Etikettering en visualisatie van Mitochondriale genoomexpressieproducten in Baker's Yeast Saccharomyces cerevisiae

Summary

Baker's gist mitochondriaal genoom codeert voor acht polypeptiden. Het doel van het huidige protocol is om ze allemaal te labelen en ze vervolgens als afzonderlijke banden te visualiseren.

Abstract

Mitochondriën zijn essentiële organellen van eukaryotische cellen die in staat zijn tot aërobe ademhaling. Ze bevatten cirkelvormige genoom- en genexpressieapparatuur. Een mitochondriaal genoom van bakkersgist codeert voor acht eiwitten: drie subeenheden van de cytochroom c oxidase (Cox1p, Cox2p, en Cox3p), drie subeenheden van de ATP-synthase (Atp6p, Atp8p en Atp9p), een subeenheid van het ubiquinol-cytochrome c oxidoreductase-enzym, cytochroom b (Cytb) en mitochondriaal ribosomaal eiwit Var1p. Het doel van de hier beschreven methode is om deze eiwitten specifiek te labelen met ³⁵S methionine, ze te scheiden door elektroforese en de signalen te visualiseren als discrete banden op het scherm. De procedure omvat verschillende stappen. Ten eerste worden gistcellen gekweekt in een galactosebevattend medium totdat ze de late logaritmische groeifase bereiken. Vervolgens blokkeert cycloheximidebehandeling cytoplasmatische vertaling en staat ³⁵S methionine-integratie alleen toe in mitochondriale vertaalproducten. Vervolgens worden alle eiwitten geëxtraheerd uit gistcellen en gescheiden door polyacrylamide gelelektroforese. Ten slotte wordt de gel gedroogd en geïncubeerd met het opslagfosforscherm. Het scherm wordt gescand op een fosforimager die de banden onthult. De methode kan worden toegepast om de biosynthesesnelheid van een enkel polypeptide in de mitochondriën van een mutante giststam te vergelijken met het wilde type, wat nuttig is voor het bestuderen van mitochondriale genexpressiedefecten. Dit protocol geeft waardevolle informatie over de vertaalsnelheid van alle gist mitochondriale mRNA's. Het vereist echter verschillende controles en aanvullende experimenten om goede conclusies te trekken.

Introduction

Mitochondriën zijn de organellen die nauw betrokken zijn bij het metabolisme van een eukaryotische cel. Hun elektronenoverdrachtsketen voorziet de cel van ATP, de belangrijkste energetische valuta die wordt gebruikt in meerdere biochemische paden. Bovendien zijn ze betrokken bij apoptose, vetzuur- en heemsynthese en andere processen. Disfunctie van mitochondriën is een bekende bron van menselijke ziekte¹. Het kan het gevolg zijn van mutaties in nucleaire of mitochondriale genen die coderen voor structurele of regulerende componenten van organellen². Baker's gist Saccharomyces cerevisiae is om verschillende redenen een uitstekend modelorganisme voor het bestuderen van mitochondriale genexpressie. Ten eerste is hun genoom volledig^{gesequentieerd 3}, goed geannoteerd, en een grote som gegevens is al beschikbaar in de literatuur dankzij de lange geschiedenis van onderzoeken uitgevoerd met dit organisme. Ten tweede zijn de manipulaties met hun nucleaire genoom relatief snel en gemakkelijk vanwege hun snelle groeisnelheid en zeer efficiënt homologe recombinatiesysteem. Ten derde is bakkersgist S. cerevisiae een van de weinige organismen waarvoor de manipulaties met mitochondriale genomen zijn ontwikkeld. Ten slotte is bakkersgist een aerobe-anaerobe facultatief organisme, dat isolatie en studie van respiratoire defecte mutanten mogelijk maakt, omdat ze kunnen groeien in media die fermenteerbare koolstofbronnen bevatten.

We beschrijven de methode om mitochondriale genexpressie van bakkersgist S. cerevisiae op translationeel niveau 4 te^bestuderen. Het belangrijkste principe komt uit verschillende observaties. Ten eerste codeert het gist mitochondriale genoom slechts acht eiwitten: drie subeenheden van de cytochroom c oxidase (Cox1p, Cox2p, en Cox3p), drie subeenheden van de ATP-synthase (Atp6p, Atp8p en Atp9p), een subeenheid van het ubiquinol-cytochrome c oxidoreductase-enzym, cytochroom b (Cytb) en mitochondriaal ribosomaal eiwit Var1p⁵. Dit aantal is klein en ze kunnen allemaal worden gescheiden door elektroforese op een enkele gel in de juiste omstandigheden. Ten tweede behoren mitochondriale ribosomen tot de prokaryotische klasse in plaats van eukaryotisch⁶, en daarom is de gevoeligheid voor antibiotica anders voor gistcytoplasmatische en mitochondriale ribosomen. Het maakt de remming van cytoplasmatische vertaling met cycloheximide mogelijk, op voorwaarde dat de omstandigheden waarin het gelabelde aminozuur (³⁵S-methionine) alleen in mitochondriale vertaalproducten is opgenomen. Als gevolg hiervan geeft het experiment informatie over de snelheid van aminozuurincorporatie in mitochondriale eiwitten gesynthetiseerd de novo, wat de algehele efficiëntie van mitochondriale vertaling voor elk van de acht producten weerspiegelt

Protocol

1. Gistkweekbereiding

1. Streepgist uit de bevroren stamculturen op verse borden met het juiste medium. Doe de platen 24-48 uur in een kweekincubator bij 30 °C.
   OPMERKING: Laat de temperatuurgevoelige mutanten groeien bij de toegestane temperatuur.
2. Ent gistculturen in 2 ml YPGal medium (2% pepton, 1% gistextract, 2% galactose) uit de verse streep in 15 ml buizen en incubeer ze 's nachts roeren bij 200 tpm bij 30 °C.
3. Meet de optische dichtheid van de cultuur bij een golflengte van 600 nm (OD₆₀₀).
4. Neem het volume dat overeenkomt met 0,2 absorptie-eenheden in steriele buizen, pelletgistcellen bij 9.000 x g gedurende 30 s bij kamertemperatuur en gooi het supernatant weg.
5. Was cellen met 0,5 ml steriel water door 5 s te vortexen. Pelletgistcellen bij 9.000 x g gedurende 30 s bij kamertemperatuur en gooi het supernatant weg. Verdun cellen in 2 ml vers YPGal medium.
6. Incubeer roeren bij 200 tpm en 30 °C tot OD₆₀₀ 1,5–1,9 waarden bereikt.
   OPMERKING: De groeipercentages van gist variëren, dus wees voorbereid om te wachten. Het is redelijk om vroeg in de ochtend stappen 1.3-1.6 te maken. Het duurt meestal 4-5 uur, maar kan langer duren.

2. Radioactieve isotoop-integratie

1. Breng het kweekvolume gelijk aan één optische eenheid over in een microcentrifugebuis. Draai de buizen 1 minuut op 3.000 x g en gooi de supernatant weg. Was met 0,5 ml steriel water door 5 s te vortexen.
   1. Pelletgistcellen bij 9.000 x g gedurende 30 s bij kamertemperatuur en gooi het supernatant weg. Resuspend gistcellen in 0,5 ml steriele vertaalbuffer. Plaats de suspensie in een buis van 15 ml.
      OPMERKING: Vertaalbuffer is een oplossing die 2% galactose (w/v) en 50 mM kaliumfosfaat met pH 6,0 bevat.
2. Voeg cycloheximide toe aan celsuspensie tot een uiteindelijke concentratie van 0,2 mg/ml. Incubeer gedurende 5 minuten roeren bij 200 tpm en 30 °C om cytosolische vertaling te remmen.
   OPMERKING: Cycloheximide-oplossing (20 mg/ml, in ethanol) moet vóór het experiment vers worden bereid. Chlooramfenicol kan met succes worden vervangen door anisomycine in dezelfde concentratie⁷.
3. Voeg 25–30 μCi ³⁵S-methionine toe aan de celsuspensie en incubeer gedurende 30 minuten roeren bij 200 tpm en 30 °C.
   OPMERKING: Het mengsel van ³⁵S-methionine en ³⁵S-cysteïne kan ook worden gebruikt. Pure ³⁵S-methionine resulteert in het sterkste signaal en de beste signaal-ruisverhouding. Over het algemeen is methionine effectiever dan cysteïne omdat het gehalte aan dit aminozuur in mitochondriale eiwitten hoger is. Het EasyTag-mengsel van ³⁵S-methionine en cysteïne is echter goedkoper en geeft vergelijkbare resultaten⁷.
   LET OP: ³⁵S-methionine is radioactief. Volg de gebruikelijke veiligheidspraktijken voor het omgaan met radioactieve materialen.
   OPMERKING: Het is algemeen bekend dat de integratie van radioactiviteit een limiet bereikt waardoor het totale signaal in de loop van de tijd afvlakt. Zodra deze limiet is bereikt, is het bijna onmogelijk om de snelheid te bepalen waarmee de verschillende vertaalproducten worden gesynthetiseerd. Om de snelheid van mitochondriale vertaling te analyseren, is het noodzakelijk om in een toestand te verkeren waarin de signaalintensiteit toeneemt met de tijd van incubatie met ³⁵S-methionine op een lineaire manier. Voor gewone wildstammen in het laboratorium is het signaal al verzadigd voor incubatietijden die veel korter zijn dan de 30 minuten. Translationele mutanten kunnen zich heel anders gedragen. Er moet een tijdscursus worden gevolgd om de kinetiek van radioactiviteitsing en dus de vertaalsnelheid vast te stellen, althans bij het werken met een nieuwe stam. Hiervoor raden we aan monsters te nemen met een interval van enkele minuten (bijv. 2,5, 5,0, 7,5, 10 en 20 minuten).
4. Voeg ongelabelde "koude" methionine (eindconcentratie moet 20 mM zijn) en puromycine (eindconcentratie moet 1–10 μg/ml zijn) toe om de etikettering te stoppen. Incubeer gedurende 10 minuten roeren bij 200 tpm en 30 °C.
   OPMERKING: Deze stap is van cruciaal belang om ribosomen de tijd te geven om de peptiden te vertalen. Anders worden alle polypeptiden korter dan de volledige lengte gedetecteerd op een andere grootte. Een tijdcursusexperiment (pulse-chase) kan in deze stap worden gedaan om de stabiliteit van mitochondriale vertaalproducten te bepalen. Ga hiervoor verder met het nemen van incubatiemonsters met een interval van 30 minuten (bijv. 30, 60, 90 en 120 min).

3. Gistcellyse en extractie van eiwitten

1. Verzamel gistcellen door centrifugatie bij 9.000 x g gedurende 30 s. Was de cellen met 0,5 ml steriel water door 5 s te vortexen. Pelletgistcellen bij 9.000 x g gedurende 30 s bij kamertemperatuur. Gooi de supernatant weg.
   Opmerking. Het protocol kan hier worden gepauzeerd. Bewaar de monsters bij -20 °C.
2. Voeg 75 μL lysisbuffer toe aan de pellet en vortex gedurende 5-10 s.
   OPMERKING: Lysis buffer is een oplossing van 1,8 M NaOH, 1 M β-mercaptoethanol en 1 mM PMSF in water. Vermijd overmatige incubatie met lysisbuffer die leidt tot alkalische hydrolyse van eiwitten. Ga onmiddellijk verder met stap 3.3.
3. Voeg 500 μL van 0,5 M Tris-HCl buffer met pH 6,8 toe. Vortex kort.

4. Neerslag van eiwitten

LET OP: Methanol en chloroform zijn organische oplosmiddelen. Volg de gebruikelijke veiligheidspraktijken voor het omgaan met organische stoffen.

1. Voeg 600 μL methanol toe aan het monster. Vortex voor 5 s.
2. Voeg 150 μL chloroform toe aan het monster. Vortex voor 5 s.
3. Centrifugeer de monsters gedurende 2 minuten bij 12.000 x g. Gooi de bovenste fase voorzichtig weg met een sampler.
4. Voeg 600 μL methanol toe aan het monster. Meng voorzichtig door de buis meerdere keren om te keren.
5. Centrifugeer de monsters gedurende 2 minuten bij 12.000 x g. Gooi de supernatant weg.
6. Droog de pellet 2 minuten aan de lucht bij 80 °C.
   OPMERKING: Alle vloeistof moet verdampen. Er bestaat een risico op een afwijkende scheiding van eiwitten in de gel als de pellet onvoldoende is gedroogd. Het is echter niet mogelijk om de pellet te drogen, dus het kan zelfs 's nachts bij 4 °C worden bewaard.
7. Los neergeslagen eiwitten op in 60 μL 1x Laemmli monsterbuffer.
8. Verwarm gedurende 10 min bij 40 °C.
   OPMERKING: Vermijd het koken van de monsters bij 95 °C, omdat dit aggregatie veroorzaakt. Als de aggregaten zich nog vormen, draait u de monsters gedurende 2 minuten op 12.000 x g en verzamelt u het supernatant. Monsters kunnen worden opgeslagen bij -20 °C. Het protocol kan hier worden gepauzeerd.

5. SDS-PAGINA

1. Giet de 17,5% Laemmli SDS-polyacrylamide gel.
   OPMERKING: 6 M ureum kan aan de gel worden toegevoegd om betere atp8 en atp9 op te lossen. Gradiënt 15%-20% gels kunnen ook een betere resolutie geven.
2. Laad 15 μL (40–50 μg) van elk monster in de zakken.
   OPMERKING: Het is niet nodig om de eiwitconcentratie te meten als de OD_600-waarden in stap 1.6 dicht bij elkaar lagen. Zo niet, meet dan de eiwitconcentraties met behulp van de test met wasmiddelcompatibele reagentia.
3. Voer de gel in een koude ruimte uit tot de blauwe kleurstof ongeveer 65% van de gellengte bereikt.
   OPMERKING: Voor het gebruikte systeem (bijv. Protean II xi-cel) gebruiken we een van de twee modi: 16-17 uur bij 5 V/cm of 5 uur bij 15 V/cm. Geen eiwitten lopen sneller dan de bromophenol blauwe kleurstof, maar lange runs kunnen leiden tot vervaging van atp8- en atp9-signalen.
4. Beits de gel met Coomassie briljant blauw en maak een scan of foto, die nodig is als laadcontrole.
   OPMERKING: Een alternatieve manier om een belastingsregeling te maken is immunoblotting met een antilichaam tegen mitochondriaal "huishouding" gen, bijvoorbeeld porine 1.

6. Autoradiografie

1. Droog de gel in een geldroger. Bewaar het 3-5 dagen in de cassette met een opbergfosforscherm.
   OPMERKING: Een alternatief voor het screenen van de gedroogde gel is de overdracht van eiwitten naar een nitrocellulosemembraan door het daarna te elektrovlekken en te screenen. Het resulteert in sterkere signalen en scherpere banden.
2. Scan het scherm op een fosforimager.
   OPMERKING: Als alternatief voor fosforbeeldvorming kan röntgenfilm ook worden gebruikt om de signalen te onthullen.

Results

Volgens het hierboven beschreven protocol hebben we mitochondriale vertaalproducten toegewezen van twee S. cerevisiae stammen: het wilde type (WT) en een mutante dragende deletie van het AIM23-gen (AIM23Δ), dat codeert voor mitochondriale vertalingsinitiatiefactor 3 (tabel 1)⁸. Mitochondriale vertaalproducten werden radioactief geëtiketteerd en gescheiden in SDS-PAAG9. De monsters werden elke 2,5 minuut vóór verzadiging verzameld om een tijdscur...

Discussion

Onderzoeken naar genexpressie spelen een centrale rol in de moderne levenswetenschappen. Er zijn tal van methoden ontwikkeld die inzicht geven in dit complexe proces. Hier beschreven we de methode die toegang geeft tot eiwitbiosynthese in bakkersgist S. cerevisiae mitochondriën. Het wordt meestal toegepast om vertaalefficiënties van de mRNA's in mitochondriën van mutante giststam versus wild type te vergelijken om toegang te krijgen tot de gevolgen van de bestudeerde mutatie. Dit is een van de basisexperimenten ...

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
2-Mercaptoethanol	Sigma-Aldrich	M3148
Acrylamide	Sigma-Aldrich	A9099
Ammonium persulfate	Sigma-Aldrich	A3678
Bacteriologische agar	Sigma-Aldrich	A5306
Biowave Cell Density Meter CO8000	BIOCHROM US BE	80-3000-45
BRAND standaard wegwerp cuvettes	Sigma-Aldrich	Z330361
Chloroform	Sigma-Aldrich	288306
Cycloheximide	Sigma-Aldrich	C1988
D-(+)-Galactose	Sigma-Aldrich	G5388
D-(+)-Glucose	Sigma-Aldrich	G7021
Digitale blok verwarmer	Thermo Scientific	88870001
EasyTag L-[35S]-Methionine, 500µCi (18.5MBq), Gestabiliseerde waterige oplossing	Perkin Elmer	NEG709A500UC
Eppendorf Centrifuge 5425	Thermo Scientific	13-864-457
GE Storage Phosphor Screens	Sigma-Aldrich	GE29-0171-33
L-methionine	Sigma-Aldrich	M9625
Methanol	Sigma-Aldrich	34860
N,N,N′,N′-Tetramethylethyleendiamine	Sigma-Aldrich	T9281
N,N′-Methylenebisacrylamide	Sigma-Aldrich	M7279
New Brunswick Innova 44/44R Shaker Incubator	New Brunswick Scientific
Pepton van vlees, bacteriologisch	Millipore	91249
Fenylmethanesulfonyl fluoride	Sigma-Aldrich	P7626
Pierce 660nm Protein Assay Kit	Thermo Scientific	22662
PowerPac Basic Power Supply	Bio-Rad	1645050
Protean II xi cel	Bio-Rad	1651802
Puromycin dihydrochloride van Streptomyces alboniger	Sigma-Aldrich	P8833
Natriumhydroxide	Sigma-Aldrich	221465
Storm 865 fosfor imager	GE Healthcare
Trizma base	Sigma-Aldrich	93352
Vacuum verwarmde geldroger	Cleaver Scientific	CSL-GDVH
Gist extract	Sigma-Aldrich	Y1625