Methodenartikel

Immunofluorescentie gebruiken om PM2.5-geïnduceerdeDNA-schade in zebravisembryoharten te detecteren

DOI:

10.3791/62021

⸱

15 februari 2021

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1School of Public Health, Soochow University, 2Toxicology, Risk Assessment and Research Division, Texas Commission on Environmental Quality

* These authors contributed equally

In dit artikel

Samenvatting

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Dit protocol maakt gebruik van een immunofluorescentietest om PM2,5-geïnduceerdeDNA-schade in de ontlede harten van zebravisembryo's te detecteren.

Samenvatting

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Blootstelling aan fijnstof in de omgeving (PM2,5)kan leiden tot cardiale ontwikkelingstoxiciteit, maar de onderliggende moleculaire mechanismen zijn nog onduidelijk. 8-hydroxy-2'deoxygenase (8-OHdG) is een marker van oxidatieve DNA-schade en γH2AX is een gevoelige marker voor DNA-dubbelstrengsbreuken. In deze studie wilden we PM2,5-geïnduceerde8-OHdG- en γH2AX-veranderingen in het hart van zebravisembryo's detecteren met behulp van een immunofluorescentietest. Zebravisembryo's werden behandeld met extraheerbare organische stoffen (EOM) van PM2,5 bij 5 μg / ml in de aan- of afwezigheid van antioxidant N-acetyl-L-cysteïne (NAC, 0,25 μM) 2 uur na bevruchting (hpf). DMSO werd gebruikt als voertuigbesturing. Bij 72 hpf werden harten met behulp van een spuitnaald van embryo's ontleed en gefixeerd en gepermeabiliseerd. Na te zijn geblokkeerd, werden monsters onderzocht met primaire antilichamen tegen 8-OHdG en γH2AX. Monsters werden vervolgens gewassen en geïncubeerd met secundaire antilichamen. De resulterende beelden werden waargenomen onder fluorescentiemicroscopie en gekwantificeerd met behulp van ImageJ. De resultaten tonen aan dat EOM van PM2.5 8-OHdG- en γH2AX-signalen in het hart van zebravisembryo's aanzienlijk verbeterde. NAC, dat optrad als een reactieve zuurstofsoort (ROS) aaseter, ging de door EOM geïnduceerde DNA-schade echter gedeeltelijk tegen. Hier presenteren we een immunofluorescentieprotocol voor het onderzoeken van de rol van DNA-schade in PM2.5-geïnduceerdehartafwijkingen die kunnen worden toegepast op de detectie van door chemicaliën geïnduceerde eiwitexpressieveranderingen in de harten van zebravisembryo's.

Inleiding

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Luchtvervuiling is nu een ernstig milieuprobleem waarmee de wereld wordt geconfronteerd. Fijnstof in de omgeving (PM2,5), een van de belangrijkste indicatoren van de luchtkwaliteit, kan een groot aantal schadelijke stoffen vervoeren en de bloedsomloop binnendringen, waardoor de menselijke gezondheid ernstig wordt geschaad1. Epidemiologische studies hebben aangetoond dat blootstelling aan PM2,5 kan leiden tot een verhoogd risico op aangeboren hartafwijkingen (CHD's)2,3. Bewijs uit dierproeven toonde ook aan dat PM2,5 abnormale cardiale ontwikkeling kan veroorzaken bij zebravisembryo's en de nakomelingen van muizen, maar de moleculaire mechanismen van de cardiale ontwikkelingstoxiciteit van PM2,5 zijn nog grotendeels onbekend4,5,6.

DNA-schade kan celcyclusstilstand veroorzaken en apoptose veroorzaken, die het potentieel van voorlopercellen op grote schaal kan vernietigen en bijgevolg de hartontwikkeling kan schaden7). Het is goed gedocumenteerd dat milieuverontreinigende stoffen, waaronder PM2.5, het potentieel hebben om DNA aan te vallen via oxidatieve stressmechanismen8,9. Zowel de hartontwikkeling van mens als zebravis zijn gevoelig voor oxidatieve stress10,11,12. 8-OHdG is een oxidatieve DNA-schademarker en het γH2AX-signaal is een marker van DNA-dubbelstrengsbreuken. N-acetyl-L-cysteïne (NAC), een synthetische voorloper van intracellulaire cysteïne en glutathion, wordt veel gebruikt als een anti-oxidatieve verbinding. In deze studie gebruiken we NAC om de rol van oxidatieve stress in PM2.5- geïnduceerde DNA-schade13te onderzoeken.

Zebravis als modelgewerveld dier is op grote schaal gebruikt om cardiale ontwikkeling en menselijke hart- en vaatziekten te bestuderen, omdat mechanismen van cardiale ontwikkeling zeer geconserveerd zijn bij gewervelde dieren14,15. De voordelen van het gebruik van zebravissen als model zijn hun kleine formaat, sterk voortplantingsvermogen en lage voedingskosten. Van bijzonder belang voor deze studies, zebravisembryo's zijn niet afhankelijk van de bloedsomloop tijdens de vroege ontwikkeling en kunnen ernstige hartmisvorming overleven14. Bovendien maakt hun transparantie het mogelijk om het hele lichaam direct onder een microscoop te observeren. Zebravisembryo's bieden dus een uitstekende gelegenheid voor het beoordelen van de moleculaire mechanismen die betrokken zijn bij de inductie van cardiale ontwikkelingstoxiciteit als gevolg van blootstelling aan verschillende milieuchemicaliën5,16,17. We hebben eerder gemeld dat PM2.5-geïnduceerde oxidatieve stress leidt tot DNA-schade en apoptose, wat resulteert in hartmisvormingen bij zebravissen18. In deze studie bieden we een gedetailleerd protocol voor het onderzoeken van PM2.5-geïnduceerdeDNA-schade in het hart van zebravisembryo's.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Wild type zebravissen (AB) die in deze studie werden gebruikt, werden verkregen van het National Zebrafish Resource Center in Wuhan, China. Alle dierprocedures die hier worden beschreven, zijn beoordeeld en goedgekeurd door de Animal Care Institution van de ethische commissie van Soochow University.

1. PM2,5-bemonstering en extractie van organische verbindingen

OPMERKING: PM2.5 werd verzameld in een stedelijk gebied in Suzhou, China, 1-7 augustus 2015, zoals eerder beschreven5.

  1. Bak 47 mm kwartsmembraanfilters gedurende 2 uur in een 500 °C dempingsoven om de organische componenten te verwijderen.
  2. Plaats een filter in een PM2.5 sampler voor 24 uur ononderbroken bemonstering.
  3. Verwijder het filter en droog gedurende 24 uur bij kamertemperatuur.
  4. Kwantificeer het filter met een analytische balans.
  5. Extraheer organische componenten uit het filter door Soxhlet-extractie met dichloormethaan als oplosmiddel19.
  6. Droog de EOM door een roterende verdamping in een waterbad van 60 °C en stikstofstroom. Los EOM op in DMSO en bewaar bij -20 °C.

2. Embryoverzameling en behandeling van zebravissen

  1. Houd de zebravis op 28,5 ± 0,5 °C in een recircerend aquacultuursysteem met een 14 uur lichte en 10 uur donkere fotoperiodecyclus.
  2. Plaats gezonde volwassen zebravissen in een aquarium met een verhouding van 2: 1 tussen mannen en vrouwen.
  3. Verzamel de volgende dag de embryo's en was ze met systeemwater (d.w.z. zebravisbroedwater).
  4. Selecteer en verdeel willekeurig zebravisembryo's die een normale ontwikkeling vertonen (uniforme grootte, volle korrels en geen eiercoagulatie) in 4 groepen in individuele glazen petrischalen met een diameter van 7 cm (ongeveer 50 embryo's per schotel).
  5. Behandel de embryo's met PM2,5 (5 mg/L) in aanwezigheid of afwezigheid van NAC bij 0,25 μM van 2 hpf tot 72 hpf. Gebruik DMSO als voertuigbesturing tot een eindconcentratie van 0,1% (v/v).

3. Morfologische observatie van zebravisembryo's en hartdissectie

  1. Breng bij 72 hpf embryo's over in glazen dia's en observeer onder een stereomicroscoop. Registreer hartmisvormingen, zoals pericardoedeem, veranderde looping en verminderde grootte.
  2. Bereken misvormingspercentages (het percentage embryo's met hartafwijkingen van de totale levende embryo's) en analyseer verschillen tussen groepen met behulp van eenrichtings-ANOVA gevolgd door de Meervoudige Vergelijkingstest van Turkije (p < 0,05 = statistisch significant).
  3. Verdoof de embryo's met 0,6 mg / ml MS-222 om ze op glazen dia's te immobiliseren.
  4. Neem hartslagen op gedurende 30 s en kwantificeer hartslagen met behulp van ImageJ-software5,20.
  5. Ontleed harten van zebravisembryo's met een wegwerpspuitnaald onder een stereomicroscoop. Let op: Vermijd het vernietigen van de hartvorm.

4. Immunofluorescentietest

  1. Om een immunofluorescentietest te gebruiken om PM2.5 geïnduceerde DNA-schade in het hart van zebravisembryo's te detecteren, gebruikt u een hydrofobe barrièrepen om een cirkel aan een schone glazen kant te tekenen.
  2. Voeg 50 μL 4% paraformaldehyde toe aan 1,25 ml fosfaat gebufferde zoutoplossing (PBS) om een fixatieve oplossing te maken.
  3. Plaats 3 ontleedde harten in een hydrofobe barrièrepencirkel en incubeer gedurende 20 minuten bij kamertemperatuur.
  4. Decanteer de oplossing onder de microscoop en droog de monsters bij kamertemperatuur gedurende ten minste 5 minuten, zodat de harten volledig aan de glasdia's hechten.
  5. Was de dia's driemaal in PBS met 0,1% Tween 20 (PBST) gedurende 5 minuten per wasbeurt.
  6. Voeg 50 μL runderserumalbumine (BSA) toe aan 1000 μL PBST om een 5% BSA-oplossing te verkrijgen en incubeer de dia's gedurende 1 uur in een vochtige kamer om niet-specifieke antilichaambinding te blokkeren.
  7. Decanteer de oplossing en was de monsters driemaal met PBST gedurende 5 minuten per wasbeurt.
  8. Verdun 2 μL monoklonaal antilichaam van muizen tegen 8-OHdG en 2 μL konijnpolyklonaal antilichaam tegen γH2AX in 296 μL PBST om een werkende primaire antilichaamcocktailoplossing te verkrijgen.
  9. Incubeer de hartmonsters met 50 μL van de primaire antilichaamcocktailoplossing tegen 8-OHdG en γH2AX in een bevochtigde kamer gedurende ten minste één uur bij kamertemperatuur of 's nachts bij 4 °C (nachtelijke incubatie kan de signaalintensiteit verhogen).
  10. Decanteer de oplossing en was de monsters driemaal met PBST gedurende 5 minuten per wasbeurt.
  11. Verdun 1 μL FITC-gelabeld geitenantimuisantilichaam en 1 μL cy3 geitenantia-antikonijn in 498 μL PBST om een werkende secundaire antilichaamcocktailoplossing te verkrijgen en incubateer de monsters met de secundaire antilichamen (1:500 in PBST) gedurende 1 uur bij kamertemperatuur in het donker.
  12. Decanteer de oplossing en was de monsters driemaal met PBS gedurende 5 minuten per wasbeurt beschermd tegen licht.
  13. Voeg 20 μL DAPI (4',6-diamidino-2-fenylindool) toe aan de monsters voor nucleaire kleuring gedurende 30 minuten bij kamertemperatuur.
  14. Breng een coverslip aan om te schuiven en af te sluiten met nagellak om uitdroging en beweging te voorkomen. Stel vervolgens de monsters in beeld onder een fluorescentiemicroscoop en kwantificeer het fluorescentiesignaal van het hartgebied met behulp van ImageJ-software. Bereken de relatieve veranderingen met het gemiddelde van dmso-controlemonsters. Bepaal de statistische significantie van de gegevens zoals in stap 3.2.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Resultaten

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Deze immunofluorescentietest is een gevoelige en specifieke methode voor het meten van eiwitexpressieveranderingen in de harten van zebravisembryo's die zijn blootgesteld aan milieuchemicaliën.

In deze representatieve analyse werden embryo's blootgesteld aan PM2,5 in afwezigheid of aanwezigheid van de antioxidant NAC geëvalueerd op de aanwezigheid van hartmisvormingen(figuur 1). Zoals waa...

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Discussie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Hoewel zebravis een uitstekend gewerveld model is voor het bestuderen van de cardiale ontwikkelingstoxiciteit van milieuchemicaliën, is het vanwege de kleine omvang van het embryohart moeilijk om voldoende eiwit te verkrijgen voor western blot-analyse. Daarom presenteren we een gevoelige immunofluorescentiemethode voor het kwantificeren van de eiwitexpressieniveaus van DNA-schadebiomarkers in de harten van zebravisembryo's die zijn blootgesteld aan PM2.5.

Tijdens dissectie is het be...

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Openbaarmakingen

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

De auteurs hebben niets te onthullen.

Dankbetuigingen

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Dit werk werd ondersteund door de National Nature Sciences Foundation of China (subsidienummer: 81870239, 81741005, 81972999) en The Priority Academic Program Development of Jiangsu Higher Education Institutions.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel
NaamBedrijfCatalogusnummerOpmerkingen
8-OHdG AntibodySanta Cruz Biotechnology, USAsc-66036Primair antilichaam
Analytische balansSartorius, ChinaBSA124S
BSASolarbio, Beijing, ChinaSW3015Voor blokkering
DAPIAbcam, USAab104139Voor nucleaire tegenkleuring.
DMSOSolarbio, Beijing, ChinaD8371
FluorescentiemicroscoopOlympus, JapanIX73Voor het beeldvormen van fluorescentiesignalen/
Geit Anti-Konijn IgG Cy3Carlsbad, USACW0159Secundair antilichaam
Geit Anti-Konijn IgG FITCCarlsbad, USARS0003Secundair antilichaam
N-Acetyl-L-cysteïne (NAC)Adamas-Beta, Shanghai, China616-91-1
Orbitale shakerQILINBEIER, ChinaTS-1
ParaformaldehydeSigma, ChinaP6148Maak 4% paraformaldehyde voor fixatie.
Fosfaat Buffered SalineHyClone, USASH30256.01Bereid 0,1% Tween in PBS voor wassen.
PM2.5 samplerTianHong, Wuhan, ChinaTH-150CVoor 24-uur ononderbroken PM2.5 bemonstering.
Re-circulerend aquacultuursysteemHaiSheng, Shanghai, ChinaDe zebravis werd erin onderhouden.
Soxhlet extractorZhengQiao, Shanghai, ChinaBSXT-02Voor extractie van organische componenten.
StereomicroscoopNikon, CanadaSMZ645Voor hartdissectie van zebravisembryo's.
Tricaine methaansulfonaat (MS222)Sigma, ChinaE10521Om zebravisembryo's te verdoven
Tween 20Sigma, ChinaP1379
γH2AX AntilichaamAbcam, USAab26350Primair antilichaam

Referenties

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. WHO. Ambient (outdoor) air quality and health . World Health Organization. , Available from: http://www.who.int/mediacentre/factsheets/fs313/en/ (2018).
  2. Zhang, B., et al. Maternal Exposure to Air Pollution and Risk of Congenital Heart Defects. European Journal of Pediatrics. 175, 1520(2016).
  3. Huang, C. C., Chen, B. Y., Pan, S. C., Ho, Y. L., Guo, Y. L. Prenatal exposure to PM2.5 and Congenital Heart Diseases in Taiwan. The Science of the Total Environment. 655, 880-886 (2019).
  4. Mesquita, S. R., et al. Toxic assessment of urban atmospheric particle-bound PAHs: relevance of composition and particle size in Barcelona (Spain). Environmental Pollution. 184, 555-562 (2014).
  5. Zhang, H., et al. Crosstalk between AhR and wnt/beta-catenin signal pathways in the cardiac developmental toxicity of PM2.5 in zebrafish embryos. Toxicology. 355-356, 31-38 (2016).
  6. Duan, J., et al. Multi-organ toxicity induced by fine particulate matter PM2.5 in zebrafish (Danio rerio) model. Chemosphere. 180, 24-32 (2017).
  7. Lorda-Diez, C. I., et al. Cell senescence, apoptosis and DNA damage cooperate in the remodeling processes accounting for heart morphogenesis. Journal of Anatomy. 234, 815-829 (2019).
  8. Kouassi, K. S., et al. Oxidative damage induced in A549 cells by physically and chemically characterized air particulate matter (PM2.5) collected in Abidjan, Cote d'Ivoire. Journal of Applied Toxicology. 30, 310-320 (2010).
  9. Gualtieri, M., et al. Gene expression profiling of A549 cells exposed to Milan PM2.5. Toxicology Letters. 209, 136-145 (2012).
  10. Li, S. Y., Sigmon, V. K., Babcock, S. A., Ren, J. Advanced glycation endproduct induces ROS accumulation, apoptosis, MAP kinase activation and nuclear O-GlcNAcylation in human cardiac myocytes. Life Sciences. 80, 1051-1056 (2007).
  11. Yamashita, M. Apoptosis in zebrafish development. Comparative biochemistry and physiology. Part B, Biochemistry & Molecular Biology. 136, 731-742 (2003).
  12. Moazzen, H., et al. N-Acetylcysteine prevents congenital heart defects induced by pregestational diabetes. Cardiovascular Diabetology. 13, 46(2014).
  13. Sun, S. Y. N-acetylcysteine, reactive oxygen species and beyond. Cancer Biology & Therapy. 9, 109-110 (2010).
  14. Tu, S., Chi, N. C. Zebrafish models in cardiac development and congenital heart birth defects. Differentiation. 84, 4-16 (2012).
  15. Asnani, A., Peterson, R. T. The zebrafish as a tool to identify novel therapies for human cardiovascular disease. Disease Models & Mechanisms. 7, 763-767 (2014).
  16. Li, M., et al. Toxic effects of polychlorinated biphenyls on cardiac development in zebrafish. Molecular Biology Reports. 41, 7973-7983 (2014).
  17. Massarsky, A., Prasad, G. L., Di Giulio, R. T. Total particulate matter from cigarette smoke disrupts vascular development in zebrafish brain (Danio rerio). Toxicology and Applied Pharmacology. 339, 85-96 (2018).
  18. Ren, F., et al. AHR-mediated ROS production contributes to the cardiac developmental toxicity of PM2.5 in zebrafish embryos. The Science of the Total Environment. 719, 135097(2020).
  19. van Berlo, J. H., Molkentin, J. D. An emerging consensus on cardiac regeneration. Nature Medicine. 20, 1386-1393 (2014).
  20. Yue, C., et al. Protective effects of folic acid on PM2.5-induced cardiac developmental toxicity in zebrafish embryos by targeting AhR and Wnt/beta-catenin signal pathways. Environmental Toxicology. 32, 2316-2322 (2017).
  21. Zhao, X., Ren, X., Zhu, R., Luo, Z., Ren, B. Zinc oxide nanoparticles induce oxidative DNA damage and ROS-triggered mitochondria-mediated apoptosis in zebrafish embryos. Aquatic Toxicology. 180, 56-70 (2016).
  22. Zhao, X., Wang, S., Wu, Y., You, H., Lv, L. Acute ZnO nanoparticles exposure induces developmental toxicity, oxidative stress and DNA damage in embryo-larval zebrafish. Aquatic Toxicology. 136-137, 49-59 (2013).
  23. Zhu, L., et al. DNA damage and effects on glutathione-S-transferase activity induced by atrazine exposure in zebrafish (Danio rerio). Environmental Toxicology. 26, 480-488 (2011).

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Herprints en machtigingen

Toestemming aanvragen om de tekst of afbeeldingen van dit JoVE-artikel te hergebruiken

Toestemming aanvragen

Trefwoorden

Immunofluorescentie assayblootstelling aan PM25zebravisembryo shartmisvormingoxidatieve DNA schade8 OHdG detectiegamma H2AX expressiefluorescentiemicroscopieantioxidant NAC

Gerelateerde artikelen