Immunofluorescentie gebruiken om PM2.5-geïnduceerdeDNA-schade in zebravisembryoharten te detecteren

Samenvatting

Dit protocol maakt gebruik van een immunofluorescentietest om PM_{2,5-geïnduceerde}DNA-schade in de ontlede harten van zebravisembryo's te detecteren.

Samenvatting

Blootstelling aan fijnstof in de omgeving (PM_2,5)kan leiden tot cardiale ontwikkelingstoxiciteit, maar de onderliggende moleculaire mechanismen zijn nog onduidelijk. 8-hydroxy-2'deoxygenase (8-OHdG) is een marker van oxidatieve DNA-schade en γH2AX is een gevoelige marker voor DNA-dubbelstrengsbreuken. In deze studie wilden we PM_{2,5-geïnduceerde}8-OHdG- en γH2AX-veranderingen in het hart van zebravisembryo's detecteren met behulp van een immunofluorescentietest. Zebravisembryo's werden behandeld met extraheerbare organische stoffen (EOM) van PM_2,5 bij 5 μg / ml in de aan- of afwezigheid van antioxidant N-acetyl-L-cysteïne (NAC, 0,25 μM) 2 uur na bevruchting (hpf). DMSO werd gebruikt als voertuigbesturing. Bij 72 hpf werden harten met behulp van een spuitnaald van embryo's ontleed en gefixeerd en gepermeabiliseerd. Na te zijn geblokkeerd, werden monsters onderzocht met primaire antilichamen tegen 8-OHdG en γH2AX. Monsters werden vervolgens gewassen en geïncubeerd met secundaire antilichamen. De resulterende beelden werden waargenomen onder fluorescentiemicroscopie en gekwantificeerd met behulp van ImageJ. De resultaten tonen aan dat EOM van PM_2.5 8-OHdG- en γH2AX-signalen in het hart van zebravisembryo's aanzienlijk verbeterde. NAC, dat optrad als een reactieve zuurstofsoort (ROS) aaseter, ging de door EOM geïnduceerde DNA-schade echter gedeeltelijk tegen. Hier presenteren we een immunofluorescentieprotocol voor het onderzoeken van de rol van DNA-schade in PM_{2.5-geïnduceerde}hartafwijkingen die kunnen worden toegepast op de detectie van door chemicaliën geïnduceerde eiwitexpressieveranderingen in de harten van zebravisembryo's.

Inleiding

Luchtvervuiling is nu een ernstig milieuprobleem waarmee de wereld wordt geconfronteerd. Fijnstof in de omgeving (PM_2,5), een van de belangrijkste indicatoren van de luchtkwaliteit, kan een groot aantal schadelijke stoffen vervoeren en de bloedsomloop binnendringen, waardoor de menselijke gezondheid ernstig wordt geschaad¹. Epidemiologische studies hebben aangetoond dat blootstelling aan PM_2,5 kan leiden tot een verhoogd risico op aangeboren hartafwijkingen (CHD's)^2,3. Bewijs uit dierproeven toonde ook aan dat PM_2,5 abnormale cardiale ontwikkeling kan ve....

Protocol

Wild type zebravissen (AB) die in deze studie werden gebruikt, werden verkregen van het National Zebrafish Resource Center in Wuhan, China. Alle dierprocedures die hier worden beschreven, zijn beoordeeld en goedgekeurd door de Animal Care Institution van de ethische commissie van Soochow University.

1. PM_{2,5-bemonstering} en extractie van organische verbindingen

OPMERKING: PM_2.5 werd verzameld in een stedelijk gebied in Suzhou, China, 1-7 augustus 2015, zoals eerder beschreven⁵.

1. Bak 47 mm kwartsmembraanfilters gedurende 2 uur in een 500 °C dempingsoven om de ....

Resultaten

Deze immunofluorescentietest is een gevoelige en specifieke methode voor het meten van eiwitexpressieveranderingen in de harten van zebravisembryo's die zijn blootgesteld aan milieuchemicaliën.

In deze representatieve analyse werden embryo's blootgesteld aan PM_2,5 in afwezigheid of aanwezigheid van de antioxidant NAC geëvalueerd op de aanwezigheid van hartmisvormingen(figuur 1). Zoals waa.......

Discussie

Hoewel zebravis een uitstekend gewerveld model is voor het bestuderen van de cardiale ontwikkelingstoxiciteit van milieuchemicaliën, is het vanwege de kleine omvang van het embryohart moeilijk om voldoende eiwit te verkrijgen voor western blot-analyse. Daarom presenteren we een gevoelige immunofluorescentiemethode voor het kwantificeren van de eiwitexpressieniveaus van DNA-schadebiomarkers in de harten van zebravisembryo's die zijn blootgesteld aan PM_2.5.

Tijdens dissectie is het be.......

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel

Naam	Bedrijf	Catalogusnummer	Opmerkingen
8-OHdG Antibody	Santa Cruz Biotechnology, USA	sc-66036	Primair antilichaam
Analytische balans	Sartorius, China	BSA124S
BSA	Solarbio, Beijing, China	SW3015	Voor blokkering
DAPI	Abcam, USA	ab104139	Voor nucleaire tegenkleuring.
DMSO	Solarbio, Beijing, China	D8371
Fluorescentiemicroscoop	Olympus, Japan	IX73	Voor het beeldvormen van fluorescentiesignalen/
Geit Anti-Konijn IgG Cy3	Carlsbad, USA	CW0159	Secundair antilichaam
Geit Anti-Konijn IgG FITC	Carlsbad, USA	RS0003	Secundair antilichaam
N-Acetyl-L-cysteïne (NAC)	Adamas-Beta, Shanghai, China	616-91-1
Orbitale shaker	QILINBEIER, China	TS-1
Paraformaldehyde	Sigma, China	P6148	Maak 4% paraformaldehyde voor fixatie.
Fosfaat Buffered Saline	HyClone, USA	SH30256.01	Bereid 0,1% Tween in PBS voor wassen.
PM2.5 sampler	TianHong, Wuhan, China	TH-150C	Voor 24-uur ononderbroken PM2.5 bemonstering.
Re-circulerend aquacultuursysteem	HaiSheng, Shanghai, China		De zebravis werd erin onderhouden.
Soxhlet extractor	ZhengQiao, Shanghai, China	BSXT-02	Voor extractie van organische componenten.
Stereomicroscoop	Nikon, Canada	SMZ645	Voor hartdissectie van zebravisembryo's.
Tricaine methaansulfonaat (MS222)	Sigma, China	E10521	Om zebravisembryo's te verdoven
Tween 20	Sigma, China	P1379
γH2AX Antilichaam	Abcam, USA	ab26350	Primair antilichaam