We presenteren een methode voor het verkrijgen van fluorescentie reporter tijdcursussen van enkele cellen met behulp van micropatterned arrays. Het protocol beschrijft de voorbereiding van eencellige arrays, de installatie en werking van live-cell scanning time-lapse microscopie en een open-source beeldanalysetool voor geautomatiseerde voorselectie, visuele controle en tracking van celgeïntegreerde fluorescentietijdcursussen per adhesieplaats.
Een abonnement op JoVE is vereist om deze inhoud te bekijken. Log in of start vandaag met uw gratis proefperiode.
Methodenartikel
Live-cell Imaging of Single-Cell Arrays (LISCA) - een veelzijdige techniek om cellulaire kinetiek te kwantificeren
In dit artikel
Samenvatting
Samenvatting
Live-cell Imaging of Single-Cell Arrays (LISCA) is een veelzijdige methode om tijdscursussen van fluorescentiesignalen van individuele cellen in hoge doorvoer te verzamelen. Over het algemeen wordt de verwerving van eencellige tijdcursussen van gekweekte cellen belemmerd door celmotiliteit en diversiteit van celvormen. Zelfklevende microarrays standaardiseren eencellige omstandigheden en vergemakkelijken beeldanalyse. LISCA combineert eencellige microarrays met scanning time-lapse microscopie en geautomatiseerde beeldverwerking. Hier beschrijven we de experimentele stappen van het volgen van eencellige fluorescentietijdcursussen in een LISCA-formaat. We transfecteren cellen die zich hechten aan een micropatterned array met behulp van mRNA-codering voor verbeterde groene fluorescerende eiwitten (eGFP) en monitoren de eGFP-expressiekinetiek van honderden cellen parallel via scanning time-lapse microscopie. De beeldgegevensstacks worden automatisch verwerkt door nieuw ontwikkelde software die fluorescentie-intensiteit over geselecteerde celcontouren integreert om fluorescentietijdcursussen met één cel te genereren. We tonen aan dat eGFP-expressietijdcursussen na mRNA-transfectie goed worden beschreven door een eenvoudig kinetisch vertaalmodel dat expressie- en afbraaksnelheden van mRNA onthult. Verdere toepassingen van LISCA voor correlaties van gebeurtenistijd van meerdere markers in de context van signalering van apoptose worden besproken.
Inleiding
In de afgelopen jaren is het belang van eencellige experimenten duidelijk geworden. Gegevens van afzonderlijke cellen maken het mogelijk cel-celvariabiliteit, de resolutie van intracellulaire parametercorrelaties en de detectie van cellulaire kinetiek die verborgen blijven in ensemblemetingen1,2,3. Om de cellulaire kinetiek van duizenden afzonderlijke cellen parallel te onderzoeken, zijn nieuwe benaderingen nodig die het mogelijk maken de cellen onder gestandaardiseerde omstandigheden te monitoren over een periode van enkele uren tot enkele dagen, gevolgd door een kwantitatie....
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Protocol
Figuur 2: Gegevensverwerving waarbij eencellige microarrays (A) worden gecombineerd met scanning time-lapse microscopie (B). Ter voorbereiding van het timelapse-experiment wordt een eencellige array met een 2D-micropattern van adhesievierkanten voorbereid (1), gevolgd door celzaden en het uitlijnen van de cellen op het micropattern (2) en de aansluiting van een perfusiesysteem op de zeskanaalsschuif, die vloeistofbehandeling tijdens de timelapsemeting mogelijk maakt (3). Er wordt een scanning time-lapse ....
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Resultaten
De LISCA-aanpak maakt het mogelijk om op efficiënte wijze fluorescentietijdcursussen van afzonderlijke cellen te verzamelen. Als representatief voorbeeld schetsen we hoe de LISCA-methode wordt toegepast om eencellige eGFP-expressie na transfectie te meten. De gegevens van het LISCA-experiment worden gebruikt om de kinetiek van mRNA-toediening te beoordelen, wat belangrijk is voor de ontwikkeling van efficiënte mRNA-geneesmiddelen.
We tonen met name de verschillende impact van twee op lipiden g.......
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Discussie
Hier beschreven we LISCA als een veelzijdige techniek om cellulaire kinetiek van intracellulaire fluorescerende labels op ééncellig niveau te volgen. Om een succesvol LISCA-experiment uit te voeren, moeten alle beschreven stappen van de protocolsectie afzonderlijk worden vastgesteld en vervolgens moeten alle stappen worden gecombineerd. Elk van de drie belangrijkste aspecten van LISCA bevat cruciale stappen.
Vervaardiging van eencellige microarray
De kwaliteit van de microarray is .......
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Openbaarmakingen
De auteurs verklaren dat ze geen concurrerende financiële belangen hebben.
Dankbetuigingen
Dit werk werd ondersteund door subsidies van de German Science Foundation (DFG) aan Collaborative Research Center (SFB) 1032. Steun van het Duitse federale ministerie van Onderwijs, Onderzoek en Technologie (BMBF) in het kader van het samenwerkingsproject 05K2018-2017-06716 Medisoft en een subsidie van de Bayerische Forschungsstiftung worden dankbaar erkend. Anita Reiser werd ondersteund door een DFG Fellowship via de Graduate School of Quantitative Biosciences Munich (QBM).
....Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Materialen
| Naam | Bedrijf | Catalogusnummer | Opmerkingen |
|---|---|---|---|
| Adtech Polymer Engineering PTFE Microtubing | Fisher Scientific | 10178071 | |
| baking oven | Binder | 9010-0190 | |
| CFI Plan Fluor DL 10x | Nikon | MRH20100 | |
| Desiccator | Roth | NX07.1 | |
| Eclipse Ti-E | Nikon | ||
| eGFP mRNA | Trilink | L-7601 | |
| Female Luer to Tube Connector | MEDNET | FTL210-6005 | |
| Fetal bovine serum | Thermo Fisher | 10270106 | |
| Fibronectin | Yo Proteins | 663 | |
| Filter set eGFP | AHF | F46-002 | |
| Fisherbrand Translucent Platinum-Cured Silicone Tubing | Fisher Scientific | 11768088 | |
| HEPES (1 M) | Thermo Fisher | 15630080 | |
| Incubation Box | Okolab | OKO-H201 | |
| incubator | Binder | 9040-0012 | |
| L-15 without phenol red | Thermo Fisher | 21083027 | |
| Lipofectamine 2000 | Thermo Fisher | 11668027 | |
| Male Luer | in-house fabricated consisting of teflon | ||
| Male Luer to Tube Connector | MEDNET | MTLS210-6005 | alternative to in-house fabricated male luers |
| NaCl (5 M) | Thermo Fisher | AM9760G | |
| Needleless Valve to Male Luer Connector | MEDNET | NVFMLLPC | |
| NIS Elements | Nikon | Imaging software Version 5.02.00 | |
| NOA81 | Thorlabs | NOA81 | Fast Curing Optical Adhesive for tube system assembly |
| Opti-MEM | Thermo Fisher | 31985062 | |
| PCO edge 4.2 M-USB-HQ-PCO | pco | ||
| Phosphate buffered saline (PBS) | in-house prepared | ||
| Plasma Cleaner | Diener Femto | Pico-BRS | |
| PLL(20 kDa)-g[3.5]-PEG(2 kDa) | SuSoS AG | ||
| silicon wafer met mircorstructures | in-house fabricated | ||
| Sola Light Engine | Lumencor | ||
| sticky slide VI 0.4 | ibidi | 80608 | |
| Sylgard 184 Silicone Elastomer Kit | Dow Corning | 1673921 | |
| Tango 2 | Märzhäuser | 00-24-626-0000 | |
| Ultrapure water | in-house prepared | ||
| uncoated coverslips | ibidi | 10813 | |
| Injekt-F Solo, 1 mL | Omilab | 9166017V | with replacement sporn |
Referenties
- Altschuler, S. J., Wu, L. F. Cellular heterogeneity: do differences make a difference. Cell. 141 (4), 559-563 (2010).
- Locke, J. C., Elowitz, M. B. Using movies to analyse gene circuit dynamics in single cells. Nature Reviews Microbiology. 7 (5), 383-392 (2009).....
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Herprints en machtigingen
