's als spermavervanging vergemakkelijkt genoombewerking in de kiembaan, studies van embryonale ontwikkeling en onderzoek naar genomische imprinting.

Inleiding

Bij zoogdieren zijn gameten de enige cellen die genetische informatie doorgeven aan de volgende generatie. Fusie van een oöcyt en een spermatozoon vormt een diploïde zygote die zich ontwikkelt tot een volwassen dier. Mutaties in gametische genomen worden daardoor geërfd door de nakomelingen en stimuleren genetische variatie in soort¹. De introductie van mutaties in de kiembaan is toegepast om genetisch gemodificeerde dieren te produceren voor diverse biologische studies, waaronder de karakterisering van genfunctie en ziektemodellering. Zowel oöcyten als spermatozoa zijn terminaal gedifferentieerde en zeer gespecialiseerde cellen die de proliferatie hebben gestaakt. Daarom is directe modificatie van gameten technisch moeilijk en zijn gespecialiseerde benaderingen ontwikkeld. Genetische modificaties kunnen in de kiembaan van de muis worden geïntroduceerd door de injectie van genetisch gemodificeerde ESCs in blastocysten, waar ze integreren in het zich ontwikkelende embryo en de kiembaan koloniseren. Bovendien is genetische modificatie van zygotes met behulp van genoombewerkingsbenaderingen, waaronder het CRISPR / Cas9-systeem, op grote schaal overgenomen².

Onlangs is een uitstekende aanpak gerapporteerd, die hemAT 's toepast als vervanging voor een gametisch genoom^3,4,5,6,7,8. Hemocysten zijn stamcellijnen afgeleid van de binnenste celmassa van parthenogenetische of androgenetische haploïde blastocysten en bezitten een enkele set chromosomen^4,7,9,10. Het is aangetoond dat zowel parthenogenetische als androgenetische hemacs kunnen bijdragen aan het genoom van semi-gekloonde muizen na intracytoplasmatische injectie in oöcyten. In tegenstelling tot andere benaderingen kunnen de genomen van hemoc's direct in cultuur worden gewijzigd vanwege hun zelfvernieuwingsvermogen. Het introduceren van genetische modificaties in de kiembaan door sperma te vervangen door hemic's is een belangrijke methode voor biologische studies. Het voorziet in de mogelijkheid om het maternale of vaderlijke genoom, dat is afgeleid van respectievelijk parthenogenetische of androgenetische hemacs, afzonderlijk te culteren en te manipuleren. HemA's kunnen vervolgens worden gebruikt als gametische genoomvervanging, wat vooral voordelig is voor studies van genomische inprenting, allelspecifieke expressie en ouderlijke specifieke processen.

Bij muizen is zowel maternale als vaderlijke genomische informatie vereist voor de normale embryoontwikkeling¹¹. Daarom konden voldragen pups niet worden verkregen wanneer wild-type parthenogenetische hemk's (phaESC's) werden geïnjecteerd ter vervanging van het spermagenoom^5,8. Om het ontwikkelingsblok te overwinnen, moet genomische inprenting van het maternale genoom van parthenogenetische hemac's worden gecorrigeerd tot een vaderlijke configuratie. Dit kan worden bereikt door manipulatie van de differentieel gemethyleerde regio's (DMR's). Tot op heden zijn gerichte deleties van de H19-DMR, Gtl2-Dlk1 IG-DMR en Rasgrf1-DMR bestudeerd om maternale genen in phaESC's^3,5,^8,12te onderdrukken . Deze studies toonden aan dat deleties van zowel de H19-DMR als de IG-DMR voldoende zijn om een moeder om te zetten in een vaderlijke afdrukconfiguratie die spermachromosomen kan vervangen. Intracytoplasmatische injectie van phaESC's die de twee DMR-deleties in oöcyten vervoeren, leverde semi-gekloonde pups op met een frequentie tussen 5,1% en 15,5% van de overgedragen 2-cel embryo's.

Dit protocol is gebaseerd op de toepassing van phaESC's met schrappingen van zowel H19-DMR als IG-DMR, die we double-knockout phaESCs (DKO-phaESCs) genoemden. We geven gedetailleerde instructies voor de wijziging van genomische imprinting in phaESC's om DKO-phaESC-lijnen vast te stellen, voor de injectie van DKO-phaESC's in oöcyten als vervanging voor een spermagenoom, voor de kweek van semi-gekloonde embryo's tot blastocysten en voor het verkrijgen van semi-gekloonde muizen. Dit protocol is een referentie voor onderzoekers die nauwkeurige en directe manipulatie van het vaderlijke genoom en de generatie van semi-gekloonde embryo's en muizen vereisen.

Protocol

Alle dierproeven werden uitgevoerd onder de licentie ZH152/17 in overeenstemming met de normen en voorschriften van de Cantonal Ethics Commission Zurich en de EPIC animal facility van het Institute of Molecular Health Sciences, ETH Zurich.

OPMERKING: Dit protocol begint met het verwijderen van de H19- en IG-DMR's in phaESC's. Voor meer informatie over het vaststellen van phaESC-lijnen verwijzen wij u naar gepubliceerde rapporten^10,13. Een overzicht en tijdschema van dit protocol (stap 1-14) is opgenomen in figuur 1A; media, oplossingen en buffers worden vermeld in tabel 1. De procedure voor het vaststellen van DKO-phaESC-lijnen (stappen 1–6) is weergegeven in figuur 1B, en de strategie voor de bouw van semi-gekloonde embryo 's (stappen 7-14) is weergegeven in figuur 1C.

1. Transfectie van plasmiden voor deletie van H19-DMR en IG-DMRin phaESC's

1. Bereid CRISPR/Cas9 plasmiden voor op co-expressie van Cas9 nucleases en begeleid RNA's om verwijderingen van H19-DMR en IG-DMRte targeten. Ligate vier paar geleide RNA oligo's (H19-DMR-gRNA1-F, R; H19-DMR-gRNA2-F, R; IG-DMR-gRNA1-F, R; IG-DMR-gRNA2-F, R vermeld in tabel 2) in pX330 plasmiden.
   OPMERKING: Raadpleeg het gepubliceerde protocol over de gedetailleerde procedure voor de bereiding van deze 4 CRISPR/Cas9 plasmiden¹⁴. Als alternatief zijn plasmiden die beschikbaar zijn voor algemene muizenstammen ook toegankelijk via een repository (Table of Materials).
2. Bedek het oppervlak van een put van een 6-putplaat met 1 ml gelatineoplossing van 0,2% door incubatie bij 37 °C gedurende 10 minuten.
3. Plaat 2 × 10⁵ wildtype phaESC's op de met gelatine bedekte put in hemC-medium zonder antibiotica, en incubeer de plaat bij 37 °C in een CO_2-atmosfeer van 5% gedurende 1 dag.
   OPMERKING: Antibiotica worden weggelaten uit het medium om de efficiëntie van de daaropvolgende lipofectie te verhogen. We gebruikten wildtype phaESCs bij passage 10. We raden aan om phaESC's met vroege passage te gebruiken, maar een verscheidenheid aan passagenummer is met succes gebruikt⁸. De correlatie tussen passagenummer en efficiëntie van het verkrijgen van semi-gekloonde embryo's en muizen is momenteel niet bekend.
4. Transfecte phaESCs in de put van een 6-put plaat (vanaf stap 1.3) met 6 plasmiden tegelijkertijd met behulp van lipofectie reagens: 50 ng piggyBac plasmide met een CAG-EGFP transgene, 50 ng piggyBac transposase plasmide en 600 ng van elk van de 4 CRISPR/Cas9 plasmiden (vanaf stap 1.1). Raadpleeg het protocol van de fabrikant over de gedetailleerde procedure van de transfectie.
   OPMERKING: Twee piggyBac plasmiden worden gebruikt om een transposon voor alomtegenwoordige expressie van verbeterde groene fluorescerende eiwitten (EGFP) te integreren in het genoom van phaESC's. Als GFP-markering van de cellen niet nodig is, kunnen deze twee plasmiden worden vervangen door een CRISPR/Cas9 plasmide voor voorbijgaande expressie van fluorescentie-eiwitten (bijv. pX458 plasmide) in plaats van een van de pX330 plasmiden. Tijdelijke EGFP-expressie kan vervolgens worden gebruikt voor het sorteren van getransfecteerde cellen.
5. Twee dagen na de transfectie, aspireer het medium en voeg 800 μL trypsine toe.
6. Incubeer de plaat bij 37 °C in een CO_2-atmosfeer van 5% gedurende 5 minuten. Voeg vervolgens 2 ml wasbuffer toe om de trypsine te doven en pipet meerdere keren om een suspensie met één cel te verkrijgen.
7. Breng de celsuspensie over in een buis van 15 ml.
8. Centrifugeer de buis gedurende 5 minuten op 160 x g en verwijder het supernatant.
9. Resuspendeer de celkorrel in 400 μL haESC onderhoudsbuffer aangevuld met 15 μg/ml Hoechst 33342.
   OPMERKING: Om de potentiële toxiciteit van Hoechst 33342 te verminderen, zijn 1 μg/ml Hoechst 33342 en 50 μM verapamil gebruikt in plaats van 15 μg/ml Hoechst 33342¹⁵.
10. Incubeer de celsuspensie bij 37 °C in een CO_2-atmosfeer van 5% gedurende 15 minuten. Breng na de incubatie de celsuspensie over in een buis van 5 ml via een celzeefdop en houd de buis op 4 °C totdat deze klaar is voor gebruik in de volgende stap (punt 2).

2. Eencellige plating van getransfecteerde phaESC's met behulp van een flowcytometer

1. Een dag voor het sorteren van de getransfecteerde phaESC's, bestraalde plaat muis embryonale fibroblasten (MEF's) op gelatine gecoate 96-put platen met een dichtheid van 4 × 10⁴ cellen/cm² in MEF medium. Meestal zijn 6 platen bereid om een phaESC-lijn op te zetten met gerichte verwijderingen. Incubeer de platen bij 37 °C in een CO_2-atmosfeer van 5%.
   OPMERKING: Bestraalde MEF's zijn in de handel verkrijgbaar. We gebruiken MEF's afgeleid van E12.5 embryo's van DR4 muizen. Hoewel haESC's kunnen groeien op met gelatine bedekte platen zonder MEF's, raden we MEF's aan om de levensvatbaarheid van gesorteerde enkelvoudige hemK's te vergroten.
2. Aspireer op de dag van sortering het MEF-medium uit de 96-putplaten en voeg 120 μL vers haESC-medium per put toe. Houd de platen op 37 °C in een CO_2-atmosfeer van 5%.
3. Stel een celsorteerder in met een mondstuk van 100 μm volgens de instructies van de fabrikant. Een 355 nm UV-laser en een 488 nm blauwe laser worden gebruikt voor excitatie van respectievelijk Hoechst 33342 en EGFP fluorescentie.
   OPMERKING: Als alternatief kan Hoechst 33342 worden gedetecteerd door excitatie met 405 nm.
4. Sorteer de getransfecteerde phaESC's in de 5 ml buis (vanaf stap 1.10) met behulp van een poort voor het verzamelen van haploïde cellen in de G1/S-fase die egfp-expressie tonen. Deponeer een enkele cel in elke put van de 96-putplaten uit stap 2.2.
   OPMERKING: Detectie van Hoechst 33342-kleuring onderscheidt over het algemeen 3 pieken van cellen met een DNA-gehalte van 1n, 2n en 4n, die overeenkomen met haploïde cellen in G1-fase, een mengsel van haploïde cellen in G2/M-fase en diploïde cellen in G1-fase, en diploïde cellen in G2/M-fase, respectievelijk. Haploïde cellen in de G1/S-fase worden geïdentificeerd als de piek met een lagere intensiteit van Hoechst 33342 fluorescentie. Figuur 2Aheeft een representatief resultaat en een sorteerpoort .
5. Na het plateren, incubeer de 96-put platen op 37 °C in een 5% CO₂ atmosfeer.

3. Subkloon van getransfecteerde phaESC's

1. Drie dagen na eencellige plating kunnen kolonies worden waargenomen in verschillende putten van de 96-putplaten onder een microscoop. Markeer de putten waarin slechts enkele kolonies groeien.
   OPMERKING: In onze ervaring werden enkele kolonies waargenomen in 20%-40% van de putten van de 96-putplaten.
2. Vervang op dag 4 na eencellige beplating de helft van het medium door een nieuw hemC-medium in de putten door enkele kolonies.
3. Een dag voor het passeren (op dag 4 of 5 na eencellige beplating) bestraalde plaat MEF's op met gelatine bedekte 96-putplaten met een dichtheid van 4 × 10⁴ cellen/cm² in MEF-medium. Houd de platen op 37 °C in een CO_2-atmosfeer van 5%.
4. Selecteer na 5 of 6 dagen eencellige beplating putten van de 96-putplaten die enkele kolonies bevatten met een diameter groter dan 150 μm.
   OPMERKING: Bij voorkeur worden ongeveer 100 putten geselecteerd om een phaESC-lijn vast te stellen met de beoogde DMR-verwijderingen.
5. Aspireer het medium in de geselecteerde putten en voeg 30 μL trypsine toe. Incubeer de 96-putplaten bij 37 °C in een CO_2-atmosfeer van 5% gedurende 5 minuten. Voeg vervolgens 30 μL wasbuffer toe aan elke put om de trypsine te doven.
6. Voeg 140 μL hemC-medium toe aan elke put en pipetteer meerdere keren om enkele cellen te verkrijgen.
7. Aspireer het MEF-medium uit de putten van de 96-putplaten die in stap 3.3 zijn voorbereid.
8. Breng de phaESCs van elke put van stap 3.6 over in een verse put van de nieuwe 96-putplaat uit stap 3.7.
9. Incubeer de 96-putplaten met phaESC-subklonten bij 37 °C in een CO_2-atmosfeer van 5%.
10. Aspireer de volgende dag al het medium uit elke put en voeg 120 μL nieuw haESC-medium toe. Incubeer de platen bij 37 °C in een CO_2-atmosfeer van 5%.
11. Een dag voordat de cellen samenvloeien voor passaging, plaat de bestraalde MEF's op gelatine-gecoate 24-put platen met een dichtheid van 4 × 10⁴ cellen/cm² in MEF medium. Houd de platen op 37 °C in een CO_2-atmosfeer van 5%.
12. Wanneer phaESC's samenvloeien voor passaging, aspireer dan het medium en voeg 30 μL trypsine toe. Incubeer de 96-putplaten gedurende 5 minuten bij 37 °C.
13. Voeg 90 μL wasbuffer toe aan elke put om de trypsine te doven. Pipet meerdere keren om enkele cellen te verkrijgen.
14. Aspireer het MEF-medium uit de putten van de 24-putplaten vanaf stap 3.11 en voeg 600 μL vers haESC-medium toe.
15. Breng 60 μL van de suspensie van phaESC-subklonten uit elke put in stap 3.13 over in een nieuwe put van de 24-putplaten uit stap 3.14. Bewaar de resterende suspensie van elk phaESC-subklonen voor DNA-extractie en genotypering in stap 4.
16. Incubeer de 24-putplaten met de phaESC-subklonten bij 37 °C in een CO_{2-atmosfeer van} 5%.
17. Een dag voordat de celculturen de dichtheid voor passaging bereiken, plaat de bestraalde MEF's op gelatine-gecoate 6-put platen met een dichtheid van 4 × 10⁴ cellen/cm² in MEF medium. Houd de platen op 37 °C in een CO_2-atmosfeer van 5%.
18. Wanneer phaESC's samenvloeien genoeg worden om te passeren, aspireer dan het medium en voeg 250 μL trypsine toe. Incubeer de 24-putplaten gedurende 5 minuten bij 37 °C.
    OPMERKING: Na genotypering in stap 4.9 hoeven alleen phaESC-lijnen met verwijderingen van zowel de H19-DMR als de IG-DMR te worden doorgelaten.
19. Voeg 750 μL wasbuffer toe aan elke put om de trypsine te doven. Pipet meerdere keren om een enkele cel suspensie te verkrijgen. Breng de celsuspensie over in een buis van 15 ml.
20. Centrifugeer de buis gedurende 5 minuten op 160 x g, verwijder het supernatant en resuspendeer de celkorrel in 2 ml haESC-medium.
21. Aspireer het MEF-medium uit de putten van de 6-putplaten uit stap 3.17. Breng de phaESC-suspensie van elke buis van stap 3.20 over naar een nieuwe put. Houd de platen op 37 °C in een CO_2-atmosfeer van 5%.
22. Breid de celklonen uit door stap 3.17 tot en met 3.21 te herhalen en de plaatgrootte en de volumes trypsine, wasbuffer en haESC-medium te vergroten. Bereid een T25-kolf voor elke subgekloonde phaESC-lijn mef voor stap 5.
    OPMERKING: We raden aan om een aliquot van elke subgekloonde phaESC-lijn in 300 μL vriesmedium in te vriezen en een cryostock in vloeibare stikstofopslag te bewaren voordat u doorgaat naar stap 5.

4. Eerste genotypering van subgekloonde phaESC-lijnen met MEF's

1. Om genomisch DNA uit de resterende celsuspensie uit stap 3.15 te extraheren, voegt u 200 μL lysisbuffer toe aan elke put van de 96-putplaten. Breng de celsuspensie over naar een buis van 1,5 ml. Spoel elke put af met een extra 200 μL lysisbuffer om alle resterende cellen terug te winnen en verzamel in dezelfde buis van 1,5 ml.
2. Incubeer de buis van 1,5 ml bij 55 °C gedurende 3 uur met mengen.
3. Voeg na incubatie 460 μL isopropanol toe aan elke buis van 1,5 ml en meng voorzichtig totdat een DNA-neerslag zichtbaar wordt.
4. Centrifugeer de buizen op ≥ 10.000 x g gedurende 5 minuten en verwijder het supernatant. Was de DNA-pellets met 200 μL 70% ethanol.
5. Centrifugeer de buizen op ≥ 10.000 x g gedurende 5 minuten en verwijder het supernatant.
6. Droog de buisjes 10 minuten in de lucht en geef het DNA vervolgens terug in 20 μL water.
7. Voer polymerasekettingreactie (PCR) uit met behulp van thermostabiele DNA-polymerase volgens het protocol van de fabrikant.
   OPMERKING: De primerparen voor PCR zijn opgenomen in tabel 2 en worden als volgt gebruikt: H19-DMR-P1 en P3 (407 bp voor verwijderde H19-DMR); H19-DMR-P2 en P3 (623 bp voor wildtype H19-DMR); IG-DMR-P1 en P3 (319 bp voor verwijderde IG-DMR); IG-DMR-P2 en P3 (492 bp voor wildtype IG-DMR). Het temperatuurprofiel van PCR voor alle primerparen is als volgt: 30 s 98 °C, 35 x (10 s 98 °C, 20 s 56 °C, 30 s 72 °C), 5 min 72 °C. De lengte van versterkte DNA-fragmenten voor de H19-DMR-en IG-DMR-deletiesvertoont enige variatie vanwege niet-homologe eindvoeging geassocieerd met CRISPR / Cas9-gemedieerde bewerking. PhaESCs werden gekweekt met MEF's, die wildtype H19-DMR en IG-DMR DNA bevatten. Daarom zijn primerparen van H19-DMR-P2/P3 en IG-DMR-P2/P3, die wildtype DNA-fragmenten versterken, niet informatief. Deze primerparen zijn echter inbegrepen als bedieningselementen en moeten een band geven in alle reacties.
8. Analyseer de PCR fragmenten door agarose gel elektroforese. Zie het gepubliceerde protocol betreffende de gedetailleerde procedure van de elektroforese¹⁶.
9. Identificeer cellijnen met deleties van zowel H19-DMRals IG-DMR. Figuur 2Bgeeft een representatief beeld van elektroforese .
   OPMERKING: In ons geval werden acht cellijnen met verwijderingen van zowel H19-DMRals IG-DMRgeïdentificeerd onder 135 subgekloonde phaESC-lijnen.

5. Haploïde celzuivering van subgekloonde phaESC-lijnen

1. Wanneer de subgekloonde phaESC-culturen in de T25-kolven uit stap 3.22 dicht genoeg worden om te passeren, aspireer dan het medium en voeg 1,5 ml trypsine toe. Incubeer de kolf gedurende 5 minuten op 37 °C. Voeg vervolgens meerdere keren 4,5 ml wasbuffer en pipet toe om een eencellige suspensie te verkrijgen.
2. Breng elke celsuspensie over in een buis van 15 ml en centrifugeer de buis gedurende 5 minuten op 160 x g. Verwijder het supernatant en resuspend de celkorrels in 400 μL haESC-onderhoudsbuffer aangevuld met 15 μg/ml Hoechst 33342.
3. Incubeer de celsuspensingen gedurende 15 minuten bij 37 °C. Breng na de incubatie de celsuspensingen over in een buis van 5 ml via een celzeefdop. Spoel de celzeefdop af met een extra 400 μL haESC-onderhoudsbuffer en verzamel de resterende cellen in dezelfde buis van 5 ml. Houd de buis op 4 °C totdat deze klaar is om te sorteren.
4. Stel een flowcytometer in met een mondstuk van 100 μm volgens de instructies van de fabrikant.
   OPMERKING: Hoechst 33342 kan worden gedetecteerd door excitatie bij 405 nm. Hier wordt een 355 nm UV-laser gebruikt voor de detectie van Hoechst 33342.
5. Stel de celsuspensie in (vanaf stap 5.3) en een nieuwe buis van 15 ml met 2 ml haESC-onderhoudsbuffer om gesorteerde cellen in de flowcytometer te verzamelen.
6. Start de analyse en stel de sorteerpoort in om haploïde cellen te verzamelen in de G1/S-fase. Raadpleeg het histogram in figuur 2A voor het identificeren van de fase van de G1/S-fase phaESC-populatie.
   OPMERKING: Sommige subgekloonde phaESC-lijnen bevatten mogelijk geen haploïde cellen vanwege volledige diploïdisatie of foutieve plating van diploïde cellen in stap 2. Als haploïde cellen niet worden waargenomen in de G1/S-fase, gaat u verder met een ander monster zonder te sorteren. In ons geval bevatten 5 cellijnen haploïde cellen en 3 cellijnen alleen diploïde cellen van 8 subgekloonde phaESC-lijnen.
7. Voeg na het sorteren van de cellen 5 ml wasbuffer toe langs de wand van de opvangbuis van 15 ml. Centrifugeer de buis gedurende 5 minuten op 160 x g. Verwijder het supernatant.
8. Selecteer een plaat van geschikte grootte voor het cultiveren, afhankelijk van het aantal gesorteerde cellen. Gebruik een enkele put van een 96-putplaat, een 24-putplaat en een 12-putplaat om respectievelijk 1.000-40.000 cellen, 40.000-200.000 cellen en 200.000-400.000 cellen te kweekt. Resuspendeer de celkorrel in respectievelijk 120 μL, 600 μL en 1,2 ml hemC-medium.
   OPMERKING: Plaats de cellen op hoge dichtheid omdat een lage samenvloeiing na het sorteren de celdood van de cellen kan veroorzaken. Vanaf dit punt worden phaESC's gekweekt op met gelatine bedekte putten zonder MEF's om genotypering in stap 6 en de daaropvolgende toepassing voor intracytoplasmatische injectie vanaf stap 9 te vergemakkelijken.
9. Na het overbrengen van de celsuspensie in een met gelatine bedekte put van de juiste grootte, incubeer de plaat bij 37 °C in een CO_2-atmosfeer van 5%.
10. Ga door met het uitbreiden van de phaESC-culturen door stap 3.18 tot 3.21 te herhalen met toenemende plaatgroottes en toenemende hoeveelheden trypsine, wasbuffer en haESC-medium. De cellen worden gekweekt op met gelatine bedekte putten zonder MEF's.
11. Bereid voor elke subgekloonde phaESC-lijn een cultuur voor in één put van een 24-putplaat en één put van een 6-putplaat voor respectievelijk stap 6 en 9.
    OPMERKING: Sommige cellen van elke subgekloonde phaESC-lijn moeten worden ingevroren in 300 μL vriesmedium als cryostock in een opslagtank voor vloeibare stikstof voordat ze overgaan tot stap 9.

6. Tweede genotypering van subgekloonde phaESC-lijnen zonder MEF's

OPMERKING: Er wordt een tweede ronde genotypering uitgevoerd om te bevestigen dat de subgekloonde phaESC-lijnen verwijderingen van zowel de H19-als de IG-DMR's bezitten en dat wildtype allelen afwezig zijn na het verwijderen van MEF's.

1. Bevestig onder de microscoop dat de culturen in putten van de 24-putplaten uit stap 5.11 vrij zijn van MEF's.
   OPMERKING: Als MEF's worden waargenomen, is het noodzakelijk om door te gaan met het doorgeven van de culturen totdat MEF's zijn verdwenen om te voorkomen dat de PCR wordt besmet met wildtype-DNA van MEF's.
2. Aspireer het medium uit samenvloeiculturen en voeg 400 μL lysisbuffer per put van de 24-putplaat toe. Breng na meerdere pipetten de celsuspensie over naar een buis van 1,5 ml.
3. Incubeer de buis van 1,5 ml bij 55 °C gedurende 3 uur met mengen.
4. Voeg na incubatie 400 μL isopropanol toe aan de buis van 1,5 ml en meng voorzichtig totdat een DNA-neerslag zichtbaar wordt.
5. Centrifugeer de buis gedurende 5 minuten op ≥ 10.000 x g en verwijder het supernatant. Was de DNA-pellet met 200 μL 70% ethanol.
6. Centrifugeer de buis gedurende 5 minuten op ≥ 10.000 x g en verwijder het supernatant.
7. Droog de buis 10 minuten in de lucht en breng het DNA vervolgens opnieuw aan in 50 μL water.
8. Voer de genotypende PCR uit volgens stap 4.7 en gelelektroforese in stap 4.8 om cellijnen te identificeren, die verwijderingen van zowel de H19- als IG-DMR's bezitten en vrij zijn van wildtype allelen.
   OPMERKING: Een afbeelding van een typische tweede genotyperingsanalyse wordt ter referentie weergegeven in figuur 2B. In ons geval waren alle 5 cellijnen geselecteerd na haploïde celzuivering (stap 5) vrij van wildtype allelen en bezaten alleen de deletie allelen van de H19- en IG-DMRs.
9. Gebruik de subgekloonde phaESC-lijnen die na deze tweede genotypering zijn geselecteerd als DKO-phaESC-lijnen.

7. Superovulatie van muizen

1. Voor de productie van MII-oöcyten, start superovulatie door intraperitoneale injectie van 5 IE zwangere merrie serum gonadotropine (PMSG) oplossing in elke B6D2F1 vrouwelijke muis (4-5 weken oud) 63-65 uur vóór het verzamelen van oöcyt.
   OPMERKING: De B6D2F1 muisstam wordt aanbevolen voor dit protocol omdat B6D2F1-oöcytocyten intracytoplasmatische injectie goed verdragen en een hoog ontwikkelingspotentieel vertonen na de procedure¹⁷.
2. Achtenveertig uur na PMSG-injectie injecteert intraperitoneaal 5 IE humaan choriongonadotrofineoplossing in elke muis.

8. Oocyte collectie

1. Bereid een 4-well plaat met 700 μL hyaluronidase medium in één put en 700 μL M2 medium in de resterende 3 putten. Bereid bovendien een schaal van 6 cm met 7 ml M2-medium en een middenputschaal met 900 μL M16-medium. Verwarm het bord en de gerechten voor op 37 °C in een CO_2-atmosfeer van 5%.
2. Op de dag van de intracytoplasmatische injectie euthanaseren de superovulated vrouwtjes (vanaf stap 7.2) door cervicale dislocatie of CO 2-inhalatie rond 8 uur 's ochtends. Ontleed de eileiders met een pincet en een schaar. Plaats de eileiders in de schaal van 6 cm met M2 medium.
3. Laat de cumulus-oöcytcomplexen (COC's) los door de ampulla van de eileiders te scheuren met een naald van 30 G. Breng COC's over in voorverwarmd hyaluronidasemedium en houd ze op 37 °C in een CO_2-atmosfeer van 5%.
4. Verzamel na 2-3 minuten cumulusvrije oöcyten met een mondpipet en was de oöcyten 3 keer door ze over te brengen naar vers M2-medium in de andere 3 putten van de 4-putplaat.
5. Verzamel metafase II (MII) oöcyten, die de eerste polaire lichamen bezitten, in een middenputschaal met M16-medium en houd de plaat op 37 °C in een CO_2-atmosfeer van 5% tot gebruik voor intracytoplasmatische injectie in stap 12.

9. Behandeling en inzameling van DKO-phaESC's

1. Bereid een DKO-phaESC-cultuur voor in een put van een 6-putplaat zonder MEF's bij 60-80% samenvloeiing een dag voor de intracytoplasmatische injectie (vanaf stap 5.11).
2. Om celcyclusstilstand in M-fase te induceren, aspireert u het medium volledig en voegt u 2 ml hemC-medium toe dat 0,05 mg/ml demecolcine bevat.
3. Na 8 uur behandeling met demecolcine het medium aspireren en 800 μL trypsine toevoegen.
4. Incubeer de plaat bij 37 °C in een CO_2-atmosfeer van 5% gedurende 5 minuten, voeg vervolgens 2 ml wasbuffer toe om de trypsine te doven en pipet meerdere keren om een eencellige suspensie te verkrijgen.
5. Breng de celsuspensie over in een buis van 15 ml. Centrifugeer de buis gedurende 5 minuten op 160 x g en verwijder het supernatant.
6. Resuspendeer de celkorrel in 400 μL haESC-onderhoudsbuffer met 15 μg/ml Hoechst 33342.
7. Incubeer de celsuspensie bij 37 °C in een CO_2-atmosfeer van 5% gedurende 15 minuten. Breng na de incubatie de celsuspensie over in een buis van 5 ml via een celzeefdop en houd de buis op 4 °C totdat de cel in stap 10 sorteert.

10. Zuivering van M-fase-arrested DKO-phaESCs

1. Stel een flowcytometer in met een mondstuk van 100 μm volgens de instructies van de fabrikant.
   OPMERKING: Hoechst 33342 kan worden gedetecteerd door excitatie bij 405 nm. Hier wordt een 355 nm UV-laser gebruikt voor de detectie van Hoechst 33342.
2. Stel de M-fase-arrested DKO-phaESCs in vanaf stap 9.7 en start de analyse. Kies een geschikte sorteerpoort voor het verzamelen van de haploïde M-fasecellen (2n) uit het met demecolcine behandelde monster.
   OPMERKING: Na behandeling met demecolcine worden 2 celpopulaties verwacht, overeenkomend met haploïde en diploïde M-fase-gearresteerde cellen zoals weergegeven in figuur 3B. De celcyclusstilstand na de behandeling met demecolcine is voltooid, dus er wordt geen haploïde 1n DNA-piek waargenomen. Dit is belangrijk omdat de haploïde M-fase cellen en diploïde G1 cellen hetzelfde DNA-gehalte (2n) bezitten en overlappende pieken zouden produceren.
3. Stel een buis van 15 ml in met 2 ml hemC-onderhoudsbuffer om de gesorteerde cellen in de stroomcytometer te verzamelen. Begin met het sorteren van cellen.
4. Voeg na het sorteren van de cel 5 ml wasbuffer toe langs de wand van de opvangbuis. Centrifugeer de buis gedurende 5 minuten op 160 x g en verwijder het supernatant.
5. Resuspendeer de cellen in een geschikte hoeveelheid haESC-onderhoudsbuffer om een eindconcentratie van 5 x 10⁵ cellen/ml te verkrijgen.
6. Breng de celsuspensie over in een buis van 1,5 ml. Houd de buis op ijs totdat deze klaar is voor intracytoplasmatische injectie in stap 12.

11. Bereiding van holding- en micro-injectionpipetten

OPMERKING: Voor het uitvoeren van de intracytoplasmatische injectie (stap 12) zijn verschillende holding- en micro-injectiepipetten vereist (figuur 4A). Deze pipetten kunnen op maat worden gekocht bij een commerciële leverancier of gemaakt van geschikte glazen haarvaten met behulp van een micropipettrekker en een microforge.

1. Trek borosilicaat glazen haarvaten op een micropipettrekker. Voor het trekken van borosilicaatglas haarvaten zonder filament (0,78 x 1,00 x 80 mm) worden de volgende parameters gegeven voor een vlammende horizontale trekker (Tabel van materialen) als referentie, maar zullen verschillen voor andere instrumenten en glazen capillaire types: Heat 510 (Ramp test 480), Pull 0, Velocity 150, Time 175 en Pressure 200 voor het vasthouden van pipetten; Heat 510 (Ramp test 480), Pull 90, Velocity 140, Time 125 en Pressure 200 voor micro-injection pipetten.
   OPMERKING: De optimale parameters moeten afzonderlijk worden gedefinieerd, omdat verschillende factoren, waaronder vochtigheid, het model van een micropipettrekker en de partij van de glazen haarvaten de vorm van de injectiepipetten kunnen beïnvloeden. Een langwerpige vorm met een geleidelijke spits moet worden gericht op.
2. Voorbereiding van het houden van pipetten
   1. Zet een getrokken capillair voorbereid in stap 11.1 op een microforge. Plaats het capillair over de glazen kraal op de gloeidraad en laat het capillair zakken om contact te maken met de glazen kraal tijdens het verwarmen van de gloeidraad.
   2. Breek het capillair door de verwarming uit te schakelen en los te maken van de glazen kraal, zodat de buitendiameter 60-100 μm is.
   3. Plaats de capillaire punt horizontaal om de glazen kraal op de gloeidraad te zien.
   4. Verwarm de gloeidraad zodat de binnendiameter van de capillaire punt kan smelten tot een diameter van 10-20 μm.
   5. Beweeg het capillair zo dat de glazen kraal zich op een punt ~1 mm van de capillaire punt zonder contact positioneert. Verwarm de gloeidraad zodat het capillair onder een hoek van 20° kan buigen. Demonteer het capillair, een holdingpipet genoemd, van de microsmederij.
      OPMERKING: Om de grootte van het capillair te meten, wordt bij voorkeur een oculair reticle in de microforge geïnstalleerd.
3. Bereiding van micro-injection pipetten
   1. Zet een getrokken capillair voorbereid in stap 11.1 op een microforge. Plaats het capillair over de glazen kraal op de gloeidraad en laat het capillair zakken om contact te maken met de glazen kraal tijdens het verwarmen van de gloeidraad.
   2. Breek het capillair door de verwarming uit te schakelen en los te maken van de glazen kraal op een positie met een buitendiameter van 6 μm.
   3. Beweeg het capillair zo dat de glazen kraal zich op een punt ~1 mm van de capillaire punt zonder contact positioneert. Verwarm de gloeidraad zodat het capillair onder een hoek van 20° naar boven kan buigen. Demonteer de micro-injection pipet van de microforge en bewaar in een veilige doos voor later gebruik.
      OPMERKING: De micro-injectiepipetten zijn bereid met de volgende specificaties: buitendiameter, 6 μm; binnendiameter, 4,5–5 μm; buighoek, 20°. Het definiëren van het optimale ontwerp van de micro-injectiepipet is belangrijk voor het succes van de intracytoplasmatische injectie. Een te grote binnendiameter kan het scheuren van het plasmamembraan van de donor DKO-phESC's voorkomen (zie discussiesectie). Als de binnendiameter te smal is, kan dit een soepele pipetten van de donor DKO-phESC's belemmeren. Een buighoek < 30° heeft de voorkeur omdat een hoge buighoek het effect van piëzopulsen belemmert.

12. Intracytoplasmatische injectie van DKO-phaESCs

1. Bereid voorafgaand aan de intracytoplasmatische injectie (vanaf stap 12.2) een polyvinylpyrrolidone (PVP) oplossing door 5 ml M2-medium toe te voegen aan een buis van 50 ml met 0,6 g PVP en de buis gedurende 2 dagen op een rocker bij 4 °C te roeren. Nadat de PVP volledig is opgelost, wordt de oplossing steriel gefilterd en opgeslagen bij 4 °C.
2. Bereid op de dag van de intracytoplasmatische injectie een middenputschaal met 900 μL KSOM medium en verwarm de schotel voor op 37 °C in een CO_2-atmosfeer van 5%.
3. Bereid een micromanipulatieschaal door druppels van 5 μL PVP-oplossing en 20 μL M2-medium uit te lijnen op een deksel van een schaal van 10 cm die ondersteboven wordt geplaatst. Bedek de druppels met minerale olie en plaats de schaal op het podium van de injectiemicroscoop.
   OPMERKING: De aanbevolen opstelling van de micromanipulatieschaal is weergegeven in figuur 4B.
4. Installeer een houdpipet op de micromanipulator. Vul de micro-injection pipet met de fluorkoolstofolie met behulp van een microloader tip, en monteer deze op de piëzo actuator.
5. Dompel de micro-injection pipet in een druppel met PVP-oplossing en pipet meerdere keren op en neer om het glas met PVP te coaten en minder plakkerig te maken. Plaats een klein volume PVP-oplossing in de micro-injectiepipet en verplaats de pipet naar een druppel met M2-medium.
6. Dompel de holdingpipet onder in het M2-medium en concentreer je op de pipet aan de onderkant van de druppel.
7. Breng ongeveer 2 μL DKO-phaESC-suspensie over van stap 10.6 naar de M2-medium drop.
8. Breng 10 MII-oöcyten van stap 8.5 over in dezelfde M2-mediumdruppel met behulp van een mondpipet.
9. Draai voor injectie een oöcyt in de M2-medium drop zodat de perivitelline-ruimte naar de micro-injectiepipet kijkt en de MII-plaat zich niet in het pad van de micro-injectiepipet bevindt (figuur 4A). Houd de oöcyt vast door negatieve druk uit te oefenen door de houdpipet.
   OPMERKING: Een MII-plaat wordt visueel geïdentificeerd als een uitsteeksel van ooplasma dat een "bult" wordt genoemd en zich vaak naast het eerste polaire lichaam bevindt. De MII-plaat bevat de meiotische spindel met aangebouwde chromosomen. Het aanraken van de micro-injectiepipet en de MII-plaat moet worden vermeden, omdat mechanische schade van de spindel en chromosomen de embryoontwikkeling kan verstoren.
10. Plaats één DKO-phaESC in de punt van de micro-injectiepipet door zachte negatieve druk uit te oefenen. Breek het plasmamembraan van een DKO-phaESC door pipetten om de injectie van een intacte DKO-phaESC te voorkomen (figuur 3C; zie discussie).
    OPMERKING: Als het plasmamembraan van een DKO-phaESC niet wordt gescheurd door pipetten, gooi dan de DKO-phaESC weg en laad een andere DKO-phaESC.
11. Breng de micro-injectiepipet in contact met de zona pellucida van de oöcyt en oefen een kleine hoeveelheid negatieve druk uit in de micro-injectiepipet.
12. Breng piëzo-impulsen (intensiteit, 20; frequentie, 4) aan om door de zona te breken terwijl u de punt van de micro-injectiepipet naar de perivitelline-ruimte duwt. Bevestig dat de MII-plaat, die een spindel en chromosomen bevat, zich niet in het pad van de micro-injectiepipet bevindt.
    OPMERKING: Stel de instelling empirisch in op de laagste piëzopulsen voor het boren door de zona om de kans op schade aan de oolemma te minimaliseren.
13. Gooi het fragment van de zona pellucida uit de micro-injectiepipet en plaats de DKO-phaESC aan de rand van de pipet.
14. Penetreer de oöcyt met de micro-injectiepipet zodat de oolemma de andere kant bereikt.
    OPMERKING: Raak de MII-plaat niet aan om schade aan de spindel en chromosomen te voorkomen.
15. Breng een piëzopuls aan (intensiteit, 6; frequentie, 1) om de oolemma te doorboren. Zorg ervoor dat de oolemma ontspant langs de schacht van de micro-injection pipet.
    OPMERKING: Definieer empirisch de laagste instelling van de piëzopuls voor het breken van de oolemma om de schade aan de oöcyt te minimaliseren.
16. Injecteer de DKO-phaESC met een minimaal volume medium in het ooplasma en trek de micro-injectiepipet soepel uit de oöcyt.
17. Laat de geïnjecteerde oöcyt los uit de holdingpipet en plaats deze op de zijkant van de microdrop voor latere verzameling.
18. Herhaal de injectieprocedure van stap 12.9 tot 12.17 voor de andere MII-oöcyten in de M2-gemiddelde druppel.
    OPMERKING: Vermijd het langer dan 20 minuten uit de couveuse houden van de oöcyten. Onze ervaring is dat een partij van 10 oöcyten comfortabel kan worden gemanipuleerd binnen 15 minuten na de juiste training.
19. Breng de partij geïnjecteerde oöcyten over van de M2-mediumdruppel naar een voorverwarmde middenputschaal met KSOM-medium.
20. Bewaar de schaal 1 uur bij 37 °C in een CO_2-atmosfeer van 5%.
21. Herhaal de oöcytmanipulatie van stap 12.5 en 12.20 met extra groepen MII-oöcyten om voldoende geïnjecteerde oöcyten te verkrijgen.

13. Activering van geconstrueerde semi-gekloonde embryo's

1. Bereid twee center-well gerechten met elk 900 μL KSOM medium en activeringsmedium. Bereid een 4-put plaat met 700 μL KSOM medium in elke put. Verwarm de gerechten en het bord voor op 37 °C in een CO_2-atmosfeer van 5%.
2. Breng na 1 uur in KSOM-medium de geïnjecteerde oöcyten van stap 12.21 over in de voorverwarmde middenputschaal met activeringsmedium.
3. Bewaar de schaal gedurende 6 uur bij 37 °C in een CO_2-atmosfeer van 5% voor activering.
4. Observeer na activering enkele semi-gekloonde embryo's die drie polaire lichamen vormen, namelijk de eerste en de tweede polaire lichamen van de oöcyt, en het pseudopolaire lichaam uit de DKO-phaESC (figuur 3E).
5. Was de embryo's 3 keer door ze over te brengen naar nieuwe putten met KSOM medium in een 4-well plaat.
6. Breng de embryo's over in de middenputschaal met KSOM-medium en houd de schaal op 37 °C in een CO_2-atmosfeer van 5% voor verdere ontwikkeling.

14. Ontwikkeling van geconstrueerde semi-gekloonde embryo's

1. Na 1 dag kweek in KSOM-medium vanaf stap 13.6 bereiken verschillende semi-gekloonde embryo's het 2-celstadium (figuur 5A).
2. Voor de verdere ontwikkeling van pre-implantatieembryo's in vitro, de semi-gekloonde embryo's blijven cultiveren in KSOM-medium bij 37 °C in een CO_{2-atmosfeer van} 5%. Breng de semi-gekloonde embryo's op dag 2 over naar een vers KSOM-medium. Op dag 4 bereiken verschillende embryo's het blastocyststadium (figuur 5A).
3. Voor afleiding van semi-gekloonde muizen, breng 2-cel embryo's over van stap 14.1 naar de eileiders van pseudo-zwangere ontvangende vrouwtjes. Identificeer pseudo-zwangere vrouwtjes door een dag voor de embryotransfer te paren met vasectomized mannetjes en selecteer ze op basis van de aanwezigheid van een duidelijk zichtbare plug in de ochtend van de dag voor de embryotransfer (0,5 dagen na coïtum (dpc)). Rond 19,5 dpc worden voldragen pups van nature geleverd van ontvangende vrouwtjes (figuur 5B).

Resultaten

Het doel van dit protocol is om hematbussen toe te passen als vervanging van sperma om semi-gekloonde embryo's en muizen te verkrijgen. Voor dit doel werd een DKO-phaESC-lijn met het CAG-EGFP-transgeen gegenereerd en gebruikt voor intracytoplasmatische injectie in MII-oöcyten. Om een geschikte phaESC-lijn met een vaderlijke afdrukconfiguratie te verkrijgen, hebben we genetische manipulatie uitgevoerd met Cas9-nucleases. Een haploïde ESC-lijn bevat haploïde en diploïde cellen die ontstaan als gevolg van een inherente tendens van haploïde ESC's voor diploidisatie¹⁰. Een haploïde chromosoomset is een voorwaarde voor een succesvolle vervanging van het spermagenoom. DNA-inhoudsanalyse per flowcytometrie toont de verdeling van haploïde en diploïde cellen in G0/G1-, S-en G2/M-fasen (figuur 2A).

Om de DKO-phaESC-lijnen vast te stellen, werden wildtype phaESC-lijnen getransfecteerd met piggyBac transposon-constructies voor stabiele transgene EGFP-expressie en met CRISPR/Cas9-plasmiden voor het verkrijgen van schrappingen van de H19- en IG-DMR's. Om diploïde ESC's uit te sluiten en alleen haploïde ESC's te isoleren die EGFP uitdrukken, werd een specifieke sorteerpoort gedefinieerd (Figuur 2A). Enkele haploïde EGFP-positieve cellen werden vervolgens in individuele putten van 96-putplaten geplateerd om subklonen te verkrijgen. MEF-feeders werden gebruikt om de plating-efficiëntie en overleving van de transfected phaESCs te verhogen. Na uitbreiding van de culturen werd een eerste ronde genotypering uitgevoerd door PCR om subklonen te identificeren die verwijderingen van beide DMR's met zich meebrengen. Nadat MEF-feeders uit de culturen waren verwijderd, werd een tweede genotypering uitgevoerd om de afwezigheid van wildtype allelen bij de H19- en IG-DMRs (Figuur 2B) te bevestigen. Van in totaal 135 subkloontjes kregen we 5 haploïde DKO-phESC lijnen die de verwijderde allelen droegen en vrij waren van wildtype allelen van zowel de H19-DMR als de IG-DMR.

Een CAG-EGFP-transgeen werd geïntroduceerd in DKO-phaESC's om hun bijdrage aan semi-gekloonde embryo's te bestuderen door visualisatie van groene fluorescentie onder een microscoop (Figuur 3A). Voor de intracytoplasmatische injectie werden DKO-phaESCs behandeld met demecolcine om ze in de M-fase te arresteren. Zo werd de celcyclus van DKO-phaESC's gesynchroniseerd met die van MII-oöcyten. Flow cytometrie analyse toonde 2 populaties die overeenkomen met G2/M fase gearresteerd haploïde (2n) en diploïde cellen (4n) na de behandeling met demecolcine (Figuur 3B). Afwezigheid van de 1n haploïde piek gaf aan dat de celcyclus arrestatie grotendeels voltooid was. M-fase haploïde ESC's werden vervolgens gesorteerd en geïnjecteerd in oöcyten. Hiervoor werd een enkele DKO-phaESC in de micro-injectiepipet geladen en geïnjecteerd in het cytoplasma van een MII-oöcyt (figuur 3C). Het plasmamembraan van de DKO-phaESC werd gescheurd door pipetten in de punt van de micro-injectiepipet.

Na de injectie werd egfp-expressie zelden gedetecteerd in de geconstrueerde semi-gekloonde embryo's, omdat het cytoplasma van DKO-phaESC's zich had verspreid in het grote cytoplasma van de oöcyt (figuur 3D). In zeldzame gevallen kon een ronde vlek van intense EGFP-expressie worden waargenomen in het ooplasma. Deze observatie werd waarschijnlijk veroorzaakt door de onbedoelde injectie van intacte DKO-phaESCs. Het niet scheuren van het DKO-phaESC-celmembraan is waarschijnlijk niet compatibel met verdere embryoontwikkeling en moet worden vermeden. Een uur na de injectie werden embryo's geactiveerd door behandeling met strontiumchloride¹⁸. Zes uur na het begin van de activering werden maximaal 3 polaire lichamen onder de microscoop waargenomen (figuur 3E). Deze polaire lichamen komen overeen met de eerste en tweede polaire lichamen van de oöcyt en een pseudo polair lichaam uit de DKO-phaESC⁷. Bovendien werden twee pronuclei waargenomen onder een differentiële interferentiecontrastmicroscoop, die leek op het pronucleaire stadium van zygotes na normale bevruchting met sperma.

Om ontwikkelingscompetentie aan te tonen, werden semi-gekloonde embryo's gekweekt tot het blastocyststadium (figuur 5A). Bovendien werd een voldragen muis verkregen na het overbrengen van semi-gekloonde 2-cel stadium embryo's in de eileiders van een ontvangende vrouw (Figuur 5B). Zoals verwacht was de muis afgeleid van een semi-gekloond embryo een vrouw, omdat noch oöcyt noch van oöcyt afgeleide phaESC's een Y-chromosoom dragen. De semi-gekloonde muis was openlijk normaal en produceerde gezonde nakomelingen toen hij werd gepaard met een wild type Zwitsers Webster-mannetje. Tot nu toe leeft de semi-gekloonde muis al meer dan 600 dagen zonder duidelijke gezondheidsproblemen.

Figuur 1: Overzicht van de toepassing van DKO-phaESCs als spermavervanging. (A) Een tijdschema van de procedures van het protocol. (B) De regeling toont de stappen voor het vaststellen van DKO-phaESC-lijnen (stappen 1–6). (C) Het schema toont de stappen om semi-gekloonde embryo's te construeren door intracytoplasmatische injectie van een DKO-phaESC in een MII-oöcyt (stappen 7-14). Afkortingen: DKO = double-knockout; phaESC = parthogenetische haploïde embryonale stamcel; FACS = fluorescentie-geactiveerde celsortering; MEF = embryonale fibroblast van de muis. Klik hier om een grotere versie van deze afbeelding te bekijken.

Figuur 2: Vaststelling van DKO-phaESC lijnen door CRISPR/Cas9-gemedieerde schrappingen van H19- en IG-DMR's. (A) Flow cytometrie analyse van phaESCs na transfectie met piggyBac plasmiden voor stabiele EGFP expressie en met 4 CRISPR/Cas9 plasmiden. Niet-getransfecteerde phaESC's worden als controle weergegeven. Het DNA-profiel (boven) toont de celcyclusverdeling van haploïde en diploïde cellen. G1/S-fase haploïde cellen die EGFP uitdrukken, worden aangegeven door de groene poort (onder, rechts). (B) Genotypering van phaESC-subklonen die werden gekweekt op MEF's (eerste genotypering) en na verwijdering van MEF's (tweede genotypering). Subgekloonde phaESC-lijnen 1, 2, 3 en 4 vertegenwoordigen wildtypecellen, cellen met een H19-DMR-deletie, met een IG-DMR-deletie en met gecombineerde H19-en IG-DMR-deleties. DKO-phaESC lijnen 5–8 bezitten zowel H19-DMR als IG-DMR deleties en zijn vrij van wildtype allelen. Afkortingen: DKO = double-knockout; phaESC = parthogenetische haploïde embryonale stamcel; DMR = differentieel gemethyleerd gebied; MEF = embryonale fibroblast van de muis; EGFP = verbeterd groen fluorescerend eiwit; WT = wildtype. Klik hier om een grotere versie van deze afbeelding te bekijken.

Figuur 3: Injectie van mitotisch gearresteerde DKO-phaESC's in MII-oöcyten. (A) Morfologie van een DKO-phaESC-cultuur met een CAG-EGFP-transgeen en verwijderingen van de H19- en IG-DMR's; schaalbalk = 50 μm. (B) Representatieve flow cytometrie analyse van DKO-phaESCs na arrestatie met demecolcine gedurende 8 uur. DKO-phaESCs zonder demecolcine behandeling worden als controle getoond. (C) Morfologie van DKO-phaESC's in de micro-injectiepipet. Een enkele intacte DKO-phaESC voor (links) en na (rechts) scheuren van het plasmamembraan door pipetten wordt getoond; schaalbalk = 20 μm. (D) Geconstrueerde embryo's na injectie van DKO-phaESC's in MII-oöcyten. Er wordt een samengevoegde afbeelding van EGFP-fluorescentie en helder veld weergegeven. Zwarte pijlpunten duiden op ronde vlekken van intense EGFP-expressie na injectie van intacte DKO-phaESC's, die moeten worden vermeden; schaalbalk = 50 μm. (E) Een differentieel interferentiecontrastbeeld van semi-gekloonde embryo's 6 uur na het starten van activering met strontiumchloride wordt getoond. Witte pijlpunten duiden op embryo's met 3 polaire lichamen, waaronder één pseudopolair lichaam uit de geïnjecteerde DKO-phaESC; schaalbalk = 50 μm. Afkortingen: DKO = double-knockout; phaESC = parthogenetische haploïde embryonale stamcel; EGFP = verbeterd groen fluorescerend eiwit. Klik hier om een grotere versie van deze afbeelding te bekijken.

Figuur 4: Schema van de opstelling voor intracytoplasmatische injectie van DKO-phaESC's in oöcyten. (A) De opstelling van een injectiepipet, een houdpipet en een oöcyt in de injectiekamer wordt getoond. α, buig de hoek van de micro-injection pipet. (B) Indeling van de druppels in de micromanipulatieschaal voor intracytoplasmatische injectie. Afkortingen: DKO = double-knockout; phaESC = parthogenetische haploïde embryonale stamcel. Klik hier om een grotere versie van deze afbeelding te bekijken.

Figuur 5: Ontwikkeling van semi-gekloonde embryo's. (A) Pre-implantatie ontwikkeling van semi-gekloonde embryo's in vitro. Egfp-expressie wordt aanvankelijk waargenomen in viercellige embryo's op dag 2 na intracytoplasmatische injectie. Op dag 4 kan intense EGFP-expressie worden waargenomen bij blastocysten; schaalbalk = 100 μm. (B) Een semi-gekloonde muis verkregen na 2-cel embryotransfer naar een ontvangende vrouw. Op 74 dpp, de semi-gekloonde muis (pijlpunt) leverde haar eerste pups (asterisk) door natuurlijke geboorte na het paren met een wildtype Zwitserse Webster mannetje. Semi-gekloonde embryo's en de semi-gekloonde muis in deze afbeelding zijn identiek aan die gerapporteerd in Aizawa et al.³. Afkortingen: EGFP = enhanced green fluorescent protein; .dpp, dagen post-partum. Klik hier om een grotere versie van deze afbeelding te bekijken.

Gelatineoplossing
Component	Voorraadconcentratie	Volume / gewicht	Eindconcentratie
Water	-	500 ml	-
Gelatine	-	1 g	0.2%
Haploïde embryonale stamcel (HaESC) medium
Component	Voorraadconcentratie	Volume / gewicht	Eindconcentratie
NDiff 227	-	10 ml	-
Chir 99021	10 mM	3 μL	3 μM
PD 0325901	10 mM	1 μL	1 μM
Lif	1 x 106 IE/ml	10 μL	1.000 IE/ml
Penicilline-Streptomycine	100x	100 μL	1x
HaESC onderhoudsbuffer
Component	Voorraadconcentratie	Volume / gewicht	Eindconcentratie
HaESC-medium	-	1 ml	-
HEPES-oplossing	1 M	20 μL	20 mM
Wasbuffer
Component	Voorraadconcentratie	Volume / gewicht	Eindconcentratie
DMEM / F-12	-	100 ml	-
BSA-fractie	7.5%	7,1 ml	0.5%
MEF-medium
Component	Voorraadconcentratie	Volume / gewicht	Eindconcentratie
DMEM	-	500 ml	-
FBS	-	56 ml	10%
β-Mercaptoethanol	14,3 mol/L	3,9 μL	100 μM
Penicilline-Streptomycine	100x	5,6 ml	1x
Lysisbuffer
Component	Voorraadconcentratie	Volume / gewicht	Eindconcentratie
Water	-	8,25 ml	-
Tris-HCl (pH 8,5)	1 M	1 ml	100 mM
Edta	0,5 m	100 μL	5 mM
SDS-oplossing	10%	200 μL	0.2%
Nacl	5 M	400 μL	200 mM
Proteïnase K	20 mg/ml	50 μL	100 μg/ml
Activeringsmedium
Component	Voorraadconcentratie	Volume / gewicht	Eindconcentratie
KSOM	-	1 ml	-
Strontiumchloride	1 M	5 μL	5 mM
EGTA	0,5 M, pH 8,0	4 μL	2 mM
PVP-oplossing
Component	Voorraadconcentratie	Volume / gewicht	Eindconcentratie
M2-medium	-	5 ml	-
Pvp	-	0,6 g	12%
PMSG-oplossing
Component	Voorraadconcentratie	Volume / gewicht	Eindconcentratie
Pbs	-	450 μL	-
PMSG	500 IE/ml	50 μL	50 IE/ml
hCG-oplossing
Component	Voorraadconcentratie	Volume / gewicht	Eindconcentratie
Pbs	-	450 μL	-
Hcg	500 IE/ml	50 μL	50 IE/ml
Hyaluronidase medium
Component	Voorraadconcentratie	Volume / gewicht	Eindconcentratie
M2-medium	-	380 μL	-
Hyaluronidase	10 mg/ml	20 μL	0,5 mg/ml
Afkortingen: LIF = leukemie remmende factor; MEF = embryonale fibroblast van de muis;
FBS = foetale runderserum; DMEM = Dulbecco's Gemodificeerd Eagle Medium; BSA = runderserumalbumine;
EDTA = ethyleendiaminetetraazijnzuur; SDS = natriumdodecylsulfaat; EGTA = ethyleen-bis(oxyethyleenitrilo)tetraazijnzuur;
PBS = fosfaatgebufferde zoutoplossing; PVP = polyvinylpyrrolidone; hCG = humaan choriongonadotrofine;
PMSG = drachtige merrie serum gonadotropine.

Tabel 1: Recept van medium, buffer en oplossing.

Naam	Volgorde (5' tot 3')		Toepassing
H19-DMR-P1	GTG GTT AGT TCT BIJ EEN TGG GG		Genotyperen
H19-DMR-P2	AGA TGG GGT KAT TCT TTT CC		Genotyperen
H19-DMR-P3	TCT TAC AGT CTG GTC TTG GT		Genotyperen
IG-DMR-P1	TGT GCA GCA GCA AAG CTA AG		Genotyperen
IG-DMR-P2	CCA CAA AAA CCT CCC TTT CA		Genotyperen
IG-DMR-P3	ATA CGA TAC GGC OC CAA CG		Genotyperen
H19-DMR-gRNA1-F	CAC CCA TGA ACT CAG AAG AGA CTG		gRNA
H19-DMR-gRNA1-R	AAA CCA GTC TCT TCT GAG TTC ATG		gRNA
H19-DMR-gRNA2-F	CAC CAG GTG AGA ACC ACT GCT GAG		gRNA
H19-DMR-gRNA2-R	AAA CCT CAG CAG TGG TTC TCA CCT		gRNA
IG-DMR-gRNA1-F	CAC CCG TAC AGA GCT CCA TGG CAC		gRNA
IG-DMR-gRNA1-R	AAA CGT GCC ATG GAG CTC TGT ACG		gRNA
IG-DMR-gRNA2-F	CAC CCT GCT TAG AGG TAC TAC GCT		gRNA
IG-DMR-gRNA2-R	AAA CAG CGT AGT ACC TCT AAG CAG		gRNA

Tabel 2: Lijst van oligonucleotiden.

Discussie

Het klonen van zoogdieren door somatische celkernoverdracht (SCNT) is in de jaren negentig^{1990 19,20,21}geïntroduceerd . Deze ontwikkelingen volgden op kloonstudies die 30 jaar eerder bij amfibieën werden uitgevoerd²². De aanzienlijke vertraging weerspiegelt de moeilijkheid van embryologie en genomische inprenting bij zoogdieren. De ontwikkeling van zoogdier SCNT is de basis voor de toepassing van haESC voor het vervangen van sperma, dat in dit protocol wordt beschreven.

Celcyclussynchronisatie is een belangrijke factor voor het succes van SCNT²³. Dit is ook het geval voor injectie van haESC in dit protocol. Het introduceren van een donorgenoom in een ontvanger vereist dat de celcyclusfasen worden afgestemd om chromosomale breuk of aneuploïdieën te voorkomen die de embryoontwikkeling zouden inbreken. Semi-klonen heeft de extra complexiteit dat twee genomen en een cytoplast compatibel moeten zijn. Een eerder rapport heeft aangetoond dat injectie van M-fase-gearresteerde androgenetische hemac's betere ontwikkelingssnelheden van semi-gekloonde embryo's opleverde dan injectie van G1-fase hematassen in oöcyten⁷. Dit rapport stelt M-fase voor als een geschikt synchronisatiepunt voor semi-klonen. Dienovereenkomstig werden phaESC's mitotisch gearresteerd in metafase met demecolcine en geïnjecteerd in het ooplasma van MII-oöcyten, die van nature werden gearresteerd in metafase II van meiose. Belangrijk is dat M-fase arrestatie kan worden bereikt in muis-ESC's met een hoog rendement, wat een uitstekende synchronisatie biedt tussen donor- en ontvangercelcycli.

Tijdens mitose breekt het kernmembraan af en vormt zich een spindel waaraan de gerepliceerde chromosomen zich hechten. Na injectie van M-fase DKO-phaESCs worden zusterchromatiden gescheiden in een pseudopolair lichaam en de zygote⁷ (Figuur 3E). Bijgevolg draagt een enkele set chromosomen uit een DKO-phaESC bij aan het semi-gekloonde embryo. Het is van cruciaal belang dat de zusterchromatiden van DKO-phaESC-chromosomen na injectie correct kunnen worden gescheiden. Het plasmamembraan van een intacte DKO-phaESC voorkomt segregatie in een pseudopolair lichaam. We hebben inderdaad zeldzame gevallen waargenomen waarin het plasmamembraan van DKO-phaESCs niet was gescheurd en embryo's intacte DKO-phaESCs vertoonden in het ooplasma na injectie (Figuur 3D). Daarom moet ervoor worden gezorgd dat het plasmamembraan van DKO-phaESCs wordt verwijderd door pipetten. Tijdens de injectie is het even belangrijk om de verstoring van de meiotische spindel van de oöcyt te voorkomen, wat kan leiden tot chromosoomsegregatiedefecten en ook aneuploïdie kan veroorzaken.

Bij zoogdieren beperkt genomische imprinting de toepassing van phaESC's als spermavervanging. Parthenogenetische hemoc's bezitten een maternale configuratie van genomische afdrukken, terwijl sperma een vaderlijke configuratie heeft. Daarom is de generatie van voldragen pups niet opgetreden na de injectie van wildtype phaESCs als spermavervanging. Om deze beperking te overwinnen, worden verwijderingen van de IG- en H19- DMR's ontworpen in phaESC's. Wijziging van de ingeprente expressie bij de maternale Igf2-H19 en Gtl2-Dlk1 loci is voldoende om de configuratie van genomische afdrukken te wijzigen om de generatie van semi-gekloonde muizen met een frequentie van meer dan 5,1% mogelijk te maken, gebaseerd op overgedragen 2-cel embryo's. Deze observaties suggereren dat het richten van twee ingeprente genen het genoom van phaESC's verandert in een functionele vaderlijke configuratie die sperma bij muizen kan vervangen. Niettemin is voor deze strategie een permanente genetische modificatie van de phaESC's vereist. Als alternatieve strategie kan androgenetische hematoc worden overwogen. Androgenetische hemacs zijn afgeleid van het spermagenoom en bezitten vaderlijke afdrukken. Er zijn meldingen geweest dat wildtype androgenetische hemdc 's als spermavervanging hebben bijgedragen aan het genereren van voldragen pups met een frequentie tussen 1,3% en 1,9% van de overgedragen embryo 's^4,7,24. Voldragen pups zijn ook verkregen door androgenetische hemacs te injecteren met deleties van de IG- en H19-DMR's met een frequentie van 20,2% van de overgedragen 2-cel embryo's²⁴. De verhoogde efficiëntie van semi-klonen met behulp van gemodificeerde androgenetische hemacs is waarschijnlijk omdat afdrukken onstabiel kunnen worden in de cultuur. Afdrukdefecten worden gecorrigeerd door de genetische deleties van kritische DMR's.

Gezien de moeilijkheid om genetische modificaties rechtstreeks in de oöcyt- of spermagenoom te introduceren, zijn hemOC's een waardevol hulpmiddel om de ouderlijke genomen afzonderlijk te manipuleren. Het gebruik van hemUS's als vervanging van sperma biedt een opmerkelijk voordeel voor genoombewerking in de muiskiembaan. Een recente studie heeft crispr/cas9-gebaseerde genoombewerking gecombineerd met de toepassing van hemac's voor de karakterisering van inprentingsgebieden die van cruciaal belang zijn voor embryonale ontwikkeling¹². Deze studie analyseerde de rol van de Rasgrf1-DMR in combinatie met de H19-en IG-DMR's bij de ontwikkeling van bimaternal muizen, en de functie van 7 verschillende DMR's in de ontwikkeling van bipaternal muizen. De methode voor het vervangen van hemAC 's door sperma vormde de basis voor genetische screeningbenaderingen voor het identificeren van belangrijke aminozuren binnen het DND1-eiwit in de ontwikkeling van primordiale kiemcellen en voor het identificeren van genen in botontwikkeling^24,25,26. Studies over genomische inprenting en genetische screening om belangrijke factoren in de embryonale ontwikkeling te identificeren, zijn aanzienlijke benaderingen voor de toepassing van hemac's als gametische genomen.

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel

Naam	Bedrijf	Catalogusnummer	Opmerkingen
1.5 mLTube	Eppendorf	0030 125.150	haESC-kweek
15 ml Tube	Greiner Bio-One	188271	haESC-kweek
12-well plate	Thermo Scientific	150628	haESC-kweek
24-well plate	Thermo Scientific	142475	haESC-kweek
6-well plate	Thermo Scientific	140675	haESC-kweek
96-well plate	Thermo Scientific	167008	haESC-kweek
β-Mercaptoethanol	Merck	M6250	haESC-kweek
BSA fraction	Gibco	15260-037	haESC-kweek
CHIR 99021	Axon	1386	haESC-kweek
Demecolcine solution	Merck	D1925	haESC-kweek
DMEM	Gibco	41965-039	haESC-kweek
DMEM / F-12	Gibco	11320-033	haESC-kweek
DR4 mouse	The Jackson Laboratory	3208	haESC-kweek
EDTA	Merck	E5134	haESC-kweek
FBS	biowest	S1810-500	haESC-kweek
Freezing medium	amsbio	11897	haESC-kweek
Gelatin	Merck	G1890	haESC-kweek
Hepes solution	Gibco	15630-056	haESC-kweek
Irradiated MEF	Gibco	A34966	haESC-kweek
LIF (Leukemia inhibitory factor)	(Homemade)	-	haESC-kweek
Lipofection reagent	Invitrogen	11668019	haESC-kweek
NDiff 227	Takara	Y40002	haESC-kweek
PD 0325901	Axon	1408	haESC-kweek
Pen Strep	Gibco	15140-122	haESC-kweek
piggyBac plasmid carrying a CAG-EGFP transgene	Addgene	#40973	haESC-kweek
piggyBac transposase plasmid	System Biosciences	PB210PA-1	haESC-kweek
pX330 plasmid	Addgene	#42230	haESC-kweek
pX458 plasmid	Addgene	#48138	haESC-kweek
Trypsin	Gibco	15090-046	haESC-kweek
DNA polymerase	Thermo Scientific	F549S	Genotypering
dNTP Mix	Thermo Scientific	R0192	Genotypering
Ethanol	Merck	100983	Genotypering
Hydrochloric acid	Merck	100317	Genotypering
Isopropanol	Merck	109634	Genotypering
Proteinase K	Axon	A3830	Genotypering
SDS	Merck	71729	Genotypering
Sodium chloride	Merck	106404	Genotypering
ThermoMixer	Epeendorf	5384000012	Genotypering
Tris	Merck	T1503	Genotypering
5 mL Tube	Falcon	352063	Flow cytometry
5 mL Tube with cell strainer cap	Falcon	352235	Flow cytometry
Hoechst 33342	Invitrogen	H3570	Flow cytometry
MoFlo Astrios EQ	Beckman Coulter	B25982	Flow cytometry
1 mL syringe	Codan	62.1640	Superovulatie
30-gauge 1/2 inch needle	Merck	Z192362-100EA	Superovulatie
B6D2F1 mouse	The Jackson Laboratory	100006	Superovulatie
hCG	MSD animal health	49451	Superovulatie
PBS	Gibco	10010015	Superovulatie
PMSG	Avivasysbio	OPPA1037 5000 IU	Superovulatie
10-cm dish	Thermo Scientific	150350	Embryo manipulatie
4-well plate	Thermo Scientific	179830	Embryo manipulatie
50 mL tube	Greiner Bio-One	227261	Embryo manipulatie
6 cm dish	Thermo Scientific	150288	Embryo manipulatie
Center-well dish	Corning	3260	Embryo manipulatie
Digital rocker	Thermo Scientific	88880020	Embryo manipulatie
EGTA	AppliChem	A0878	Embryo manipulatie
Hyaluronidase	Merck	H4272	Embryo manipulatie
KSOM	Merck	MR-020P-5F	Embryo manipulatie
M16 medium	Merck	M7292	Embryo manipulatie
M2 medium	Merck	M7167	Embryo manipulatie
Mineral oil	Merck	M8410	Embryo manipulatie
Glass capillary	Merck	P1049-1PAK	Embryo manipulatie
Stereomicroscope	Nikon	SMZ745	Embryo manipulatie
Strontium chloride	Merck	13909	Embryo manipulatie
5ml syringe	Codan	62.5607	Microinjectie
Borosilicate glass cappilary	Science product	GB100T-8P	Microinjectie
CellTram 4r Oil	Eppendorf	5196000030	Microinjectie
Fluorinert FC-770	Merck	F3556	Microinjectie
Holding pipette	BioMedical Instruments	-	Microinjectie
Inverted microscope	Nikon	Eclipse Ti-U	Microinjectie
Microforge	Narishige	MF-900	Microinjectie
Microinjection pipette	BioMedical Instruments	-	Microinjectie
Microlaoder tips	Eppendorf	5252 95