Live-cell Imaging of Single-Cell Arrays (LISCA) - een veelzijdige techniek om cellulaire kinetiek te kwantificeren

Samenvatting

We presenteren een methode voor het verkrijgen van fluorescentie reporter tijdcursussen van enkele cellen met behulp van micropatterned arrays. Het protocol beschrijft de voorbereiding van eencellige arrays, de installatie en werking van live-cell scanning time-lapse microscopie en een open-source beeldanalysetool voor geautomatiseerde voorselectie, visuele controle en tracking van celgeïntegreerde fluorescentietijdcursussen per adhesieplaats.

Samenvatting

Live-cell Imaging of Single-Cell Arrays (LISCA) is een veelzijdige methode om tijdscursussen van fluorescentiesignalen van individuele cellen in hoge doorvoer te verzamelen. Over het algemeen wordt de verwerving van eencellige tijdcursussen van gekweekte cellen belemmerd door celmotiliteit en diversiteit van celvormen. Zelfklevende microarrays standaardiseren eencellige omstandigheden en vergemakkelijken beeldanalyse. LISCA combineert eencellige microarrays met scanning time-lapse microscopie en geautomatiseerde beeldverwerking. Hier beschrijven we de experimentele stappen van het volgen van eencellige fluorescentietijdcursussen in een LISCA-formaat. We transfecteren cellen die zich hechten aan een micropatterned array met behulp van mRNA-codering voor verbeterde groene fluorescerende eiwitten (eGFP) en monitoren de eGFP-expressiekinetiek van honderden cellen parallel via scanning time-lapse microscopie. De beeldgegevensstacks worden automatisch verwerkt door nieuw ontwikkelde software die fluorescentie-intensiteit over geselecteerde celcontouren integreert om fluorescentietijdcursussen met één cel te genereren. We tonen aan dat eGFP-expressietijdcursussen na mRNA-transfectie goed worden beschreven door een eenvoudig kinetisch vertaalmodel dat expressie- en afbraaksnelheden van mRNA onthult. Verdere toepassingen van LISCA voor correlaties van gebeurtenistijd van meerdere markers in de context van signalering van apoptose worden besproken.

Inleiding

In de afgelopen jaren is het belang van eencellige experimenten duidelijk geworden. Gegevens van afzonderlijke cellen maken het mogelijk cel-celvariabiliteit, de resolutie van intracellulaire parametercorrelaties en de detectie van cellulaire kinetiek die verborgen blijven in ensemblemetingen^1,2,3. Om de cellulaire kinetiek van duizenden afzonderlijke cellen parallel te onderzoeken, zijn nieuwe benaderingen nodig die het mogelijk maken de cellen onder gestandaardiseerde omstandigheden te monitoren over een periode van enkele uren tot enkele dagen, gevolgd door een kwantitatieve gegevensanalyse ⁴. Hier presenteren we Live-cell Imaging of Single-Cell Arrays (LISCA), die het gebruik van microgestructureerde arrays combineert met time-lapse microscopie en geautomatiseerde beeldanalyse.

In literatuur^5,6zijn verschillende methoden voor het genereren van microgestructureerde eencellige arrays vastgesteld en gepubliceerd . Hier beschrijven we kort microschaal plasma-geïnitieerde eiwitpatronen (μPIPP). Een gedetailleerd protocol van de vervaardiging van eencellige arrays met behulp van μPIPP is ook te vinden in referentie⁷. Het gebruik van eencellige arrays maakt het mogelijk om duizenden cellen uit te lijnen op gestandaardiseerde hechtingspunten met gedefinieerde micromilieus voor elke cel en vermindert zo een bron van experimentele variabiliteit (figuur 1A). Eencellige arrays worden gebruikt om de tijdsvakken van fluorescerende markers te volgen die bedoeld zijn om een verscheidenheid aan cellulaire processen aan te geven. Lange termijn microscopie in de scantijdvervalmodus maakt het mogelijk om een groot deel van de eencellige arrays te bewaken en dus gegevens met één cel in hoge doorvoer te bemonsteren gedurende een observatietijd van enkele uren of zelfs dagen. Dit genereert tijdregelstapels van afbeeldingen vanaf elke positie van de matrix (figuur 1B). Om de grote hoeveelheid beeldgegevens te verminderen en de gewenste eencellige fluorescentietijdcursussen op een efficiënte manier te extraheren, is geautomatiseerde beeldverwerking vereist die profiteert van de positionering van cellen (Figuur 1C).

De uitdaging van LISCA is om de experimentele protocollen en computationele tools aan te passen om een high-throughput test te vormen die kwantitatieve en reproduceerbare gegevens van cellulaire kinetiek genereert. In dit artikel geven we een stapsgewijze beschrijving van de individuele methoden en hoe ze worden gecombineerd in een LISCA-test. Als voorbeeld bespreken we het tijdsverloop van verbeterde groene fluorescerende eiwit (eGFP) expressie na kunstmatige mRNA-levering. eGFP-expressie na mRNA-levering wordt beschreven door reactiesnelheidsvergelijkingen die de vertaling en degradatie van mRNA modelleren. Het aanpassen van de modelfunctie voor het tijdsverloop van de eGFP-concentratie aan de LISCA-uitlezing van de fluorescentie-intensiteit voor elke afzonderlijke cel in de loop van de tijd levert de beste schattingen op van modelparameters zoals de mRNA-afbraaksnelheid. Als representatief resultaat bespreken we de mRNA-leveringsefficiëntie van twee verschillende lipidegebaseerde transfectiemiddelen en hoe hun parameterverdelingen verschillen.

Figuur 1: Weergave van de LISCA-workflow die (A) micro-patroon eencellige arrays (B) scanning time-lapse microscopie en (C) geautomatiseerde beeldanalyse van opgenomen beeldreeksen combineert. De eencellige arrays bestaan uit een tweedimensionaal patroon van cellijme vierkanten met een celafstotende interruimte die leidt tot een rangschikking van de cellen op het micropattern, zoals te zien is in het fasecontrastbeeld en het fluorescentiebeeld van eGFP-uitdrukkende cellen (A). Het gehele microgestructureerde gebied wordt afgebeeld in een scantijdspannemodus die herhaaldelijk afbeeldingen maakt op een reeks posities (B). Opgenomen beeldreeksen worden verwerkt om de fluorescentie-intensiteit per cel in de loop van de tijd uit te lezen (C). Schaalbalken: 500 μm(A),200 μm(C). Klik hier om een grotere versie van deze afbeelding te bekijken.

Protocol

Figuur 2: Gegevensverwerving waarbij eencellige microarrays (A) worden gecombineerd met scanning time-lapse microscopie (B). Ter voorbereiding van het timelapse-experiment wordt een eencellige array met een 2D-micropattern van adhesievierkanten voorbereid (1), gevolgd door celzaden en het uitlijnen van de cellen op het micropattern (2) en de aansluiting van een perfusiesysteem op de zeskanaalsschuif, die vloeistofbehandeling tijdens de timelapsemeting mogelijk maakt (3). Er wordt een scanning time-lapse experiment opgezet (4) en de cellen worden op de microscoop getransfecteerd door tijdens het time-lapse experiment een mRNA lipoplex oplossing door het perfusiesysteem te injecteren (5). Schaalbalken: 200 μm. Klik hier om een grotere versie van deze afbeelding te bekijken.

1. Microgestructureerde eencellige arrayfabricage (Figuur 2A)

1. Bereid de materialen voor die nodig zijn voor de fabricage van μPIPP-arrays.
   1. Bereid steriele fosfaatgebufferde zoutoplossing (PBS) voor bij een pH van 7,4.
   2. Bereid steriel ultrapure water met een weerstand van ten minste 18 MΩcm bij 25 °C.
   3. Bereid PLL(20 kDa)-g[3.5] PEG(2 kDa) (PLL-PEG) werkoplossing met een 2 mg/ml concentratie PLL-PEG in ultrapure water met 150 mM NaCl en 10 mM 4-(2-hydroxyethyl)-1-piperazineethanesulfonzuur (HEPES).
   4. Bereid een extracellulaire matrix eiwitoplossing voor oppervlaktecoating: 1 mg/ml fibronectine (FN) in PBS.
   5. Bereid een siliciumwafel voor met een micropattern vervaardigd door fotolithografie⁸ die fungeert als een herbruikbare master. De micropattern bestaat uit vierkanten met een randlengte van 30 μm, een diepte van 12 μm en een inter-vierkante afstand van 60 μm, gerangschikt in zes strepen met elk een breedte van 6 mm en een hoogte van 18 mm.
2. Meng een polydimethylsiloxaan (PDMS) monomeer met 9% crosslinker (massa %) met behulp van een siliconen elastomeer kit en ontgassen het voor ongeveer 30 minuten totdat het bubbelvrij met behulp van een desiccator. Giet de siliconen wafer met een ongeveer 3-5 mm dikke PDMS-laag en ontgast deze opnieuw gedurende ongeveer 30 minuten totdat deze bubbelvrij is.
   1. Doe de siliconen wafer met het PDMS in een bakoven op 50 °C om het PDMS minstens 4 uur uit te harden.
3. Knip de PDMS-stempels door.
   1. Gebruik een scalpel en knip uit de PDMS-laag één PDMS-meesterwerk dat de zes micropatternstrepen bevat.
   2. Plaats het PDMS-meesterwerk op een bankje met het micropattern naar boven gericht.
   3. Snijd elk van de zes micropattern strepen van het PDMS meesterwerk met een scheermes in een PDMS stempel. Zorg ervoor dat de randen van de PDMS-stempels open zijn door een deel van het patroongebied af te snijden.
4. Plaats de PDMS-stempels op een afdeklip van een zeskanaalsschuif (afbeelding 3-1).
   1. Gebruik een ongecoate afdeklip en markeer de kanaalposities van de zeskanaalsglijstrook door de beschermfolie van de afdeklip voorzichtig te krassen. Plaats vervolgens de afdeklip op de bank met de beschermfolie naar beneden gericht.
   2. Plaats de PDMS-stempels met het micropattern naar beneden gericht op de coverslip op de gemarkeerde kanaalposities met een pincet.
   3. Controleer de bevestiging van de PDMS-stempels onder een microscoop. Als een PDMS-stempel volledig aan de coverslip is bevestigd, lijken de contactvierkanten donkerder dan de interruimte. De bevestiging van de PDMS-stempel aan de coverslip is cruciaal voor de micropatternkwaliteit.
5. Plaats de afdeklip met de zes PDMS-stempels erop in een plasmareiniger en behandel deze met zuurstofplasma (druk 0,2 mbar, ~40 W gedurende 3 min) om de oppervlakken tussen de PDMS-stempels en de coverslip hydrofiel te maken (Afbeelding 3-2).
6. Voer alle verdere stappen van de micropatternfabricage uit in een bioveiligheidskast. Gebruik 15 μL van de PLL-PEG-oplossing en pipetteer er één druppel naast elke PDMS-stempel, zodat de PLL-PEG-oplossing wordt geabsorbeerd in het hydrofiele patroon van de PDMS-stempel (figuur 3-3). Laat de PLL-PEG 20 minuten incuberen bij kamertemperatuur.
7. Spoel 1 ml ultrapure water over de afdeklip met de PDMS-stempels erop en verwijder de PDMS-stempels met een pincet (Afbeelding 3-4). Spoel vervolgens de deklip een tweede keer af met 1 ml ultrapure water en laat het drogen.
8. Wanneer de afdeklip volledig is opgedroogd, plakt u een plakkerige schuif met zes kanalen op de afdeklip (afbeelding 3-4). Zorg ervoor dat de micropatterned gebieden uitlijnen met de onderkant van de kanalen.
9. Functionaliseer de hechtingsvierkanten met FN.
   1. Vul 40 μL PBS in elk kanaal.
   2. Bereid een 100 μg/ml FN-oplossing in PBS.
   3. Voeg 40 μL van de FN-oplossing toe aan elk kanaal (figuur 3-5). Meng de FN-oplossing grondig met de PBS in het kanaal door 40 μL uit één reservoir te verwijderen en 3 keer toe te voegen aan het tegenoverliggende reservoir van hetzelfde kanaal om een homogene oplossing te genereren. Incubeer de FN-oplossing gedurende 45 minuten bij kamertemperatuur.
   4. Was elk kanaal driemaal met 120 μL PBS (figuur 3-6).
10. Gebruik in stap 9.2 een FN met fluorescerend label om de patroonkwaliteit te controleren. (figuur 4A).
    OPMERKING: We raden aan om de μPIPP-array niet meer dan één dag voor het zaaien van cellen voor te bereiden, omdat PLL-PEG en FN niet covalent aan het substraat zijn gebonden en de kwaliteit van het patroon in de loop van de tijd kan afnemen. Bewaar de voorbereide μPIPP-array in de koelkast.

Figuur 3: Vervaardiging van eencellige microarray door μPIPP. (1) PDMS-stempels met een driedimensionale micropatternstructuur op het oppervlak zijn gerangschikt op een afdeklip van een zeskanaals dia. (2) De afdeklip met de PDMS-stempels erop wordt behandeld met zuurstofplasma om de oppervlakken hydrofiel te maken. (3) PLL-PEG wordt toegevoegd. Het wordt geabsorbeerd in de microstructuur door capillaire krachten en maakt de oppervlakken niet bedekt door de PDMS stempel celafstotend. (4) De afdeklip wordt gespoeld met water om de resterende PLL-PEG te verwijderen. Vervolgens worden de PDMS-stempels verwijderd en wordt een plakstrook met zes kanalen op de coverslip geplakt. (5) Fibronectine, een eiwit van de extracellulaire matrix, wordt toegevoegd om de gebieden te maken zonder PLL-PEG cellijm. (6) De zeskanaalsschuif wordt gewassen met fosfaatgebufferde zoutoplossing. Klik hier om een grotere versie van deze afbeelding te bekijken.

2. Cel zaaien (Figuur 2A)

OPMERKING: Voeg voor de volgende wasstappen de betreffende vloeistof toe aan één reservoir en verwijder vervolgens een gelijk volume vloeistof uit het tegenoverliggende reservoir van een kanaal.

1. Was elk kanaal met 120 μL van 37 °C volledig aangevuld celgroeimedium. Voordat u de celsuspensie toevoegt, moet u ervoor zorgen dat alleen de kanalen zijn gevuld met medium, maar niet met de reservoirs.
2. Koppel HuH7-cellen los van een celkweekkolf volgens uw standaardprotocol voor celpassaging en pas de celsuspensieconcentratie aan op 4 x^{10 5} cellen/ml.
3. Voeg 40 μL celsuspensie toe en meng het celgroeimedium met de celsuspensie door 40 μL uit één reservoir te verwijderen en het gedurende 3 keer aan het tegenoverliggende reservoir van hetzelfde kanaal toe te voegen om een homogene celverdeling te bereiken (figuur 4B).
4. Verwijder 40 μL suspensie uit het kanaal, zodat alleen het kanaal gevuld is met celsuspensie.
5. Plaats de dia in een incubator en controleer de celadhesie 1 uur na het zaaien met behulp van een fasecontrastmicroscoop.
6. Voeg 120 μL warmcellig groeimedium van 37 °C toe.
7. Maar de dia terug in de incubator voor nog eens 3 uur om cellulaire zelforganisatie op de micropattern mogelijk te maken (Figuur 4C).

Figuur 4: Cellulaire zelforganisatie en kwaliteitscontrole van μPIPP-array. (A) Het microgestructureerde oppervlak bestaat uit kwadraat FN-gecoate hechtingsvlekken in rood omgeven door een celafstotend polymeer. (B) Na het zaaien van cellen worden de HuH7-cellen willekeurig verdeeld en (C) hechten ze voornamelijk op de hechtingsvlekken gedurende een periode van 4 uur. Herdrukt met toestemming ⁷. Schaalbalken: 200 μm. Klik hier om een grotere versie van deze afbeelding te bekijken.

3. Perfusiesysteem (figuur 2A)

OPMERKING: Het gebruik van een perfusiesysteem is alleen vereist als reagentia of fluorescerende markers moeten worden toegevoegd tijdens de timelapsemeting. Afhankelijk van uw behoeften kunt u elk kanaal aansluiten op een afzonderlijk perfusiesysteem of meerdere kanalen in serie aansluiten op hetzelfde perfusiesysteem. Het aantal perfusiesystemen komt overeen met het aantal onafhankelijke experimentele omstandigheden. Sluit de buizen onder steriele omstandigheden aan in een bioveiligheidskast en vermijd het opnemen van luchtbellen in het perfusiesysteem. Als er geen perfusiesysteem wordt gebruikt, voegt u de reagentia/markers toe in een bioveiligheidskast vóór de timelapsemeting. Het perfusiesysteem is in eigen huis vervaardigd, het gebruikte materiaal is opgenomen in de tabel met materialen. De assemblage van het perfusiesysteem is eerder beschreven⁹.

1. Gebruik een spuit van 1 ml (met vervangende sporn) en vul de spuit met 1 ml 37 °C celgroeimedium.
2. Sluit de spuit aan op de inlaatbuis met behulp van de klep en vul de buis met medium.
3. Sluit de inlaatbuis aan op een reservoir van een kanaal en zorg ervoor dat er geen luchtbellen worden opgesloten.
4. Om een ander kanaal in serie op dit perfusiesysteem aan te sluiten, sluit u een seriële connector aan op het reservoir tegenover de inlaatbuis van het huidige kanaal. Ga naar het volgende kanaal en sluit het vrije uiteinde van de seriële connector aan op een van de reservoirs.
5. Herhaal de vorige stappen totdat het vereiste aantal kanalen in serie is aangesloten.
6. Sluit de uitlaatbuis rechtstreeks aan op het vrije reservoir van het huidige kanaal. Vul de aangesloten buis met medium om te controleren of het perfusiesysteem niet lekt.
7. Herhaal de vorige stappen totdat alle zes kanalen van de dia zijn aangesloten op een perfusiesysteem.
8. Plaats de schuif met het aangesloten perfusiesysteem(en) terug in de incubator tot verder gebruik of plaats deze direct in de verwarmingskamer van de microscoop voorverwarmd tot 37 °C voor time-lapse meting.

4. Time-lapse microscopie (Figuur 2B)

OPMERKING: Houd voor langetermijnmetingen een stabiele temperatuur van 37 °C en een stabiel CO_2-niveau aan. Als alternatief voor CO_{2-afhankelijk}celgroeimedium gebruikt u L15-medium waarvoor geen gasincuberingssysteem nodig is.

OPMERKING: Gebruik voor kwantitatieve beeldvorming het celgroeimedium zonder fenolrood tijdens de timelapsemeting om de fluorescentie van de achtergrond te verminderen en gebruik dezelfde instellingen van het time-lapse-protocol en dezelfde microscoop voor technische replica's.

1. Stel een time-lapse-protocol in voor het opnemen van een fasecontrastbeeld en een fluorescentiebeeld met belichtingstijden van 750 ms (afhankelijk van de camera), 10 minuten tijdsinterval tussen opeenvolgende lussen door de positielijst en een observatietijd van 30 uur, met behulp van een 10x objectief en geschikte fluorescentiefilters.
2. Plaats de zeskanaalsschuif met de cellen op de eencellige arrays in de monsterhouder van de warme verwarmingskamer van 37 °C. Als perfusiesystemen zijn aangesloten op de zeskanaalsschuif, bevestigt u de buizen aan het werkgebied met behulp van tape om ervoor te zorgen dat de zeskanaalsschuif niet wordt verplaatst tijdens vloeistofuitwisseling. Steek de vrije uiteinden van de uitlaatbuizen door een gat van een reactiebuis van 15 ml om het vloeibare afval op te verzamelen.
3. Stel de positielijst in voor de scantijdvervalmeting. Zorg ervoor dat het aantal posities kan worden gescand binnen het gedefinieerde tijdsinterval tussen opeenvolgende lussen door de positielijst. Met een 10x-doelstelling kunnen 10-30 posities per kanaal worden ingesteld om het totale micropatterngebied te scannen, afhankelijk van de grootte van de camerachip.
4. Start de time-lapse meting. Gebruik voor een betere beeldkwaliteit van langetermijnmetingen een geautomatiseerd scherpstelcorrectiesysteem.

5. Fluorescerende marker - mRNA transfectie (Figuur 2B)

OPMERKING: Voor een transfectie in twee kanalen die door een slangsysteem zijn aangesloten, is een totaal volume van 600 μL transfectiemix nodig (300 μL voor één kanaal). De aangegeven volumes verwijzen naar een transfectie in twee aangesloten kanalen.

1. Bereid een oplossing voor een transfectiemiddel door 1 μL transfectiemiddel te verdunnen in 200 μL serumgebeneemt medium en laat de oplossing 5 minuten incuberen bij kamertemperatuur.
2. Bereid een mRNA-oplossing voor door 300 ng mRNA-codering voor eGFP te verdunnen in 150 μL serumgemalen medium.
3. Bereid de transfectiemix voor door 150 μL van de transfectiemiddeloplossing aan de mRNA-oplossing toe te voegen en meng deze goed. Laat de transfectiemix 20 minuten incuberen op kamertemperatuur.
4. Spoel het slangsysteem met 1 ml warme PBS van 37 °C met behulp van een spuit tijdens de incubatie van het transfectiemengsel. Let er bij het doorspoelen van de buizen op dat het microscoopstadium niet beweegt. Pauzeer de timelapse-meting indien nodig.
5. Verdun het transfectiemengsel tot de uiteindelijke mRNA-concentratie van 0,5 ng/μL door 300 μL serumgebeonderd medium toe te voegen.
6. Spoel het slangsysteem met de transfectiemix met een spuit en laat de mRNA-lipoplexen 1 uur incuberen (pauzeer indien nodig de time-lapse-meting).
7. Stop de transfectie incubatie en spoel de ongebonden mRNA lipoplexen weg door te wassen met 1 ml 37 °C warm volledig aangevuld celgroeimedium met behulp van een spuit (pauzeer de time-lapse meting indien nodig).

6. Beeldanalyse en fluorescentie-uitlezing

1. Installeer bij het uitvoeren van de beeldanalyse voor het eerst versie 0.1.6 van de open-source software "Automated Microstructure Analysis in Python" (PyAMA) vanaf de geciteerde locatie¹⁰ volgens de instructies die daar zijn verstrekt.
2. Zorg ervoor dat de beeldkanalen (fasecontrast en fluorescentie) beschikbaar zijn als 16-bits TIFF-bestanden met meerdere afbeeldingen. Zet ze indien nodig dienovereenkomstig om.
3. Start PyAMA en klik op Stapel openen... om afbeeldingen te openen voor analyse.
4. Klik voor elk TIFF-bestand met meerdere afbeeldingen dat u wilt openen op Openen en selecteer het bestand zodat het wordt weergegeven in de lijst met geladen bestanden aan de linkerkant van het dialoogvenster (Afbeelding 5-1).
5. Markeer de kanalen die u in de analyse wilt opnemen. Voer voor elk kanaal de volgende stappen uit.
   1. Selecteer in de lijst met geladen bestanden het TIFF-bestand dat het kanaal bevat.
   2. Selecteer in de sectie Nieuw kanaal toevoegende index van het kanaal in het TIFF-bestand. Indexering is nul-gebaseerd; het eerste kanaal heeft index 0, het tweede kanaal heeft index 1 enzovoort.
   3. Selecteer het kanaaltype. Selecteer Fasecontrast of Fluorescentie voor de bijbehorende afbeeldingskanalen en Segmentatie voor een binair kanaal dat de celcontouren aangeeft.
   4. Voer eventueel een label van het kanaal in voor het onderscheiden van verschillende fluorescentiekanalen: eGFP en DAPI.
   5. Nadat u het kanaal hebt geconfigureerd, klikt u op Toevoegen.
6. Wanneer alle toegevoegde kanalen worden weergegeven in de lijst met kanalen aan de rechterkant van het dialoogvenster, klikt u op OK om de stapel te laden.
7. Als u segmentatie wilt uitvoeren met het ingebouwde segmentatiealgoritme van PyAMA voor celherkenning op basis van de fasecontrastafbeeldingen (figuur 5-2), gaat u naar Tools | Binarize... en voer een bestandsnaam in voor het NumPy-bestand met het binarized kanaal.
   OPMERKING: In de huidige versie moet het binarized kanaal opnieuw worden geladen.
8. Om een achtergrondcorrectie¹¹ op een fluorescentiekanaal(figuur 5-3)uit te voeren, moet u ervoor zorgen dat het fluorescentiekanaal en een segmentatiekanaal worden geladen. Als er geen segmentatiekanaal is geladen, moet u ervoor zorgen dat een fasecontrastkanaal wordt geladen voor automatische segmentatie. Ga naar "Tools > Achtergrondcorrectie..." en selecteer een bestandsnaam voor het resulterende TIFF-bestand met het gecorrigeerde fluorescentiekanaal.
   OPMERKING: In de huidige versie moet het op de achtergrond gecorrigeerde kanaal opnieuw worden geladen.
9. Inspecteer de vooraf geselecteerde cellen (figuur 5-4) en hun geïntegreerde fluorescentiesignaal (figuur 5-5) door door de tijdframes te scrollen, de kanalen in het kanaalmenu aan de linkerkant te bekijken en op cellen te klikken om hun fluorescentietijdcursussen te markeren (Figuur 1C). Gebruik de celselectie om cellen die niet levensvatbaar zijn, niet beperkt tot een hechtingsvlek of die aan een andere cel zijn bevestigd, uit te sluiten van verdere analyse. Schakel de selectie van cellen in voor uitlezing door op Shift te drukken en op de cel te klikken, of door de cel te markeren en op Enterte drukken.
10. Sla de eencellige tijdscursussen voor het celgebied en de geïntegreerde fluorescentie (figuur 5-6) op door te klikken op Bestand | Een map opslaan en selecteren om op te slaan.

Figuur 5: Geautomatiseerde beeldverwerking van time-lapse beeldseries met behulp van PyAMA. (1) Fasecontrast- en fluorescentiebeeldreeksen voor elke beeldpositie worden geïmporteerd. (2) Celcontouren worden bepaald door segmentatie op de fasecontrastafbeeldingsstapel. (3) Op de fluorescentiebeelden wordt een achtergrondcorrectie toegepast. (4) De celcontouren worden in de loop van de tijd bijgehouden en vooraf geselecteerd voor export. (5) De fluorescentie-intensiteit wordt geïntegreerd op basis van de gevolgde celcontouren. (6) Eencellige celgebieden en geïntegreerde fluorescentieintensiteiten worden geëvalueerd en tijdscursussen voor elke cel worden geëxporteerd. Schaalbalken: 100 μm. Klik hier om een grotere versie van deze afbeelding te bekijken.

1. Om de vertaalkinetiek na mRNA-transfectie te analyseren, past u een vertaalmodel op basis van biochemische tariefvergelijkingen in elke eencellige tijdscursus zoals eerder beschreven door Reiser et al.¹². De in dat onderzoek gebruikte gegevens en code zijn openbaar beschikbaar¹³.
2. Haal voor elke eencellige tijdscursus de geschatte pasparameters van het vertaalmodel op die de mRNA-degradatiesnelheid en het begintijd van de vertaling vertegenwoordigen. Een voorbeeldgegevensset wordt besproken in de sectie representatieve resultaten.
3. Voer verdere analyse uit van de verdelingen van de beste schattingen van de parameters voor gevarieerde experimentele omstandigheden om de cel-celvariabiliteit binnen de celpopulaties te onderzoeken.

Resultaten

De LISCA-aanpak maakt het mogelijk om op efficiënte wijze fluorescentietijdcursussen van afzonderlijke cellen te verzamelen. Als representatief voorbeeld schetsen we hoe de LISCA-methode wordt toegepast om eencellige eGFP-expressie na transfectie te meten. De gegevens van het LISCA-experiment worden gebruikt om de kinetiek van mRNA-toediening te beoordelen, wat belangrijk is voor de ontwikkeling van efficiënte mRNA-geneesmiddelen.

We tonen met name de verschillende impact van twee op lipiden g...

Discussie

Hier beschreven we LISCA als een veelzijdige techniek om cellulaire kinetiek van intracellulaire fluorescerende labels op ééncellig niveau te volgen. Om een succesvol LISCA-experiment uit te voeren, moeten alle beschreven stappen van de protocolsectie afzonderlijk worden vastgesteld en vervolgens moeten alle stappen worden gecombineerd. Elk van de drie belangrijkste aspecten van LISCA bevat cruciale stappen.

Vervaardiging van eencellige microarray
De kwaliteit van de microarray is ...

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel

Naam	Bedrijf	Catalogusnummer	Opmerkingen
Adtech Polymer Engineering PTFE Microtubing	Fisher Scientific	10178071
baking oven	Binder	9010-0190
CFI Plan Fluor DL 10x	Nikon	MRH20100
Desiccator	Roth	NX07.1
Eclipse Ti-E	Nikon
eGFP mRNA	Trilink	L-7601
Female Luer to Tube Connector	MEDNET	FTL210-6005
Fetal bovine serum	Thermo Fisher	10270106
Fibronectin	Yo Proteins	663
Filter set eGFP	AHF	F46-002
Fisherbrand Translucent Platinum-Cured Silicone Tubing	Fisher Scientific	11768088
HEPES (1 M)	Thermo Fisher	15630080
Incubation Box	Okolab	OKO-H201
incubator	Binder	9040-0012
L-15 without phenol red	Thermo Fisher	21083027
Lipofectamine 2000	Thermo Fisher	11668027
Male Luer			in-house fabricated consisting of teflon
Male Luer to Tube Connector	MEDNET	MTLS210-6005	alternative to in-house fabricated male luers
NaCl (5 M)	Thermo Fisher	AM9760G
Needleless Valve to Male Luer Connector	MEDNET	NVFMLLPC
NIS Elements	Nikon		Imaging software Version 5.02.00
NOA81	Thorlabs	NOA81	Fast Curing Optical Adhesive for tube system assembly
Opti-MEM	Thermo Fisher	31985062
PCO edge 4.2 M-USB-HQ-PCO	pco
Phosphate buffered saline (PBS)			in-house prepared
Plasma Cleaner	Diener Femto	Pico-BRS
PLL(20 kDa)-g[3.5]-PEG(2 kDa)	SuSoS AG
silicon wafer met mircorstructures			in-house fabricated
Sola Light Engine	Lumencor
sticky slide VI 0.4	ibidi	80608
Sylgard 184 Silicone Elastomer Kit	Dow Corning	1673921
Tango 2	Märzhäuser	00-24-626-0000
Ultrapure water			in-house prepared
uncoated coverslips	ibidi	10813
Injekt-F Solo, 1 mL	Omilab	9166017V	with replacement sporn