Hier presenteren we een eenvoudige methode voor het scheiden van folliculaire cellen en oöcyten in eierstokfollikels van zebravissen, wat het onderzoek naar de ontwikkeling van eierstokvissen bij zebravissen zal vergemakkelijken.
Een abonnement op JoVE is vereist om deze inhoud te bekijken. Log in of start vandaag met uw gratis proefperiode.
Methodenartikel
Scheiding van folliculaire cellen en oöcyten in ovariële follikels van zebravissen
In dit artikel
Samenvatting
Samenvatting
Zebravissen zijn een ideaal model geworden om de eierstokontwikkeling van gewervelde dieren te bestuderen. De follikel is de basiseenheid van de eierstok, die bestaat uit oöcyten en omliggende folliculaire cellen. Het is van vitaal belang om zowel folliculaire cellen als oöcyten te scheiden voor verschillende onderzoeksdoeleinden, zoals voor primaire cultuur van folliculaire cellen, analyse van genexpressie, oöcytrijping en in-vitrofertilisatie, enz. De conventionele methode gebruikt tangen om beide compartimenten te scheiden, wat arbeidsintensief, tijdrovend en hoge schade aan de oöcyt heeft. Hier hebben we een eenvoudige methode opgezet om beide compartimenten te scheiden met behulp van een getrokken glazen capillair. Onder een stereomicroscoop kunnen oöcyten en folliculaire cellen gemakkelijk worden gescheiden door pipetten in een getrokken fijn glazen capillair (de diameter is afhankelijk van de follikeldiameter). In vergelijking met de conventionele methode heeft deze nieuwe methode een hoog rendement bij het scheiden van zowel oöcyten als folliculaire cellen en heeft het een lage schade aan de oöcyten. Wat nog belangrijker is, deze methode kan worden toegepast op follikels in een vroeg stadium, ook in het stadium vóór vitellogenese. Deze eenvoudige methode kan dus worden gebruikt om folliculaire cellen en oöcyten van zebravissen te scheiden.
Inleiding
Zebravis is een belangrijk modelorganisme voor de studie van gewervelde ontwikkeling en fysiologie. De zebravis kan dienen als een goed model voor het bestuderen van de moleculaire mechanismen van eierstokontwikkeling1,2,3. Veel kenmerken van de ontwikkeling van de eierstok zijn veel behouden tijdens de evolutie van vis naar zoogdieren1,2. Net als de andere gewervelde dieren hebben zebravisvolwassenen asynchrone eierstokken, die ovariële follikels van alle ontwikkelingsstadia bevatten4. De follikel is het fundamentele reproductieve element van de eierstok. De follikel bestaat uit de oöcyt die wordt omgeven door een of meerdere lagen somatische cellen die folliculaire cellen worden genoemd. De ontwikkeling van follikels hangt af van de bidirectionele communicatie tussen oöcyten en folliculaire cellen5. Het is van vitaal belang om folliculaire cellen en oöcytcellen van ovariële follikels te scheiden voor verschillende onderzoeksdoeleinden, zoals folliculaire cel primaire cultuur, genexpressieanalyse, oöcytrijping en in-vitrofertilisatie.
Traditionele scheidingsmethoden omvatten mechanische scheiding door tang en enzymatische vergisting6,7,8,9,10. De mechanische scheiding door een tang is echter tijdrovend en arbeidsintensief. Het zal ook de hoge schade aan de oöcyt veroorzaken tijdens de scheiding. Hoewel de enzymverteringsmethode eenvoudig te bedienen is en een korte tijd vereist, moeten de behandelingstijd en enzymconcentratie worden gevalideerd en zijn de integriteit en overlevingskans van de geïsoleerde oöcyten niet ideaal. Daarom hebben we een eenvoudige methode opgezet om beide compartimenten in verschillende ontwikkelingsstadia te scheiden met behulp van getrokken glazen capillaire buizen.
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Protocol
Alle procedures die worden uitgevoerd in visexperimenten zijn in overeenstemming met de voorschriften van de Animal Experimentation Ethics Committee van Northwest Normal University.
1. Voorbereidingen
- Dieren
- Gebruik volwassen vrouwelijke zebravissen met een lichaamslengte van 4-6 cm.
OPMERKING: We gebruikten zebravissen van een lokale markt. - Houd de zebravis in een circulerend watersysteem met een licht van 14 uur en een donkere cyclus van 10 uur bij ongeveer 28 °C.
- Voer vis twee keer per dag met pas uitgekomen pekelgarnalen.
- Gebruik volwassen vrouwelijke zebravissen met een lichaamslengte van 4-6 cm.
- Getrokken glascapillair
- Gebruik een glazen capillair van 15 cm en plaats het hoofd in een alcoholbrander om het te verwarmen. Houd het ene uiteinde van het glazen capillair met de hand vast en houd het andere uiteinde vast met een tang.
- Na 5-10 seconden verwarmen wordt het glas op het vuur van de alcoholbrander rood en zacht. Strek de kop van het glazen capillair met een tang om de capillaire opening met de vereiste diameter te maken.
OPMERKING: De diameter is afhankelijk van de follikeldiameters: previtellogeen (PV; ongeveer 0,30 mm in diameter), vroeg vitellogeen (EV; ongeveer 0,40 mm in diameter), midvitellogeen (MV; ongeveer 0,50 mm in diameter), laat vitellogeen (LV; ongeveer 0,60 mm in diameter) en volgroeid maar onvolwassen (FG; ongeveer 0,65 mm in diameter). - Rek de opening van glazen capillair uit tot de juiste diameter, die iets kleiner is dan de grootte van gescheiden follikels. Het glazen capillair met een opening die veel groter is dan de grootte van eierstokfollikels kan geen scheiding uitvoeren, maar de veel kleinere zouden de follikels breken tijdens de scheiding. Oefen het uitrekken van het glazen capillair meerdere keren.
OPMERKING: De verwarmingstijd is afhankelijk van de grootte van het glazen capillair. Rek het glazen capillair niet direct uit op het vuur van de alcoholbrander. Het zal het glazen capillair breken. - Snijd het glazen capillair met een ampulsnijder en breek het glazen capillair met een tang om een gladde incisie te verkrijgen.
OPMERKING: Een scherpe of gebroken opening van het glazen capillair zou de follikels beschadigen. - Plaats met behulp van een plastic buis van 30 cm een pipetpunt van 1 ml met een filterelement aan het ene uiteinde, plaats het getrokken glazen capillair aan het einde van de pipet en sluit een pipetpunt van 200 μL aan een ander uiteinde aan.
2. Scheiding van zebravisoocyten en folliculaire cellen in verschillende stadia
- Dissectie van de eierstok van zebravissen
- Vul een ijsemmer tot 4/5 vol met drijfmestijs en voeg voldoende viswater toe om drijfijs te laten drijven. Wacht 2-5 minuten, controleer de watertemperatuur en zorg ervoor dat de temperatuur tussen 2-4 °C ligt.
- Verdoof volwassen vrouwtjes door vissen minstens 2-5 minuten in het ijswater te plaatsen, totdat vissen de kieuwbeweging stoppen. Onthoofd de vis door het ruggenmerg door te breken met een scherpe schaar om de dood te garanderen.
- Leg de vis met een tang op de dissectieplaat.
- Gebruik een ontleedschaar om als volgt te snijden. Ontleed van de cloaca naar de kieuwen langs de middellijn van de buik. Snijd van de achterkant van de cloaca. Snijd van de voorste punt naar de dorsale kant. Verwijder voorzichtig de huid en spieren aan één kant van het lichaam. Stel de inwendige organen bloot en haal de hele eierstok eruit met een tang.
- Plaats de eierstokken onmiddellijk voorzichtig in een kweekschaal van 100 mm met 60% Leibovitz's L-15 (L-15) medium.
- Isolatie van ovariële follikels
OPMERKING: Het ensceneringssysteem dat we hebben aangenomen, is gebaseerd op de oorspronkelijke definitie van Selman et al.4.- Isoleer handmatig follikels van verschillende stadia met behulp van een paar fijne tangen zoals eerder beschreven8.
- Groepeer de ovariële follikels in de volgende fasen: PV- , EV-, MV-, LV- en FG-fasen.
- Scheiding van folliculaire cellen en oöcyt van ovariële follikels
- Doe de ovariële follikels in verschillende stadia in een schone petrischaal met 60% L-15 medium.
- Zuig met behulp van het getrokken glazen capillair vanaf stap 1.2 de follikels 2-3 cm in het glazen capillair en blaas ze uit.
OPMERKING: Wanneer de openingsdiameter van de glazen haarvaten geschikt is, kan de follikel door inademing eenmaal van de oöcyt worden gescheiden.- Als de folliculaire cellaag stevig aan de oöcyt is bevestigd, herhaal dit dan 2-3 keer om een volledige scheiding te bereiken. Vermijd meerdere pogingen om een follikel door een kleiner capillair te dwingen, wat de follikel zou beschadigen.
OPMERKING: Tijdens het inademen en uitblazen valt de folliculaire laag af en scheidt zich van de oöcyt, en ten slotte worden folliculaire cellen en gedenudeerde oöcyten gescheiden (Figuur 1).
- Als de folliculaire cellaag stevig aan de oöcyt is bevestigd, herhaal dit dan 2-3 keer om een volledige scheiding te bereiken. Vermijd meerdere pogingen om een follikel door een kleiner capillair te dwingen, wat de follikel zou beschadigen.
- Pool de gedenudeerde maar intacte oöcyten en verzamel de overlevende gedenudeerde oöcyten voor verdere test.
- Om te onderzoeken of de folliculaire cellen gescheiden waren van intacte follikels, bevlekt u de intacte follikels en gescheiden oöcyten met 4',6-diamidino-2-fenylindole (DAPI).
- Bevestig de monsters in 4% gebufferd paraformaldehyde bij kamertemperatuur (RT) gedurende 1 uur. Meerdere keren wassen door PBS.
- Vlek door DAPI bij RT gedurende 30 min. Meerdere keren gewassen met PBS. Bekijk en fotografeer met een fluorescentiemicroscoop (bijv. Leica DFC7000 T).
- Om de voltooide scheiding te bevestigen, bevestigt u de intacte follikels en gescheiden oöcyten in 4% gebufferde paraformaldehyde 's nachts bij 4 °C en sluit u het intissue-vriesmedium (bijv. Leica) in bij -25 °C.
- Snijd de vaste weefsels op een microtome en monteer ze op glazen dia's.
- Was de secties in PBS en visualiseer de celkernen met DAPI. Bekijk en fotografeer op een fluorescentiemicroscoop.
3. In vitro rijping (IVM) en in-vitrofertilisatie (IVF)
OPMERKING: De procedure van IVM van IVF werd gevolgd zoals eerder beschreven met kleine wijziging 11,12,13.
- Bereid vers rijpingsmedium (+DHP-medium) voor eierstokdissectie van volwassen zebravisvrouw. Om het verse rijpingsmedium te bereiden, voegt u 9 ml Leibovitz's L-15 medium, pH 9.0, toe aan 15 ml conische buizen. Voeg 10 μL van 17α-20β-dihydroxy-4 pregnen-3-one (DHP) (5 mg/ml), 490 μL dH2O en 500 μL 10% runderserumalbumine (BSA) toe.
- Bereid hanks oplossing en E3-oplossing van tevoren voor. Bereid hanks' oplossing voor zoals beschreven door Baars et al.14. Bereid E3-medium voor: 5 mM NaCl, 0,17 mM KCl, 0,33 mM CaCl2,0,33 mM MgSO4en 1-5% Methyleenblauw.
- Voer dissectie van de eierstok van zebravissen en isolatie van eierstokfollikels uit zoals in stap 2.
- Verzamel volgroeide stadiumfollikels en gebruik als onrijpe oöcyten. Voor elke volwassen vrouwelijke zebravis kunnen ten minste 150-200 volgroeide stadiumfollikels worden geïsoleerd. Selecteer de intacte en gezonde follikels voor IVM.
- Incubeer de volgroeide stadiumfollikels in +DHP-medium in 12-putplaten en controleer regelmatig of de oöcyten intact blijven. Verwijder eventuele lyserende oöcyten met een Pasteur pipet.
OPMERKING: Tijdens de rijping van de oöcyt worden de oöcytcellen geleidelijk doorschijnend. Een meerderheid van de oöcyten wordt doorschijnend na behandeling van DHP gedurende 2 uur. Dit kan worden waargenomen onder een ontledende microscoop met overgedragen lichtoptiek. - Verwijder de buitenste folliculaire cellen uit elke gerijpte oöcyt zoals beschreven in stap 2.3.
- Breng de gedenudeerde oöcyten over naar een petrischaal met een paar druppels kweekmedium en ga verder met bevruchting.
- Bereid de verse spermaoplossing met behulp van teelballen die zijn ontleed van ten minste drie mannen in 500 μL hanks' oplossing. Zet de sperma-oplossing op ijs, waar het zijn bevruchtingskracht tot 2-3 uur kan behouden.
- Voeg 100 μL spermaoplossing toe aan gedenudeerde en gerijpte oöcyten op een petrischaaltje. Voeg voorzichtig de spermaoplossing toe tussen de eieren en wervel het sperma en de eieren samen met behulp van een pipetpunt.
- Voeg onmiddellijk 1 ml E3-mediumoplossing toe om de eieren te activeren en wervel opnieuw voorzichtig eieren en sperma met behulp van een pipetpunt.
- Na ongeveer 1 minuut na bemesting (mpf) overspoelt u de plaat met een E3-mediumoplossing. Volledige koraalexpansie kan worden waargenomen binnen 10-15 mpf.
- Selecteer tussen 35-45 mpf de embryo's die symmetrische decolleté ondergaan in het 2-celstadium en die daarom worden bevrucht. Verwijder embryo's die geen celsplitsing ondergaan.
- Laat embryo's zich ontwikkelen in de petrischaal bij 28 °C, met een limiet van 80 embryo's per plaat van 10 cm. Bekijk en fotografeer de embryoontwikkeling.
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Resultaten
Deze methode kan worden gebruikt om folliculaire cellen en oöcyten te scheiden in verschillende stadia van de ontwikkeling van de eierstokfollikel bij zebravissen. Figuur 1 toont de scheiding van zebravisoocyten en folliculaire cellen van ovariële follikels met behulp van een capillaire glazen buis (figuur 1). Om te onderzoeken of de folliculaire cellen gescheiden waren van intacte follikels, werden de intacte follikels en gescheiden oöcyten van verschillende st...
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Discussie
We beschrijven hier een nieuwe methode voor de eenvoudige en snelle scheiding van folliculaire cellen en oöcyten van eierstokfollikels van zebravissen. Deze methode heeft verschillende voordelen ten opzichte van de conventionele methode. Primair is het sterk toegenomen scheidingsgemak met hoge efficiëntie en effectiviteit, omdat slechts één enkele en externe manipulatie vereist is. Dit punt verhoogt de toepasbaarheid voor onderzoekers die niet goed zijn in microscopische anatomie. Volgens onze ervaring kan men folliculai...
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Openbaarmakingen
De auteurs hebben niets bekend te maken.
Dankbetuigingen
Dit onderzoekswerk werd ondersteund door de National Natural Science Foundation of China [32060170, 31601205 en 31560334], visiting scholar project ondersteund door China Scholarship Council en het fonds van State Key Laboratory of Freshwater Ecology and Biotechnology [2020FB05].
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Materialen
| Naam | Bedrijf | Catalogusnummer | Opmerkingen |
|---|---|---|---|
| 17α,20β-DHP | Cayman | 16146-5 (5 mg) | |
| 24-well plate | Corning | 3524 | |
| Ampoule cutter | AS ONE | 5-124-22 1 zak (100 stuks) | |
| Anhydrous Na2HPO4 | Kaixin Chemical | 500 g | |
| Brine shrimp | Hongjie | 250 g | |
| CaCl2 | Beichen Fangzheng | 500 g | |
| Culture dish | Biosharp | BS-90-D (10STUKS/PK) | |
| DAPI | Solarbio | S2110 (25mL) | |
| Dissecting Microscope | ZEISS | Stemi 305 | |
| Dissection forcep | VETUS | HRC30 | |
| Dissection scissor | Kefu | 160 mm | |
| Fluorescence Stereomicroscope | Leica | M205C | |
| Glass capillary | IWAKI | IK-PAS-5P (200 stuks/PACK) | |
| Hoechst 33342 | Solarbio | C0031 (1 mg) | |
| KCl | Beichen Fangzheng | 500 g | |
| KH2PO4 | Kaixin Chemical | 500 g | |
| Leibovitz’s L-15 medium | Gibco | 41300-039 (10×1L) | |
| MgSO4•7H2O | Beichen Fangzheng | 500 g | |
| Micropipette tips | Axygen | MCT-150-C | |
| NaCl | Beichen Fangzheng | 500 g | |
| NaHCO3 | Beichen Fangzheng | 500 g | |
| Penicilia-streptomycia | Gibco | #15140122 (100 mL) | |
| Stereomicroscope | ZEISS | Discover.v20 |
Referenties
- Clelland, E., Peng, C. Endocrine/paracrine control of zebrafish development. Molecular and Cellular Endocrinology. 312, 42-52 (2009).
- Ge, W. Intrafollicular paracrine communication in the zebrafish ovary: the state of the art of an emerging model for the study of vertebrate folliculogenesis. Molecular and Cellular Endocrinology. 237, 1-10 (2005).
- Li, J., Ge, W. Zebrafish as a model for studying ovarian development: Recent advances from targeted gene knockout studies. Molecular and Cellular Endocrinology. 507, 1-19 (2020).
- Selman, K., Wallace, R. A., Sarka, A., Qi, X. Stages of oocyte development in the zebrafish, Brachydanio rerio. Journal of Morphology. 218, 203-224 (1993).
- Matzuk, M. M., Burns, K. H., Viveiros, M. M., Eppig, J. J. Intercellular communication in the mammalian ovary: oocytes carry the conversation. Science. 296, 2178-2180 (2002).
- Liu, L., Ge, W. Growth differentiation factor 9 and its spatiotemporal expression and regulation in the zebrafish ovary. Biology of Reproduction. 76, 294-302 (2007).
- Zhou, R., Tsang, A. H., Lau, S. W., Ge, W. Pituitary adenylate cyclase-activating polypeptide (PACAP) and its receptors in the zebrafish ovary: evidence for potentially dual roles of PACAP in controlling final oocyte maturation. Biology of Reproduction. 85, 615-625 (2011).
- Li, J., Liu, Z., Wang, D., Cheng, C. H. K. Insulin-like growth factor 3 is involved in oocyte maturation in zebrafish. Biology of Reproduction. 84, 476-486 (2011).
- Pang, Y., Thomas, P. Role of G protein-coupled estrogen receptor 1, GPER, in inhibition of oocyte maturation by endogenous estrogens in zebrafish. Developmental Biology. 342, 194-206 (2010).
- Peyton, C., Thomas, P. Involvement of epidermal growth factor receptor signaling in estrogen inhibition of oocyte maturation mediated through the G protein-coupled estrogen receptor (Gper) in zebrafish (Danio rerio). Biology of Reproduction. 85, 42-50 (2011).
- Welch, E. L., Eno, C. C., Nair, S., Lindeman, R. E., F, P. Functional manipulation of maternal gene products using in vitro oocyte maturation in zebrafish. Journal of Visualized Experiments. (122), e55213(2017).
- Nair, S., Lindeman, R. E., Pelegri, F. In vitro oocyte culture-based manipulation of zebrafish maternal genes. Developmental Dynamics. 242, 44-52 (2013).
- Seki, S., et al. Development of a reliable in vitro maturation system for zebrafish oocytes. Reproduction. 135, 285-292 (2008).
- Baars, D. L., Takle, K. A., Heier, J., Pelegri, F. Ploidy manipulation of zebrafish embryos with heat shock 2 treatment. Journal of Visualized Experiments. , e54492(2016).
- Xie, S. L., et al. A novel technique based on in vitro oocyte injection to improve CRISPR/Cas9 gene editing in zebrafish. Scientific Reports. 6, 34555(2016).
- Li, J., Bai, L., Liu, Z., Wang, W. Dual roles of PDE9a in meiotic maturation of zebrafish oocytes. Biochemical and Biophysical Research Communications. , (2020).
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Herprints en machtigingen
