Methodenartikel

Microfluïdisch model om de eerste gebeurtenis van neovascularisatie na te bootsen

DOI:

10.3791/62003

⸱

10 april 2021

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Beijing Advanced Innovation Centre for Biomedical Engineering, Key Laboratory for Biomechanics and Mechanobiology of Chinese Education Ministry, School of Biological Science and Medical Engineering, Beihang University, 2School of Engineering Medicine, Beihang University, 3Artificial Intelligence Key Laboratory of Sichuan Province, School of Automation and Information Engineering, Sichuan University of Science and Engineering, 4Beijing Research Center of Urban System Engineering

In dit artikel

Samenvatting

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Hier bieden we een microfluïdische chip en een automatisch gecontroleerd, zeer efficiënt circulatiemicrofluïdisch systeem dat de initiële micromilieu van neovascularisatie samenvat, waardoor endotheelcellen (EC's) tegelijkertijd kunnen worden gestimuleerd door hoge luminale schuifspanning, fysiologisch niveau van transendotheliale stroom en verschillende vasculaire endotheliale groeifactor (VEGF) distributie tegelijkertijd.

Samenvatting

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Neovascularisatie wordt meestal geïnitialiseerd vanuit een bestaande normale vasculatuur en de biomechanische micromilieu van endotheelcellen (EC's) in de beginfase varieert dramatisch van het volgende proces van neovascularisatie. Hoewel er tal van modellen zijn om verschillende stadia van neovascularisatie te simuleren, ontbreekt een in vitro 3D-model dat het initiële proces van neovascularisatie capituleert onder de overeenkomstige stimulaties van normale vasculatuurmicromilieus nog steeds. Hier hebben we een in vitro 3D-model gereconstrueerd dat de eerste gebeurtenis van neovascularisatie (MIEN) nabootst. Het MIEN-model bevat een microfluïdische kiemchip en een automatisch controlesysteem, zeer efficiënt circulatiesysteem. Een functionele, perfuseerbare microkanaal bedekt met endotheel werd gevormd en het proces van ontkiemen werd gesimuleerd in de microfluïdische kiemchip. De aanvankelijk fysiologische micromilieu van neovascularisatie werd samengevat met het microfluïdische controlesysteem, waardoor EC's tegelijkertijd zouden worden blootgesteld aan hoge luminale schuifspanning, fysiologische transendotheliale stroom en verschillende vasculaire endotheliale groeifactorverdelingen (VEGF). Het MIEN-model kan gemakkelijk worden toegepast op de studie van het neovascularisatiemechanisme en heeft een potentiële belofte als een goedkoop platform voor geneesmiddelenscreening en toxicologische toepassingen.

Inleiding

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Neovascularisatie vindt plaats in veel normale en pathologische processen1,2,3,4, waaronder twee belangrijke processen bij volwassenen, angiogenese en arteriogenese5. Naast de bekendste groeifactoren, zoals vasculaire endotheelgroeifactor (VEGF)6, zijn mechanische stimulaties, met name de door de bloedstroom veroorzaakte afschuifstress, belangrijk bij de regulatie van neovascularisatie7. Zoals we weten, variëren de omvang en vormen van schuifspanning dramatisch en dynamisch in verschillende delen van de vasculatuur, wat resulteert in belangrijke effecten op vasculaire cellen8,9,10,11,12. Eerdere studies hebben aangetoond dat schuifspanning verschillende aspecten van EC's kan beïnvloeden, waaronder celfenotypische veranderingen, signaaltransductie, genexpressie en de communicatie met muurschilderingcellen13,14,15,16,17,18,19,20; dus, reguleren neovascularisatie21,22,23,24.

Daarom, om neovascularisatie beter te begrijpen, is het belangrijk om het proces in natuurlijke cellulaire micromilieu in vitrote reconstrueren. Onlangs zijn er veel modellen opgericht om microvaten te creëren en nauwkeurige controle te bieden over micromilieu25,26,27,gebruikmakend van de vooruitgang in microfabrication en microfluïdische technologie. In deze modellen kunnen microvaten worden gegenereerd door hydrogel28,29, polydimethylsiloxaan (PDMS) microfluïdische chips30,31,32 of 3D bioprinting33,34. Enkele aspecten van het micromilieu, zoals luminale schuifspanning22,23,35,36, transendotheelstroom37,38,39,40, biochemische gradiënt van angiogenefactoren 41,42, stam/rek43,44,45, en samen met andere typen cellen32,46 zijn nagebootst en gecontroleerd. Meestal werd een groot reservoir of spuitpomp gebruikt om doordrenkt medium te bieden. De transendotheelstroom in deze modellen werd gecreëerd door drukval tussen het reservoir en microbuis22,23,38,40. Het mechanische micromilieu was echter moeilijk constant op deze manier te onderhouden. De transendotheliale stroom zou toenemen en dan het fysiologische niveau overschrijden als een hoog debiet met hoge schuifspanning voor perfusie werd gebruikt. Eerdere studie toonde aan dat in de beginperiode van neovascularisatie de snelheid van de transendotheelstroom zeer laag is als gevolg van de intacte EC's en keldermembraan, meestal minder dan 0,05 μm/s8. Ondertussen, hoewel luminale schuifspanning in vasculair systeem sterk varieert, is het relatief hoog met gemiddelde waarden van 5-20 dyn/cm2,11,47. Voorlopig is de snelheid van de transendotheelstroom in eerdere werken over het algemeen tussen 0,5-15 μm/s22,38,39,40gehouden en was de luminale schuifspanning meestal minder dan 10 dyn/cm223. Het blijft een moeilijk onderwerp om EC's voortdurend bloot te stellen aan hoge luminale schuifspanning en fysiologisch niveau van transendotheelstroom tegelijkertijd. 

In deze studie beschrijven we een in vitro 3D-model om de eerste gebeurtenis van neovascularisatie (MIEN) na te bootsen. We ontwikkelden een microfluïdische chip en een automatisch controlesysteem, zeer efficiënt circulatiesysteem om perfusiemicrobuizen te vormen en het proces van ontkiemen48te simuleren. Met het MIEN-model wordt de micromilieu van EC's die tijdens de eerste periode van neovascularisatie worden gestimuleerd, eerst samengevat. EC's kunnen worden gestimuleerd door hoge luminale schuifspanning, fysiologisch niveau van transendotheelstroom en verschillende VEGF-distributie tegelijkertijd. We beschrijven de stappen om het MIEN-model in detail vast te stellen en de belangrijkste aandachtspunten, in de hoop een referentie te bieden aan andere onderzoekers.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. Waferbereiding

OPMERKING: Dit protocol is specifiek voor de SU-8 2075 negatieve fotoresist die tijdens dit onderzoek wordt gebruikt.

  1. Reinig de siliciumwafel 3 tot 5 keer met methanol en isopropanol op een spincoater als volgt: draai eerst 15 s bij 500 tpm en draai vervolgens 60 s bij 3.000 tpm.
  2. Breng de siliciumwafel over op een kookplaat, die voorverwarmd is tot 180 °C en bak de wafer 10 minuten.
  3. Haal de siliconen wafer van de kookplaat en koel deze af tot kamertemperatuur. Reinig de wafer opnieuw met perslucht voordat u doorgaat met de spincoating. Breng 4 ml van de SU-8 2075 fotoresist aan op het midden van de wafer.
  4. Verkrijg een functiehoogte van 70 μm op de spincoater als volgt: draai eerst 12 s bij 500 tpm en draai vervolgens 50 s bij 2.100 tpm.
  5. Bak de wafel zachtjes op een kookplaat als volgt: bak eerst 8 min op 65 °C en bak vervolgens 20 min op 95 °C. Verwijder vervolgens de siliciumwafel van de kookplaat en koel deze af tot kamertemperatuur vóór lithografie.
  6. Plaats een fotomasker op de fotoresistente film. Stel de wafer bloot met een lithografie-apparatuur om een totale blootstelling van 200 mJ/cm2te bereiken.
    OPMERKING: Het fotomasker bevat negen sets patronen van de chip, zodat het elke keer negen microfluïdische kiemchips kan fabriceren.
  7. Plaats de wafel als volgt op een kookplaat: bak eerst 5 minuten op 65 °C en bak vervolgens 20 minuten op 95 °C. Verwijder vervolgens de siliciumwafel van de kookplaat en koel deze af tot kamertemperatuur voordat u deze ontwikkelt.
  8. Breng de wafer over naar een glazen Petrischaal gevuld met SU-8 developer (PGMEA) om te beginnen met ontwikkelen.
    LET OP: De ontwikkelaar is irriterend voor de ogen en luchtwegen. Voer de ontwikkeling uit in een afzuigkap. Draag een welkomstbril, nitrilhandschoenen en een vliegtuigmasker tijdens de operatie.
  9. Schud de schotel voorzichtig langs de richting van het stroomkanaal en verander de ontwikkelaar na 10 minuten.
  10. Herhaal stap 1.9 3-5 keer totdat de patronen duidelijk kunnen worden waargenomen.
    OPMERKING: Zorg ervoor dat er geen fotoresistent residu meer op de wafer achterblijft, anders spoelt u de wafer opnieuw in de ontwikkelaar.
  11. Breng de wafer over op een voorverwarmde kookplaat op 120 °C en bak deze 30 minuten.
  12. Pipet 35 μL silaan op een coverslip, plaats vervolgens de coverslip samen met de wafer in een desiccator en trek vacuüm. Sluit de desiccator af en laat de wafer 4 uur onder vacuüm om de wafer te verzanden om de hechting van PDMS tijdens de softlithografieprocessen te voorkomen.
    LET OP: Het silaan is giftig. Om vergiftiging te voorkomen, voert u silanisatie uit in de rookkap en draagt u nitrilhandschoenen tijdens het hanteren.
  13. Laat het vacuüm los van de desiccator. Verwijder de verzilverde wafel op een voorverwarmde kookplaat en bak deze 2 uur op 65 °C.
  14. Bewaar de wafel in een schone Petrischaal tot het nodig is.

2. Microfluïdische kiemende chipfabricage

  1. Meng 20 g basismiddel en 2 g uithardingsmiddel (verhouding 10:1) in een plastic bekerglas en meng ze grondig met een mengstaaf.
  2. Plaats het bekerglas in een desiccator en trek het vacuüm gedurende 1 uur om luchtbellen in het PDMS-mengsel te verwijderen.
  3. Giet het PDMS-mengsel op de wafer in de Petrischaal en plaats de Petrischaal terug in de desiccator en ontgassen nog 30 minuten.
    OPMERKING: Het is handig om dubbelzijdig plakband te gebruiken om de wafer op de bodem van de Petrischaal te lijmen om ervoor te zorgen dat de wafer horizontaal wordt gehouden tijdens het ontgassen en uitharden.
  4. Haal de Petrischaal uit de desiccator en zet deze 3 uur in een droge oven van 80 °C om uit te harden.
  5. Scheid de PDMS-laag voorzichtig van de wafer en snijd de laag volgens het patroon tot negen spaanders met een scalpel.
    OPMERKING: Houd de functiezijde omhoog na de scheiding.
  6. Pons twee hydrogelinjectiepoorten en vier media-injectiepoorten uit elke chip met respectievelijk een biopsiepons van 1 mm en 3,5 mm.
  7. Reinig de geponste spaanders met residuvrije tape om PDMS-residu te verwijderen. Plaats de chips en negen glazen afdeklippen in een plasmareiniger en behandel ze gedurende 30 s met zuurstofplasma om covalente hechting op het oppervlak te vormen.
  8. Haal de chips en coverslips eruit. Bevestig de functiezijde van de chips op de afdeklippen.
  9. Plaats de bijgevoegde spaanders gedurende 1 uur in een droge oven van 80 °C om de hechting te intensiveren.
  10. Autoclaveer de chips voor gebruik en houd ze steriel voor de rest van de procedure.

3. Oppervlaktemodificatie en hydrogelinjectie

  1. Voor elke chip, pipet 40 μL van 1 mg/ml poly-D-lysine (PDL) en injecteer het in kanalen in de chip van hydrogel injectie poort.
    OPMERKING: Zorg ervoor dat de PDL kanalen vult, vooral in smalle kanalen in de buurt van de poorten.
  2. Incubeer de chips gedurende 4 uur bij 37 °C om het oppervlak van het PDMS te wijzigen .
  3. Pipet 200 μL steriel water en injecteer het in kanalen in de chip van hydrogel injectiepoort om PDL uit te wassen.
  4. Verwijder de chips gedurende 3 uur in een droge oven van 120 °C om de hydrofobice te herstellen.
  5. Plaats op het ijs een steriele buis en bereken het volume van type I collageen dat als de volgende vergelijking moet worden gebruikt.
    Eindvolume (50 μL) x Uiteindelijke collageenconcentratie (3 mg/ml in dit onderzoek) / Concentratie in fles = toe te voegen volumecollageen
  6. Bereken het volume van NaOH dat als de volgende vergelijking moet worden gebruikt.
    (toe te voegen volumecollageen) x 0,023 = volume 1 N NaOH
  7. Bereid 50 μL hydrogel in de buis als het volgende protocol: voeg 5 μL van 10x PBS, 0,5 μL fenolrood, berekend volume van 1 N NaOH, 4 μL van 1 mg/ml Fibronectine toe, berekend volume van type I collageen op zijn beurt. Voeg de juiste hoeveelheid dH2O toe, zodat het totale volume 50 μL bereikt. Meng alle inhoud in de buis grondig.
    OPMERKING: Voer alle bewerkingen op ijs uit. Gebruik fenolrood als indicator op basis van zuur om te helpen bij de visuele bepaling van de pH van de hydrogel. De uiteindelijke hydrogel eindigt oranje wanneer de pH ongeveer 7,4 is en de stijfheid ongeveer 15 kPa49.
  8. Pipet 2-3 μL hydrogel voor elke chip en injecteer het langzaam in het centrale hydrogelkanaal vanuit de hydrogelinjectiepoort.
  9. Incubeer de chips gedurende 30 minuten op 37 °C om gelatie mogelijk te maken.
    OPMERKING: Sluit de chips af in een afgesloten doos met 1 ml steriel water als ze niet onmiddellijk worden gebruikt. Verzegelde chips kunnen tot 24 uur bij 37 °C worden bewaard.

4. Cel zaaien

  1. Pipet 20 μL van 125 μg/ml Fibronectine in één media-injectiepoort van het celkweekkanaal.
  2. Snijd een pipettip om de poort van het celcultuurkanaal met een schaar te passen.
  3. Plaats de pipettip in de andere media-injectiepoort van het celkweekkanaal. Pipet vervolgens lucht uit het celkweekkanaal om het te vullen met Fibronectin.
  4. Incubeer de chips gedurende 1 uur bij 37 °C.
  5. Voordat de cellen worden gezaaid, moet u 20 μL ECM-media in elke media-injectiepoort spuiten en de chips gedurende 30 minuten bij 37 °C incubederen.
  6. Pipet vervolgens alle media in alle media-injectiepoorten.
  7. Vervolgens pipet 5 μL celsuspensie in één media-injectiepoort van het celkweekkanaal. Vervolgens verspreiden endotheelcellen zich snel over het hele kanaal onder differentiële hydrostatische druk.
    OPMERKING: Bereid de celsuspensie voor door menselijke navelstreng endotheelcellen (HUVECs) uit de kweekkolf te proberen en centrifugeren op 400 x g. Breng vervolgens de cellen opnieuw op 107 cellen/ml in een buis.
  8. Voeg ongeveer 4-6 μL ECM-media toe aan de andere poort om de hydrostatische druk aan te passen en het bewegen van cellen te stoppen.
  9. Verwijder de chips in de celincubator. Draai vervolgens de chips om de 30 minuten om totdat endotheelcellen 2 uur later rond het interne oppervlak van het celkweekkanaal bedekken (figuur 1).
    OPMERKING: Om de chip ondersteboven te maken, spuit u een beetje water op de achterkant van de afdeklip. Vervolgens kan de chip aan het deksel van de Petrischaal worden bevestigd.
  10. Gebruik de pipettip om de aangesloten cellen in de injectiepoorten zeer voorzichtig te verwijderen.
  11. Plaats vervolgens vier vrouwelijke Luer-adapters met prikkeldraad in de media-injectiepoorten en vul deze met ECM-media.
    OPMERKING: De adapters kunnen functioneren als vloeistofreservoirs om voedingsstoffen te leveren voor de cellen in het kanaal.
  12. Verwijder de chips in de celincubator. Verander ECM-media in Luer-adapters om de 12 uur.

5. Meting van fitc-dextran diffusional permeabiliteit

OPMERKING: Om de barrièrefunctie van het microvat te beoordelen, wordt de diffusiepermeabiliteit van het EG-kweekkanaal met of zonder celvoering beoordeeld.

  1. Haal een microfluïdische kiemchip eruit met hydrogel geïnjecteerd.
  2. Herhaal stap 4.1-4.6.
  3. Verwijder alle Luer-adapters en pipet alle media in vier media-injectiepoorten.
  4. Plaats de chip op de confocale laserscanmicroscoop.
  5. Pipet 5 μL kweekmedia met 500 μg/ml 40 kDa FITC-dextran naar één poort van het celkweekkanaal.
    OPMERKING: 40 kDa FITC-dextran heeft een vergelijkbare moleculaire grootte als VEGF-165 (39-45 kDa).
  6. Leg elke 3 s voor 30 s beelden vast. Zo wordt de diffusiepermeabiliteit zonder celvoering gemeten.
  7. Haal de microfluïdische kiemchip eruit nadat HUVECs samenvloeien in het celkweekkanaal.
  8. Herhaal stap 5.3-5.5.
  9. Leg elke 3 s voor 30 s beelden vast. Zo wordt de diffusiepermeabiliteit met celvoering gemeten.
  10. Bereken de diffusiepermeabiliteit door veranderingen van fluorescerende intensiteit in de loop van de tijd te kwantificeren met behulp van de volgende gewijzigde vergelijking50.
    Pd= (I2- I1) / ((I1- Ib)· Δt) · S/d
    waarbij, Pd is de diffusionele permeabiliteitscoëfficiënt, I1 is de gemiddelde intensiteit op een begintijdpunt, I2 is de gemiddelde intensiteit na deltatijd (Δt), Ib is de achtergrondintensiteit, S is het gebied van het kanaal in fluorescentiebeelden en d is het totale interval van microposten in fluorescentiebeelden. In het huidige werk wordt Δt ingesteld op 9 s.
    OPMERKING: De huidige vergelijking verschilt enigszins van de oorspronkelijke50, vanwege de diffusierichting van de fluorescentie in de chip is alleen van het EC-kanaal naar het hydrogelkanaal, wat niet is zoals de cirkelvormige buis die in alle radiale richting diffusie.

6. Microfluïdische controlesysteem setup

OPMERKING: Het microfluïdische besturingssysteem in deze studie bestaat uit een microspuitpomp, een elektromagnetische knijpklep, een bellenvangerchip, een microfluïdische chip, een microperistaltische pomp en een reservoir. Elk deel van het systeem kan worden vervangen door alternatieven die dezelfde functie kunnen vervullen.

  1. Bubble trap chip fabricage
    OPMERKING: De bellenvangerchip wordt gebruikt om luchtbellen in omloop te verwijderen. De chip bestaat uit drie PDMS lagen. De bovenste laag is geconstrueerd met zachte lithografie om rasterstructuur te vormen als de vloeibare kamer. Elk kanaal van de rasterstructuur is 100 μm breed. De onderste laag is een PDMS-brok met een gat. Tussen de twee lagen wordt een 100 μm dunne PDMS-film gelegd.
    1. Herhaal stap 1 om de wafer voor te bereiden op bubble trap chip.
    2. Herhaal stap 2.1-2.5 om de bovenste en onderste laag van de bubble trap chip te fabriceren.
      OPMERKING: Het fotomasker van de bovenste laag bevat drie sets patronen, dus snijd de PDMS-laag volgens het patroon op drie chips.
    3. Pons zes gaten aan het einde van de inlaat- en uitlaatkanalen van de bovenste laag met behulp van een biopsiepons van 3,5 mm.
    4. Pons twee gaten op de overeenkomstige positie van de onderste laag met behulp van een 6 mm biopsie punch volgens het patroon op de bovenste laag.
    5. Herhaal stap 2.1-2.2 om 10 g PDMS-mengsel te bereiden en giet het op het midden van een gereinigde siliciumwafel.
    6. Fabriceer een PDMS-film van 100 μm door het volgende spinprotocol toe te passen: draai voor 15 s bij 500 tpm, verhoog de spinsnelheid tot 1.300 tpm en houd hier 45 s vast.
    7. Doe de wafel op een voorverwarmde kookplaat op 180 °C en bak deze 30 minuten.
    8. Reinig de geponste lagen met residuvrije tape om PDMS-residu te verwijderen. Plaats de bovenste lagen en wafer in een plasmareiniger en behandel ze met zuurstofplasma gedurende 30 s om covalente hechting op het oppervlak te vormen.
    9. Haal de bovenste lagen en wafel eruit. Bevestig de functiezijde van de bovenste lagen aan de PDMS-film.
    10. Snijd de film voorzichtig langs de rand van de bovenste lagen met een naald.
    11. Scheid de film langzaam van de wafer en draai de chips om om de film na scheiding naar boven te maken.
    12. Plaats de onderste lagen en de bijgevoegde chips in een plasmareiniger en behandel ze opnieuw met zuurstofplasma gedurende 30 s.
    13. Haal de onderste lagen eruit en bevestig chips. Bevestig de onderste lagen op de PDMS-film en de bubble trap chips zijn klaar.
      OPMERKING: Lijn de gaten op de onderste laag uit met de patronen op de bovenste laag bij het bevestigen.
    14. Plaats de chips gedurende 1 uur in een droge oven van 80 °C om de hechting te intensiveren.
  2. Monteer het microfluïdische besturingssysteem
    OPMERKING: Alle onderdelen van het systeem, zoals bellenvangerchip, reservoir, buizen en connectoren, worden gebruikt na autoclaafsterilisatie, met uitzondering van elektronische apparatuur. Monteer het microfluïdische besturingssysteem op een schone bank.
    1. Om het microfluïdische controlesysteem te monteren, bereidt u twee polytetrafluorethyleenbuizen, twee korte siliconenbuizen, drie lange siliconenbuizen, een vrouwelijke Luer-adapter met weerhaak, een Y-type connector en drie connectoren van het L-type voor.
      OPMERKING: Het voordeel van polytetrafluorethyleen buis is een lage elasticiteit, daarom is er minder media nodig in de pijpleiding. Siliconen buis daarentegen heeft een hoge elasticiteit, daarom is het geschikt voor de knijpklep en peristaltische pomp.
    2. Vul de spuit met 10 ml voorverwarmd (37 °C) ECM-medium.
      OPMERKING: Voorverwarmen helpt het medium opgelost gas vrij te geven.
    3. Sluit een polytetrafluorethyleen buis aan op de spuit door een prikkelende vrouwelijke Luer adapter. Sluit vervolgens het andere uiteinde van polytetrafluorethyleenbuis aan op een Y-type connector.
    4. Sluit vervolgens twee lange siliconenbuizen aan op de andere twee uiteinden van de Y-type connector met één buis die op het reservoir wordt aangesloten en de andere buis die verbinding maakt met de bubble trap-chip.
    5. Sluit nog een lange siliconen buis aan op het reservoir.
    6. Gebruik vervolgens twee korte siliconen buizen om alle inlaat- en uitlaatgaten op de bovenste laag van de bubble trap chip aan te sluiten. Sluit een polytetrafluorethyleen buis aan op de backend van de chip.
    7. Bevestig vervolgens de spuit op de microspuitpomp.
    8. Klem twee lange siliconen buizen in de elektromagnetische knijpklep.
    9. Schakel vervolgens de elektromagnetische knijpklep om de pijpleiding tussen de spuit en het reservoir te openen. Injecteer de media in het reservoir met behulp van een microspuitpomp om lucht in de buis af te zuigen.
    10. Schakel vervolgens de klep opnieuw om de pijpleiding tussen de spuit en de bellenvangerchip te openen. Injecteer de media om de vloeistofkamer en de backendbuis van de bubble trap chip te vullen.

7. Endotheel ontspruitende test

OPMERKING: Een stage top incubator geassembleerd met fasecontrastmicroscoop wordt in deze studie gebruikt om het proces van ontkiemen in realtime te observeren. De stage top incubator kan de temperatuur, vochtigheid en CO2-controle op microscoopstadia behouden, wat goed is voor live celbeeldvorming. Maar de apparatuur is niet nodig voor de test. De protocollen die hier worden verstrekt, kunnen ook worden gewerkt in een basiscelincubator.

  1. Haal endotheel ontkiemende chips uit de celincubator.
  2. Verwijder vervolgens Luer-adapters aan de celkweekzijde. Steek twee pijppluggen in de hydrogelinjectiepoorten van de microfluïdische kiemchip.
    OPMERKING: De pluggen kunnen transformeren van naalden en hun belangrijkste functie is om te voorkomen dat media morsen.
  3. Sluit de backend tube van bubble trap chip aan op één poort van cel cultuur kanaal.
    OPMERKING: Zorg ervoor dat er geen bellen in de buis zitten voordat u deze aansluit.
  4. Plaats een T-type connector op de andere poort en sluit deze aan op een lange siliconen buis die op het reservoir is aangesloten.
  5. Klem de lange siliconen buis in de microperistaltische pomp.
  6. Plaats vervolgens een luchtfilter in het reservoir.
  7. Monteer vervolgens de microfluïdische kiemchip in de podiumtopincubator.
  8. Sluit vervolgens de vacuümpomp aan op de gaten in de onderste laag van de bellenvangerchip met een TPU-buis.
  9. Stel het circulatievolume en debiet in het aangepaste programma in, dat de microspuitpomp en de elektromagnetische knijpklep tegelijkertijd regelt (figuur 2).
    OPMERKING: Het debiet over het endotheelcelcultuurkanaal wordt berekend volgens de klassieke vergelijking.
    τ = 6μQ / Wh2
    waarbij τ schuifspanning (dyn/cm2)is, μ viscositeit van het medium (8,8 x 10-4 Pa•s), Q het debiet is over het endotheelcelkweekkanaal (ml/s), h kanaalhoogte (70 μm) is en W kanaalbreedte (1.000 μm). De viscositeit van het medium wordt gemeten met behulp van een coaxiale rotatieviscometer van het cilindertype. De hoogte en breedte van het kanaal worden vooraf bepaald en handmatig bevestigd met behulp van een fasecontrastmicroscoop bij 4x vergroting. Het circulatievolume is 5 ml en het debiet is 85 μL/min (gemiddeld 0,2 m/s in celkweekkanaal) voor 15 dyn/cm2 schuifspanning volgens berekening.
  10. Stel vervolgens het debiet van de microperistaltische pomp in.
    OPMERKING: Het debiet van de microperistaltische pomp is iets hoger dan de microspuitpomp, om te voorkomen dat de media morsen.
  11. Zet de microspuitpomp aan. Vervolgens wordt het circulatiecontrolesysteem ingesteld.

8. Data-analyse

OPMERKING: Om de spruiten te kwantificeren, werd het genormaliseerde gebied van het ontkiemen, de gemiddelde spruitlengte en de langste spruitlengte berekend. De resultaten vertegenwoordigen de gemiddelde ± SEM uit drie onafhankelijke studies. Statistische significantie (P < 0,05) wordt beoordeeld aan de hand van de t-toetsvan student.

  1. Fixeer cellen en spruiten in de microfluïdische kiemchip na experimenten met 4% paraformaldehyde in PBS gedurende 15 minuten. Vlekkernen met 4′,6-diamidino-2-fenylindoledihydrochloride (DAPI; 1: 1000; Sigma-Aldrich) gedurende 10 minuten en vervolgens vlekcytoskelet met TRITC falliline (P5285, 1: 100; Sigma-Aldrich) gedurende 1 uur. Was cellen drie keer met PBS met intervallen van 5 minuten tussen elke stap.
  2. Maak confocale afbeeldingen van de chips in een tegelmodus en naai ze met behulp van beeldbewerkingssoftware.
  3. Tel het aantal fluorescerende pixels van Z-projectieafbeeldingen met behulp van een aangepaste code in programmeersoftware om het genormaliseerde ontkiemingsgebied te kwantificeren (Zie Aanvullend bestand).
  4. Identificeer en label elke punt van spruiten handmatig in Z-projectieafbeeldingen en bereken afstanden tussen spruiten tips naar ECs keldermembraan met behulp van een andere aangepaste code om de gemiddelde spruitlengte en langste spruitlengte te kwantificeren (Zie Supplemental File).

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Resultaten

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Het in vitro 3D-model om de eerste gebeurtenis van neovascularisatie (MIEN) na te bootsen die hier wordt gepresenteerd, bestond uit een microfluïdische kiemchip en een microfluïdisch controlesysteem. De microfluïdische kiemchip werd geoptimaliseerd uit eerdere publicaties22,23,37,40,51,52,

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Discussie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Lange tijd was real-time observatie van neovascularisatie een probleem. Onlangs zijn verschillende benaderingen ontwikkeld om doordrenkte vaten te creëren die bekleden met EC's en grenzend aan de extracellulaire matrix voor het ontkiemen van22,32,40 ,46,54, maar het mechanische micromilieu is nog steeds moeilijk constant te onderhouden. Het blijft een moeilijk...

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Openbaarmakingen

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

De auteurs hebben niets te onthullen.

Dankbetuigingen

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Dit werk werd ondersteund door de National Natural Science Research Foundation of China Grants-in-Aid (grant nos. 11827803, 31971244, 31570947, 11772036, 61533016, U20A20390 en 32071311), Nationaal belangrijk onderzoek- en ontwikkelingsprogramma van China (subsidienr. 2016YFC1101101 en 2016YFC1102202), het 111 Project (B13003) en de Beijing Natural Science Foundation (4194079).

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel
NaamBedrijfCatalogusnummerOpmerkingen
0.25% Trypsin-EDTAGenviewGP3108
Collagen I, rat tailCorning354236
DAPISigma-AldrichD9542
Elektromagnetische knijpklepWokun TechnologyWK02-308-1/3
Endotheliaal cel medium (ECM)Sciencell1001
Fetaal bovien serum (FBS)Every GreenNA
FibronectineCorning354008
FITC-dextranMiragen60842-46-8
Grafisch programmeeromgevingLab VIEWNA
BeeldbewerkingssoftwarePhotoShopNA
BeeldverwerkingsprogrammaImageJNA
IsopropanolSigma-Aldrich91237
Lithografie apparatuurInstitute of optics and electronics, Chinese academy of sciencesURE-2000/35
MethanolSigma-Aldrich82762
Micro-peristaltische pompLead FluidBT101L
Micro-spuitpompLead FluidTYD01
ZuurstofplasmaMING HENGPDC-MG
ParaformaldehydeSigma-AldrichP6148
PBS (10x)BeyotimeST448
Permanente epoxy negatieve fotoresistorMicrochemSU-8 2075
Fenol Rood natriumzoutSigma-AldrichP5530
Polydimethylsiloxaan (PDMS)Dow CorningSylgard 184
Poly-D-lysine hydrobromide (PDL)Sigma-AldrichP7886
PolytetrafluorethyleenTeflonNA
ProgrammasoftwareMATLABNA
Recombinant Human VEGF-165StemImmune LLCHVG-VF5
Natriumhydroxide (NaOH)Sigma-Aldrich1.06498
Stage top incubatorTokai HitNA
SU-8 developerMicrochemNA
Trichloro(1H,1H,2H,2H-perfluoroctyl)silaanSigma-Aldrich448931
TRITC PhalloidinSigma-AldrichP5285

Referenties

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Potente, M., Gerhardt, H., Carmeliet, P. Basic and therapeutic aspects of angiogenesis. Cell. 146 (6), 873-887 (2011).
  2. Barger, A. C., Beeuwkes, R. D., Lainey, L. L., Silverman, K. J. Hypothesis: vasa vasorum and neovascularization of human coronary arteries. A possible role in the pathophysiology of atherosclerosis. New England Journal of Medicine. 310 (3), 175-177 (1984).
  3. Homan, K. A., et al. Flow-enhanced vascularization and maturation of kidney organoids in vitro. Nature Methods. 16 (3), 255-262 (2019).
  4. Rouwkema, J., Khademhosseini, A. Vascularization and angiogenesis in tissue engineering: beyond creating static networks. Trends in Biotechnology. 34 (9), 733-745 (2016).
  5. Carmeliet, P. M. J. Mechanisms of angiogenesis and arteriogenesis. Nature Medicine. 6 (4), 389-395 (2000).
  6. Yancopoulos, G. D., et al. Vascular-specific growth factors and blood vessel formation. Nature. 407 (6801), 242-248 (2000).
  7. Heil, M., Eitenmüller, I., Schmitz-Rixen, T., Schaper, W. Arteriogenesis versus angiogenesis: similarities and differences. Journal of Cellular and Molecular Medicine. 10 (1), 45-55 (2006).
  8. Tarbell, J. M., Demaio, L., Zaw, M. M. Effect of pressure on hydraulic conductivity of endothelial monolayers: role of endothelial cleft shear stress. Journal of Applied Physiology. 87 (1), 261(1999).
  9. Pedersen, J. A., Lichter, S., Swartz, M. A. Cells in 3D matrices under interstitial flow: Effects of extracellular matrix alignment on cell shear stress and drag forces. Journal of Biomechanics. 43 (5), 900-905 (2010).
  10. Pries, A. R., Secomb, T. W., Gaehtgens, P. Biophysical aspects of blood flow in the microvasculature. Cardiovascular Research. 32 (4), 654-667 (1996).
  11. Ballermann, B. J., Dardik, A., Eng, E., Liu, A. Shear stress and the endothelium. Kidney International. 54, 100-108 (1998).
  12. Stone, P. H., et al. Prediction of sites of coronary atherosclerosis progression: In vivo profiling of endothelial shear stress, lumen, and outer vessel wall characteristics to predict vascular behavior. Current Opinion in Cardiology. 18 (6), 458-470 (2003).
  13. Wragg, J. W., et al. Shear stress regulated gene expression and angiogenesis in vascular endothelium. Microcirculation. 21 (4), 290-300 (2014).
  14. Yoshino, D., Sakamoto, N., Sato, M. Fluid shear stress combined with shear stress spatial gradients regulates vascular endothelial morphology. Integrative Biology Quantitative Biosciences from Nano to Macro. 9 (7), 584-594 (2017).
  15. Chistiakov, D. A., Orekhov, A. N., Bobryshev, Y. V. Effects of shear stress on endothelial cells: go with the flow. Acta Physiologica. 219 (2), 382-408 (2016).
  16. Tarbell, J. M. Shear stress and the endothelial transport barrier. Cardiovascular Research. 87 (2), 320-330 (2010).
  17. Hergenreider, E., et al. Atheroprotective communication between endothelial cells and smooth muscle cells through miRNAs. Nature Cell Biology. 14 (3), 249(2012).
  18. Chien, S. Mechanotransduction and endothelial cell homeostasis: the wisdom of the cell. American Journal of Physiology Heart & Circulatory Physiology. 292 (3), 1209(2007).
  19. Qi, Y. X., et al. PDGF-BB and TGF-{beta}1 on cross-talk between endothelial and smooth muscle cells in vascular remodeling induced by low shear stress. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 108 (5), 1908-1913 (2011).
  20. Chiu, J. J., Shu, C. Effects of disturbed flow on vascular endothelium: pathophysiological basis and clinical perspectives. Physiological Reviews. 91 (1), 327-387 (2011).
  21. Tressel, S. L., Huang, R. P., Tomsen, N., Jo, H. Laminar shear inhibits tubule formation and migration of endothelial cells by an angiopoietin-2 dependent mechanism. Arteriosclerosis, Thrombosis, and Vascular Biology. 27 (10), 2150-2156 (2007).
  22. Song, J. W., Munn, L. L. Fluid forces control endothelial sprouting. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 108 (37), 15342-15347 (2011).
  23. Galie, P. A., et al. Fluid shear stress threshold regulates angiogenic sprouting. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 111 (22), 7968-7973 (2014).
  24. Pipp, F., et al. Elevated fluid shear stress enhances postocclusive collateral artery growth and gene expression in the pig hind limb. Arteriosclerosis, Thrombosis, and Vascular Biology. 24 (9), 1664-1668 (2004).
  25. Islam, M. M., Beverung, S., Steward, R. Bio-Inspired Microdevices that Mimic the Human Vasculature. Micromachines (Basel. 8 (10), (2017).
  26. Warren, K. M., Islam, M. M., Leduc, P. R., Steward, R. 2D and 3D mechanobiology in human and nonhuman systems. ACS Applied Materials & Interfaces. 8 (34), 21869(2016).
  27. Pellegata, A. F., Tedeschi, A. M., De Coppi, P. Whole organ tissue vascularization: engineering the tree to develop the fruits. Front Bioeng Biotechnol. 6, 56(2018).
  28. Nguyen, D. H., et al. Biomimetic model to reconstitute angiogenic sprouting morphogenesis in vitro. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 110 (17), 6712-6717 (2013).
  29. Osaki, T., Sivathanu, V., Kamm, R. D. Crosstalk between developing vasculature and optogenetically engineered skeletal muscle improves muscle contraction and angiogenesis. Biomaterials. 156, 65-76 (2018).
  30. Ribas, J., et al. Biomechanical strain exacerbates inflammation on a progeria-on-a-chip model. Small. 13 (15), 1603737(2017).
  31. Song, J. W., Bazou, D., Munn, L. L. Anastomosis of endothelial sprouts forms new vessels in a tissue analogue of angiogenesis. Integrative Biology Quantitative Biosciences from Nano to Macro. 4 (8), 857-862 (2012).
  32. Kim, J., et al. Engineering of a Biomimetic Pericyte-Covered 3D Microvascular Network. PLoS One. 10 (7), 0133880(2015).
  33. Divito, K. A., Daniele, M. A., Roberts, S. A., Ligler, F. S., Adams, A. A. Microfabricated blood vessels undergo neoangiogenesis. Biomaterials. 138, 142-152 (2017).
  34. Lee, V. K., et al. Creating perfused functional vascular channels using 3D bio-printing technology. Biomaterials. 35 (28), 8092(2014).
  35. Buchanan, C. F., Verbridge, S. S., Vlachos, P. P., Rylander, M. N. Flow shear stress regulates endothelial barrier function and expression of angiogenic factors in a 3D microfluidic tumor vascular model. Cell Adhesion & Migration. 8 (5), 517-524 (2014).
  36. Jr, S. R., Tambe, D., Hardin, C. C., Krishnan, R., Fredberg, J. J. Fluid shear, intercellular stress, and endothelial cell alignment. American Journal of Physiology Cell Physiology. 308 (8), 657(2015).
  37. Kim, S., Chung, M., Ahn, J., Lee, S., Jeon, N. L. Interstitial flow regulates the angiogenic response and phenotype of endothelial cells in a 3D culture model. Lab on A Chip. , 4189-4199 (2016).
  38. Shirure, V. S., Lezia, A., Tao, A., Alonzo, L. F., George, S. C. Low levels of physiological interstitial flow eliminate morphogen gradients and guide angiogenesis. Angiogenesis. (6801), 1-12 (2017).
  39. Bazou, D., et al. Flow-induced HDAC1 phosphorylation and nuclear export in angiogenic sprouting. Scientific Reports. 6, 34046(2016).
  40. Vickerman, V., Kamm, R. D. Mechanism of a flow-gated angiogenesis switch: early signaling events at cell-matrix and cell-cell junctions. Integrative Biology Quantitative Biosciences from Nano to Macro. 4 (8), 863(2012).
  41. Song, J., et al. Microfluidic platform for single cell analysis under dynamic spatial and temporal stimulation. Biosens Bioelectron. 104, 58-64 (2018).
  42. Jeong, G. S., et al. Sprouting angiogenesis under a chemical gradient regulated by interactions with an endothelial monolayer in a microfluidic platform. Analytical Chemistry. 83 (22), 8454-8459 (2011).
  43. Steward, R. L., Tan, C., Cheng, C. M., Leduc, P. R. Cellular force signal integration through vector logic Gates. Journal of Biomechanics. 48 (4), (2015).
  44. Jing, Z., Niklason, L. E. Microfluidic artificial "vessels" for dynamic mechanical stimulation of mesenchymal stem cells. Integrative Biology Quantitative Biosciences from Nano to Macro. (12), 1487-1497 (2012).
  45. Zheng, W., et al. A microfluidic flow-stretch chip for investigating blood vessel biomechanics. Lab on A Chip. 12 (18), 3441-3450 (2012).
  46. Buchanan, C. F., et al. Three-dimensional microfluidic collagen hydrogels for investigating flow-mediated tumor-endothelial signaling and vascular organization. Tissue Engineering Part C Methods. 20 (1), 64(2014).
  47. Pries, A. R., Secomb, T. W., Gaehtgens, P. Biophysical aspects of blood flow in the microvasculature. Cardiovascular Research. 32 (4), 654-667 (1996).
  48. Zhao, P., et al. Flow shear stress controls the initiation of neovascularization via heparan sulfate proteoglycans within biomimic microfluidic model. Lab on A Chip. 21, 421-434 (2021).
  49. Yamamura, N., Sudo, R., Ikeda, M., Tanishita, K. Effects of the mechanical properties of collagen gel on the in vitro formation of microvessel networks by endothelial cells. Tissue Engineering. 13 (7), 1443(2007).
  50. Huxley, V. H., Curry, F. E., Adamson, R. H. Quantitative fluorescence microscopy on single capillaries: alpha-lactalbumin transport. American Journal of Physiology. 252 (1), Pt 2 188(1987).
  51. Kim, S., Lee, H., Chung, M., Jeon, N. L. Engineering of functional, perfusable 3D microvascular networks on a chip. Lab on A Chip. 13 (8), 1489-1500 (2013).
  52. Campisi, M., et al. 3D self-organized microvascular model of the human blood-brain barrier with endothelial cells, pericytes and astrocytes. Biomaterials. 180, 117-129 (2018).
  53. Polacheck, W. J., et al. A non-canonical Notch complex regulates adherens junctions and vascular barrier function. Nature. 552 (7684), 258-262 (2017).
  54. Nguyen, D. H., et al. Biomimetic model to reconstitute angiogenic sprouting morphogenesis in vitro. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 110 (17), 6712-6717 (2013).
  55. Huang, C. P., et al. Engineering microscale cellular niches for three-dimensional multicellular co-cultures. Lab on A Chip. 9 (12), 1740-1748 (2009).
  56. Chung, M., Ahn, J., Son, K., Kim, S., Jeon, N. L. Biomimetic model of tumor microenvironment on microfluidic platform. Advanced Healthcare Materials. 6 (15), (2017).
  57. Kakisis, J., Liapis, C., Sumpio, B. Effects of cyclic strain on vascular cells. Endothelium. 11 (1), 17-28 (2004).
  58. Charoenpanich, A., et al. Cyclic tensile strain enhances osteogenesis and angiogenesis in mesenchymal stem cells from osteoporotic donors. Tissue Engineering Part A. 20 (1-2), 67-78 (2014).
  59. Narimiya, T., et al. Orthodontic tensile strain induces angiogenesis via type IV collagen degradation by matrix metalloproteinase. Journal of Periodontal Research. 52 (5), (2017).

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Herprints en machtigingen

Toestemming aanvragen om de tekst of afbeeldingen van dit JoVE-artikel te hergebruiken

Toestemming aanvragen

Trefwoorden

Mechanisme van neovascularisatieendotheelcellenmicroflu dische sprouting chipschuifspanningtransendotheliale flowvasculaire endotheliale groeifactorperfuseerbaar microkanaalendotheel sprouting assayplatform voor drugscreening

Gerelateerde artikelen