Methodenartikel

Isoleren en beeldvorming Live, intact pacemakergebieden van het nierbekken van de muis door vibratoomsecties

DOI:

10.3791/62040

⸱

30 april 2021

 ,  , 
1Department of Physiology & Cell Biology, University of Nevada, Reno School of Medicine, 2Department of Physiology & Membrane Biology, University of California School of Medicine, 3Department of Life & Health Sciences, Dundalk Institute of Technology

In dit artikel

Samenvatting

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Het doel van dit protocol is om intacte pacemakergebieden van het nierbekken van de muis te isoleren met behulp van vibratoomsecties. Deze secties kunnen vervolgens worden gebruikt voor in situ Ca2+ beeldvorming om Ca2+ transiënte eigenschappen van pacemakercellen en andere interstitiële cellen in vibratoomsegmenten te verduidelijken.

Samenvatting

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Het nierbekken (RP) is een trechtervormige, gladde spierstructuur die normaal urinetransport van de nier naar de baarmoeder vergemakkelijkt door regelmatige, stuwende samentrekkingen. Regelmatige RP-contracties zijn afhankelijk van pacemakeractiviteit, die afkomstig is uit het meest proximale gebied van de RP bij de bekken-nierverbinding (PKJ). Vanwege de moeilijkheid om toegang te krijgen tot en het behoud van intacte preparaten van de PKJ, hebben de meeste onderzoeken naar RP-pacemaking zich gericht op eencellige elektrofysiologie en Ca2+ beeldvormingsexperimenten. Hoewel uit dergelijk werk belangrijke onthullingen over RP-pacemaking zijn voortgekomen, hebben deze experimenten verschillende intrinsieke beperkingen, waaronder het onvermogen om de cellulaire identiteit nauwkeurig te bepalen in gemengde suspensussingen en het ontbreken van in situ beeldvorming van RP-pacemakeractiviteit. Deze factoren hebben geresulteerd in een beperkt begrip van de mechanismen die ten grondslag liggen aan normale ritmische RP-contracties. In dit artikel wordt een protocol beschreven om intacte segmenten van muis PKJ voor te bereiden met behulp van een vibratome-doorsnedetechniek. Door deze aanpak te combineren met muizen die celspecifieke verslaggevers uitdrukken en genetisch gecodeerde Ca2+ indicatoren, kunnen onderzoekers mogelijk de specifieke celtypen en mechanismen die verantwoordelijk zijn voor peristaltische RP-contracties die essentieel zijn voor normaal urinetransport nauwkeuriger bestuderen.

Inleiding

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Het nierbekken (RP) is een trechtervormige, gladde spierstructuur die urine van de nier naar de urine baarmoeder transporteert. De RP transporteert urine door regelmatige ritmische samentrekkingen (peristaltiek)1,2,3,4,5te genereren , die een bolus urine van de nier distaal naar de urine baarmoeder en uiteindelijk naar de blaas stuwt, waar het wordt opgeslagen totdat mictie optreedt6,7. Verlies van deze regelmatige activiteit heeft ernstige gevolgen, waaronder hydronefrose en nierfalen1,3,8; daarom is het van cruciaal belang om de mechanismen te bestuderen die ten grondslag liggen aan regelmatige, ritmische RP-contracties. Peristaltische contracties komen voort uit het meest proximale gebied van de RP-in de bekken-nierverbinding (PKJ)9,10,11,12,13,14,15 ( Figuur1A-C) en verspreiden zich distaal om urine van de papillen in de RP te duwen ( Figuur1B). Elektrische pacemakeractiviteit wordt in de PKJ geregistreerd als spontane voorbijgaande depolarisaties10,11,12,13,15,16,17, waarvan wordt aangenomen dat ze afkomstig zijn van gespecialiseerde pacemakercellen. Deze pacemakercellen, voorheen atypische gladde spiercellen (ASMC's) genoemd, worden verondersteld pacemakeractiviteit te genereren of te coördineren en de samentrekkingen van "typische" gladde spiercellen (SMCs)9,10,11,18,19,20,21,22,23aante drijven.

ASMC's komen het meest voor in de proximale RP, bij de PKJ(figuur 1A-C),waar peristaltische samentrekkingen en elektrische pacemakeractiviteit ontstaan5,7,8,9,12,13,14,16,17,18,19,20,21 ,22. Een onlangs gepubliceerde studie van deze groep identificeerde bloedplaatjes-afgeleide groeifactor receptor-alfa (PDGFRα), in combinatie met gladde spier myosine zware keten (smMHC), als een unieke biomarker voor deze interstitiële cellen (IC's)24, een bevinding die is bevestigd door andere groepen25. Op basis van hun morfologie en eiwitexpressiepatroon werden deze cellen PDGFRα+ IC type 1 (PIC1)24,26genoemd . PIC1's bevinden zich in de spierlaag van de PKJ, waar ze hoogfrequente, kortdure Ca2+ transiënten vertonen, waarvan wordt gedacht dat ze ten grondslag liggen aan de generatie van pacemakerpotentiaal24. Er bestaan echter andere celtypen in de PKJ, waaronder niet-smMHC-expresserende PDGFRα+ IC's (PIC2's) in de adventitiale laag. Eerdere rapporten hebben gesuggereerd dat niet-smMHC-IC 's kunnen deelnemen aan de regulering van pacemakeractiviteit19. Verdere studie van niet-smMHC-IC's wordt echter belemmerd door een slecht onderscheid tijdens Ca2+ beeldvormingsstudies. Meestal worden heterogene celtypen binnen de RP-preparaten willekeurig geladen met Ca2+gevoelige kleurstoffen (bijv. Fluo-4). Om deze uitdagingen te overwinnen en een verscheidenheid aan celtypen in de RP te bestuderen, kunnen genetisch gecodeerde Ca2+ indicatoren (GECI's) worden gebruikt om selectief Ca2+gevoelige fluoroforen uit te drukken in celtypen van belang.

De meeste studies die ca2+ transiënte eigenschappen in PIC1s/ASMC 's verduidelijken , werden bereikt door beeldvorming van flat-sheet RP weefselpreparaten19,21,27. Aangezien PIC1's het enige celtype in de PKJ zijn dat smMHC uitdrukt, is voorwaardelijke expressie van de GECI, GCaMP, in smMHC+ cellen geschikt om PIC1's in deze configuratie te bestuderen. Aangezien PIC1's en PIC2's echter beide PDGFRα uitdrukken, verbieden voorwaardelijke expressie van GCaMP-varianten in PDGFRα+ cellen celonderscheid in vlakbladpreparaten. Om dit probleem te omzeilen, werd een vibratome-doorsnedebenadering gebruikt om PIC1's en PIC2's over de PKJ-weefselwand te onderscheiden24. Om deze discrete cellulaire populaties te onthullen, werd de RP coronally gesectied, waardoor het mogelijk was om PIC2's in de adventitia en PIC1's in de spierwand te identificeren op basis van bekende immunohistochemische etiketterings- en GECI-expressiepatronen. Als gevolg van deze nieuwe PKJ-beeldvormingsbenadering bleken PIC1's en PIC2's verschillende Ca2+ signaleringseigenschappen weer te geven24. Bovendien werd door het isoleren van de meest proximale delen van het PKJ-gebied (figuur 2) het pacemakergebied van de RP bewaard op een manier die nog niet eerder was bereikt. Hier wordt een protocol beschreven om te laten zien hoe PKJ-preparaten van de muisnier kunnen worden geïsoleerd met behulp van vibratoomsecties, hoe deze preparaten kunnen worden ingesteld voor Ca2+ beeldvormingsexperimenten en hoe de verschillende celtypen over de PKJ-wand kunnen worden onderscheiden.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Alle gebruikte muizen en de protocollen die in deze studie werden beschreven, waren in overeenstemming met de National Institutes of Health Guide for the Care and Use of Laboratory Animals en de Institutional Animal Use and Care Committee van de Universiteit van Nevada, Reno, NV. Experimenten en diergebruik voldeden ook aan de beginselen en voorschriften zoals beschreven in Grundy28.

1. Genereer PDGFRα-GCaMP6f en SMCGCaMP3 muizen

  1. Kruis GCaMP6flox/+ muizen (B6; 129S-Gt(ROSA)26Sortm95.1(CAG-GCaMP6f)Hze/J) met PDGFRαCre muizen (C57BL/6-Tg(Pdgfra-cre)1Clc/J) om PDGFRα-GCaMP6f muizen te genereren.
  2. Kruis GCaMP3lox/+ muizen (B6.129S-Gt(ROSA)26Sortm38(CAG-GCaMP3)Hze/J) met mannelijke smMHCCreERT2 muizen (B6. FVB-Tg(Myh11-cre/ERT2)1Soff/J) om SMC-GCaMP3 muizen te genereren.
    OPMERKING: Alleen mannelijke muizen van het kruis(GCaMP3lox/+ muizen en smMHCCreERT2 muizen) kunnen worden gebruikt omdat Cre expressie wordt aangedreven door het Y chromosoom. smMHCCreERT2 muizen kunnen ook worden gekruist met GCaMP6flox/+ muizen voor een verbeterde Ca2+ signaal-ruisverhouding en snellere Ca2+ signaal temporele eigenschappen.

2. Bereid transgene muizen voor en injecteer ze met tamoxifen om voorwaardelijke expressie van GCaMP te induceren

  1. Activeer inducible Cre recombinase voor celspecifieke GCaMP-expressie in specifieke celtypen, zoals eerder beschreven29.

3.   Bereid oplossingen voor

  1. Bereid 1 L Krebs-Ringer bicarbonaat (KRB) oplossing met 120,35 mM NaCl, 5,9 mM KCl, 15,5 mM NaHCO3,1,2 mM Na2HPO4, 1,2 mM MgCl2, 11,5 mM glucose en 2,5 mM CaCl2. Houd de KRB-oplossing op de dag van gebruik op ijs.
    OPMERKING: KRB kan maximaal een week bij 4 °C worden bewaard en moet vóór gebruik ten minste 10 minuten voor gebruik worden voorgekneed met een mix van 97% O2 en 3% CO2.

4. Bereid met silicium elastomeer bedekte dissectie en microscoopbeeldvormingsgerechten

  1. Meng componenten van silicium elastomeer volgens de instructies van de fabrikant. Vul een petrischaal van 35 mm x 10 mm en een petrischaal van 60 mm x 15 mm, ongeveer een vierde vol vloeibaar silicium elastomeer voor respectievelijk beeldvormingsexperimenten en dissectie. Polymeriseer het silicium elastomeer gedurende 1 dag voor gebruik bij 37 °C.
    OPMERKING: Om het contrast van dunne niersecties te verbeteren, breng een kleine, zwarte cirkel papier aan op de basis van de beeldvormende Petrischaal voordat u deze vult met silicium elastomeer.

5. Nierdissectie

  1. Verdoof muizen door inademing van 3-4% isofluraan in een geventileerde kap. Bevestig de inductie van diepe anesthesie door verlies van teen- en/of staartknijpreflex en euthanaseer de muizen vervolgens door cervicale dislocatie.
  2. Breng 70% ethanol aan op de borst om de vacht te dempen. Open met behulp van een externe dissectieschaar de buikholte via een longitudinale incisie, met schaarbladen schuin van het dier om schade aan de inwendige organen te voorkomen.
  3. Knijp met behulp van interne weefseldop en interne dissectieschaar de darmen en til ze weg van de buikwand. Snijd tijdens het heffen van de darmen de onderkant van de darmen vrij van het lichaam bij de proximale twaalfvingerige darm en distale dikke darm om toegang te krijgen tot de retroperitoneale ruimte die de nieren bevat.
  4. Zodra de nieren zijn blootgesteld, extraheer ze afzonderlijk. Knijp voorzichtig en til het distale uiteinde van de ureter (~ 4 mm van de nier) met weefselduw. Snijd met behulp van de dissectieschaar onder de beknelde urine naar de nier. Blijf onder de nier snijden totdat deze is bevrijd van het omliggende bindweefsel.
    OPMERKING: Om de weefselintegriteit en snijconsistentie tijdens het doorsnijden van het vibratoom te maximaliseren, moet de nier zo intact mogelijk zijn. Om dit te garanderen, vermijdt u knijpen of snijden van de nier met een tang en dissectieschaar.
  5. Plaats de nier met aangegebouwde ureter in een ijskoude KRB-oplossing. Herhaal stap 5.4 en 5.5 met de contralaterale nier. Houd de nieren in KRB-oplossing op ijs.
    OPMERKING: Ga onmiddellijk naar het volgende deel van het protocol om de levensvatbaarheid van PKJ-weefsel te behouden. Vanwege de anatomische locatie diep in het nierparenchym, is de PKJ beroofd van contact met KRB-oplossing.

6. Bereid de nier voor op vibratoomdoorsneden

  1. Breng de nier over in een met silicium elastomeer bedekte dissectieschaal (60 mm x 15 mm) en vul deze met ijskoude KRB-oplossing totdat de nier volledig is ondergedompeld.
  2. Onder een ontledende microscoop, verankeren de nier aan de basis van de schotel door het invoegen van minutien pinnen in de proximale ureter en door de dunne voorste niercapsule of omliggende vetweefsel.
    OPMERKING: Zorg ervoor dat u het nierparenchymweefsel niet doorboort.
  3. Gebruik een fijne veerschaar en interne tang om vetweefsel uit de basis van de nier te verwijderen om de distale RP en proximale urine baarmoeder bloot te leggen.
  4. Verwijder de proximale ureter en een deel van de distale RP van de basis van RP met behulp van een fijne veerschaar.
    OPMERKING: Zorg ervoor dat u het omringende nierparenchym niet snijdt. De zwarte stippellijn in figuur 1A geeft de geschatte positie van deze snede aan. Deze snede creëert een vlakke basis op de nier voor meer uniforme weefseldoorsneden. Bij het ontleden van de nier moet men zich bewust zijn van de anatomische positie van het PKJ-gebied. Figuur 1B laat zien dat de intacte nier langs een sagittale vlak kan worden gesneden om de medulla, papilla (distale medulla waar verzamelkanalen samenkomen) en proximale en distale RP bloot te leggen. Als de papilla volledig zou worden blootgesteld, zoals in figuur 1C, kunnen de PKJ en proximale RP (prox RP) worden gevisualiseerd. Dit mag echter niet worden gedaan voor de vibratome-techniek; deze beschrijving is om de lezer te oriënteren op de PKJ-locatie in het algemeen, benadrukt in het anatomische verschil dat wordt getoond in de verzonden lichtbeelden van het PKJ-gebied en het midden-RP-gebied in figuur 1D,E.
  5. Doorboor de buitenste niercapsule met een tang met fijne punt en hengel de uiteinden weg van het nierlichaam. Knijp met behulp van een tang met elke hand de losse uiteinden van de capsule en pel ze uit elkaar. Blijf het resterende niercapsulemembraan afpellen totdat het volledig is verwijderd.
    OPMERKING: De niercapsule is een taaie, vezelige laag die de nier omringt. Het moet worden verwijderd voordat het vibratome wordt doorsneden voor optimaal snijden.

7. Bereid het vibratome-instrument voor en kalibreer het

  1. Steek een scheermesje in de meshouder van het vibratome-instrument en stel de hoek van de bladspeling in op ~18°.
    OPMERKING: Als optionele stap voor doorsneden van hogere kwaliteit moet een kalibratieblok (voorzien van enkele vibratoominstrumenten) worden gebruikt om de positie van het zaagblad aan te passen voor elk nieuw mes dat volgens de instructies van de fabrikant wordt gebruikt. Dit zorgt voor een optimale positionering van het mes en minimaliseert verticale trillingen.
  2. Stel de snelheid van de bladvervordering in op 0,2 mm/s, de horizontale trilling/glans van het blad tot een amplitude van 2,00 mm en de Z-stapgrootte van het blad tot ~100-150 μm. Zorg ervoor dat de dikte van de niersectie niet groter is dan 150 μm, omdat dit een negatieve invloed heeft op Ca2+ beeldvormingsexperimenten (omdat de PKJ-wand vaak op zichzelf rolt en vouwt als deze te dik is).
    OPMERKING: De gebruiker moet deze snijparameters verfijnen, omdat de instellingen variëren tussen individuele nierpreparaten en vibratoominstrumenten. Finetuning moet plaatsvinden tijdens het doorsnijden wanneer de gebruiker secties onder een microscoop visueel kan inspecteren, zoals beschreven in stap 7.2.
  3. Installeer een ijsbad en bufferbak op het vibratome-instrument. Vul het ijsbad met gemalen ijs en vul het binnenste podiumgebied met een ijskoude KRB-oplossing (vul tot ongeveer halfvol). Controleer en vervang tijdens het trillen het gesmolten ijs.

8. Vibratome die de nier doordrent

  1. Gebruik een stompe tang om de voorbereide nier voorzichtig vast te pakken en te verwijderen uit een ijskoude KRB-oplossing. Plaats de nier onmiddellijk op absorberend papier gedurende ~ 2-4 s om overtollig extern vocht te verwijderen. Rol de nier voorzichtig over het absorberende papier om ervoor te zorgen dat alle zijden van het parenchym zijn opgedroogd, zodat er een optimale hechting van de nier aan het vibratoomstadium is.
    OPMERKING: Aangezien de RP zich in de nier bevindt en daarom wordt beschermd door het buitenste parenchym, zou deze korte droogperiode niet schadelijk zijn voor de weefselintegriteit.
  2. Breng onmiddellijk een dunne laag cyanoacrylaatlijm (~ 1 cm2) aan op de basis van de vibratoommonsterplaat en gebruik een stompe tang om de nier, ureterzijde naar beneden, op het met lijm bedekte gebied te plaatsen. Oefen voorzichtig neerwaartse druk uit op de bovenkant van de nier met de platte rand van de tang gedurende ongeveer 10-20 s om de lijm te drogen.
    OPMERKING: Om de nier tijdens deze procedure te stabiliseren, gebruikt u een extra tang om de nier rechtop te houden terwijl de lijm droogt. Het is van cruciaal belang dat de nier zich rechtop aan de monsterplaat hecht, zodat secties recht worden gesneden. Om ervoor te zorgen dat de nier zich met succes aan de monsterplaat heeft vastgekleefd, duwt u voorzichtig de zijkant van de nier. Als de nier zich met succes aan de plaat heeft vastgemaakt, moet de basis van de nier aan de plaat blijven vastzitten.
  3. Bevestig de monsterplaat stevig aan de onderkant van de bufferlade. Pas het krb-gehalte aan zodat de bovenkant van de nier volledig wordt ondergedompeld. Verwijder tijdens het doorsnijden van de snijbladen, terwijl het vibratoomblad dieper in de bufferlade beweegt, de KRB-oplossing, zodat de meshouder niet in de oplossing wordt ondergedompeld.
    OPMERKING: Als de lijm niet volledig is opgedroogd voordat u doorgaat met deze stap, zal de lijm vaak omhoog gaan van de basis en naar het nierparenchym. Deze overtollige lijm maakt het doorsnijden variabeler. Als dit gebeurt, verwijdert u de nier van de plaat en gaat u verder met een nieuw nierpreparaat.
  4. Voor automatische vibratoomdoorsneden selecteert u de begin- en eindposities van de vibratomebladsnijcyclus. Controleer of deze posities ~0,5-1 cm vrij van de nier zijn om ervoor te zorgen dat bij elke bladverbetering het hele niervlak wordt doorsneden.
  5. Bereid een meerputplaat (24- of 48-well) door putten te vullen met KRB-oplossing en plaats de plaat op ijs.
    OPMERKING: Wanneer ze worden gegenereerd, moeten afzonderlijke secties in afzonderlijke putten worden geplaatst om de sectiediepte bij te houden.
  6. Start het automatische snijproces. Zorg er tijdens de eerste doorgang van het mes voor dat het mes contact maakt met de bovenkant van de nier. Als er geen contact wordt gemaakt, moet u de startpositie Z van het zaagblad aanpassen.
  7. Verzamel met behulp van een tang secties die uit de nier zijn bevrijd. Breng de secties onmiddellijk over naar afzonderlijke putten en noteer de Z-diepte van de secties om de geschatte PKJ-locatie binnen niersecties te meten.
    OPMERKING: Afhankelijk van de snijparameters kunnen sommige secties niet los van het nierblok worden gesneden. Als dit gebeurt, gebruik dan voorzichtig een fijne veerschaar om secties uit het nierblok te knippen. Gebruikers worden ook aangemoedigd om secties actief te visualiseren onder een lichtmicroscoop terwijl ze vrij zweven in individuele putten om optimale snijinstellingen en weefsellocatie te garanderen. Secties die de PKJ bevatten, worden meestal ~ 1000-1500 μm afgeleid van de bovenkant van de nier.
  8. Ga door met het doorsnedeprotocol totdat de PKJ-regio's duidelijker worden. Raadpleeg de sectie representatieve resultaten voor een beschrijving van de PKJ-regio's als doorsnedeopbrengsten.
  9. Optimaliseer op dit punt de doorsnedeparameters om ervoor te zorgen dat secties gelijkmatig uit het nierblok worden bevrijd en intact blijven. Zorg er bovendien voor dat de PKJ-regio's continu en ononderbroken zijn, omdat gebroken PKJ-wanden geen adequate beeldvorming van cellen in de muur mogelijk maken als gevolg van instorting. Als muren kapot gaan, vermindert u de doorsnedesnelheid en verhoogt u de doorsnededikte en blijft u secties observeren onder een lichtmicroscoop om de snijparameters te verfijnen.
  10. Bewaar secties bij 4°C in KRB-oplossing totdat het experimenteren begint.

9. Nierschijf Ca2+ beeldverwerving

  1. Breng een individuele nierschijf over in een met silicium elastomeer bedekte beeldvormingsschaal (35 mm x 10 mm) en vul de schaal onmiddellijk met verse, ijskoude KRB-oplossing.
  2. Plaats minutienpennen rond de rand van een nierschijf om de sectie aan de basis van de beeldvormingsschaal te beveiligen.
    OPMERKING: Deze stap is van cruciaal belang om te voorkomen dat de sectie beweegt wanneer fysiologische oplossingen tijdens de beeldvorming over het segment worden doordrenkt.
  3. Plaats de beeldvormingsschaal op het podium van een rechtopstaande confocale microscoop met spinschijf en begin onmiddellijk met perfusing met KRB-oplossing.
    OPMERKING: In dit protocol werd een rechtopstaande microscoop gebruikt die was uitgerust met een snelle Nipkow-spinschijfconocale scannereenheid.
  4. Houd de perfusiesnelheid op 3 ml/min en de KRB-oplossingstemperatuur op 36 ± 1 °C. Laat het segment vóór de beeldvorming 1 uur equilibreren.
  5. Selecteer de juiste dichroïsche beeldvormingskubus en lasers. Verkrijg beelden met een elektronvermenigvuldigingsapparaat (EMCCD) of een wetenschappelijke aanvullende metaaloxide-halfgeleidercamera.
    OPMERKING: Het confocale systeem in dit protocol is uitgerust met een 488 nm laser om GCaMP6f of GCaMP3 te prikkelen. Beelden werden verkregen met behulp van een EMCCD-camera van 512 pixels x 512 pixels.
  6. Gebruik een lens met een lage vergroting en wateronderdompelingsdoelstelling (4x of 10x) om de nierschijf te lokaliseren. Centreer het beeldvormingsveld op gebieden van het segment waar de PKJ aanwezig is. Identificeer oriëntatiepunten, zoals afgebeeld in figuur 2D, om de PKJ te lokaliseren (d.w.z. halve cirkels van spierweefsels die tussen parenchymweefsel hangen).
  7. Zodra de PKJ zich bevindt, gebruikt u een hogere vergroting van de wateronderdompelingslens (20x, 40x of 60x) om het interessegebied te vergroten.
    OPMERKING: In dit protocol was de 20x objectieve numerieke opening (NA) 1.0, de 40x objectieve NA was 0.8 en de 60x objectieve NA was 1.0.
  8. Onderscheid verschillende cellen van belang in de PKJ-wand met behulp van transgene muizen die GCaMP6f of GCaMP3 uitdrukken in respectievelijk PDGFRα+ cellen of SMC's. Let op de verschillende soorten Ca2+ transiënte duur in PDGFRα+ cellen in de PKJ-wand in PDGFRα+ GCaMP6f+ nierschijfjes(figuur 3C, zie representatieve resultaten voor beschrijving) en in GCaMP3+ SMCs in SMC GCaMP3+ nierschijfjes (figuur 3D, zie representatieve resultaten voor beschrijving).
  9. Zodra cellen van belang in PKJ-wand zijn geïdentificeerd, past u de laserintensiteit aan om een goede signaal-ruisverhouding te produceren. Neem beelden op met een tijdsbemonsteringsfrequentie tussen 16 Hz en 32 Hz met behulp van de juiste acquisitiesoftware.
    OPMERKING: Afhankelijk van de laserintensiteit die tijdens de beeldvorming wordt gebruikt, wordt aanbevolen om het aantal opnamen te beperken vanwege de bleekeffecten op Ca2+ fluoroforen. De gebruiker moet de opnamelengte kiezen op basis van de specifieke experimentele doelstellingen.

10. Ca2+ beeldvormingsanalyse

  1. Voer Ca2+ beeldvormingsanalyses uit van verschillende celtypen in PKJ-pacemakerregio's door spatiotemporale mapping zoals eerder beschreven voor andere intacte pacemakerpreparaten in het maagdarmkanaal29,30.

Resultaten

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

In situ Ca2+ beeldvorming van de PKJ kan belangrijke cellulaire activiteit van RP pacemakercellen onthullen. Door muizen te gebruiken die genetisch gecodeerde Ca2+ indicatoren (zoals GCaMP) uitdrukken, aangedreven door celspecifieke promotors, kan informatie over RP-tempovorming met nauwkeurigheid en detail worden verkregen die niet mogelijk is uit Ca2+ beeldvormingsexperimenten van flat-sheet RP-preparaten. Het begin van de PKJ onderscheidt zich door het plotselinge verschijnen van halve spiercirkels die zijn opgehangen tussen nierparenchymal weefsel (figuur 2C; proximale PKJ ingesloten in een onderbroken doos). Tijdens volgende doorsneden wordt de binnenste medulla te onderscheiden van het omringende corticale weefsel. Onder een lichtmicroscoop lijkt de binnenste medulla geribbeld in gebieden, lichter van kleur in vergelijking met corticale weefsel en discontinu op zijn lange as met de rest van de nier (Figuur 2B, D). Op dit moment zullen er meer PKJ-regio's verschijnen. Voorbeelden hiervan zijn te zien in figuur 2D (onderbroken rechthoeken, H en G) waar 3 halve spiercirkels worden opgehangen door parenchymweefsel. Deze spierbanden zullen nauw worden afgestemd op de binnenste papilla en zullen meestal naast een renale arteriole(figuur 2D,onderbroken rechthoeken; Figuur 2F-H, zwarte pijlpunten). Naarmate meer distale secties worden afgeleid, zullen deze spierbanden integreren om een completere, uniforme structuur te vormen, die het einde van het PKJ-gebied aangeeft (figuur 2E).
Figuur 3A,B toont een PKJ-sectie bij laag vermogen (4-10x) van een muis die GCaMP uitdrukt in PDGFRα+ cellen (GCaMP6f uitgedrukt door inductieve Cre-recombinase aangedreven door Pdgfra). Met behulp van oriëntatiepunten zoals de renale arteriole(figuur 3A; asterisk) moeten experimenteerders gemakkelijk een onderscheid kunnen maken tussen de dunne PKJ-wand die tussen parenchymweefsel hangt (figuur 3B; sterretjes). De expressie van GCaMP6f in dit specifieke transgene weefsel is verspreid over de gehele breedte van de PKJ, over zowel de spier- als de adventitale lagen (figuur 3C).

In PDGFRα+ GCaMP6f+ nierschijfjes zal een netwerk van cellen dat zich doorgaans uitstrekt over de breedte van de PKJ-wand fluorescerend zijn (figuur 3C) en oscillerende Ca2+ transiënten van verschillende duur en frequenties weergeven. PDGFRα+ cellen in de PKJ-wand geven twee verschillende soorten Ca2+ transiënte duur weer. In de adventitiale laag (dichter bij de cortex) worden PDGFRα+ cellen gedefinieerd die aanwezig zijn als een netwerk van cellen en hun processen. Adventitiale PDGFRα+ cellen vertonen laagfrequente (4 ± 2,7 Hz) en lange duur (1 ± 0,67 s) Ca2+ transiënten. De tweede laag PDGFRα+ cellen, aanwezig in de spierlaag (dichter bij de medulla georiënteerd), vertoont vergelijkbare Ca2+ transiënte frequenties en duur als SMC GCaMP3+ cellen (hieronder beschreven) omdat ze hetzelfde celtype zijn.

In SMC GCaMP3+ nierschijfjes is een laag GCaMP3+ cellen aanwezig in de spierlaag ( Figuur3D). Er zal geen fluorescerend signaal in de adventitiale laag zijn(figuur 3D; asterisk). GCaMP3+ SMC's in de spierlaag vertonen doorgaans hoogfrequente (10 ± 4 Hz) en korte duur (632 ± 74 s) Ca2+ transiënten. PDGFRα+ cellen in de PKJ adventitia roepen langdurige, laagfrequente Ca2+ transiënten op (Figuur 3E, Video 1). Ca2+ beeldvormingsexperimenten van weefseluitdrukkende GCaMP3 aangedreven door de Myh11 promotor zijn echter beperkt tot het spieraspect van de PKJ (Figuur 3D). In vergelijking met PDGFRα+ cellen in de adventitia hebben SMC's vaker een kortere duur ca2+ transiënten afgevuurd (Figuur 3F, Video 2).

Naast het begrijpen van signaleringseigenschappen in PKJ PDGFRα+ IC's, is de toepassing van deze techniek om andere celtypen in de vibratoom-gesectiede nier te bestuderen in dit artikel aangetoond. Bij nauwkeurig onderzoek van de renale medulla (bij muizen die GCaMP6f uitdrukken in PDGFRα+ cellen), werd een reeks fluorescerende Ca2+ signalen in en rond verzamelkanalen (Video 3) waargenomen. Medullaire PDGFRα+ cellen vuurden spontane Ca2+ transiënten van variabele frequentie en duur af. Deze Ca2+ beeldvormingsstudies van nier vibratoomsecties kunnen ook worden uitgebreid tot het bestuderen van renale arteriolen (~50-80 mm diameter) die vaak naast PKJ spiersegmenten liggen(figuur 2F,G; witte pijlen). Ca2+ beeldvorming van renale arteriolen (van weefsel dat GCaMP uitdrukt in gladde spiercellen) toont oscillerende Ca2+ transiënten in SMC's (Video 4).

figure-results-1
Figuur 1: Basis nieranatomie en locatie van pkj pacemaker gebied. (A) Diagram van de intacte nier met de oriëntatie van de RP en ureter. De nierslagader en de nierader worden respectievelijk in rood en blauw weergegeven. (B) De intacte nier kan langs een sagittale vlak worden gesneden om het binnenste aspect van de nier bloot te leggen, waaronder de medulla, papilla (distale medulla waar verzamelkanalen samenkomen) en proximale en distale RP. (C) De medulla en papilla kunnen worden verwijderd om de PKJ en prox RP volledig bloot te leggen. (D en E) vertegenwoordigen verzonden lichtbeelden uit respectievelijk het PKJ-pacemakergebied en distale RP. Sequentiële doorsneden naar het distale uiteinde van het bekken resulteren in de halve cirkels van spieren in het PKJ-gebied (Di) die worden gecombineerd tot één, dikkere spierring (Ei) die de hele papilla inkapselt. Zwarte, onderbroken rechthoeken in Di en Ei tonen geschatte gebieden in coronale niersecties waar doorgezonden lichtbeelden werden verkregen. De oriëntatie van de afbeeldingen D en E is 90° tegen de wijzers van de klok in ten opzichte van de respectievelijke insets (Di en Ei). Schaalbalken in D en E = 20 μm. Afkortingen: RP = nierbekken; prox RP = proximale nierbekken; PKJ = bekken-nierverbinding; PICs = van bloedplaatjes afgeleide groeifactor receptor-alfa-positieve interstitiële cellen; SMC = gladde spiercel. Klik hier om een grotere versie van deze afbeelding te bekijken.

figure-results-2
Figuur 2: Vibratome-doorsneden van hele nieren om dunne secties te genereren. (A) Nieren worden aan de ureterzijde aan de basis van het vibratoominstrument gemonteerd en een standaardblad (bevestigd aan de vibratoomkop) wordt gebruikt om sequentiële secties van het proximale tot distale uiteinde van de nier te snijden. (B) Schematische weergave van een dunne doorsnede uit de hele nier met geannoteerde oriëntatiepunten. PKJ spiersegmenten (zwarte stippel rechthoek) worden vaak gevonden opgehangen tussen parenchym weefsel. (C) Licht microscopisch beeld van een proximale niersectie. Het verschijnen van spierbanden die tussen parenchym weefsel hangen, duidt op het begin van de proximale PKJ-projecties (aangegeven in een witte stippelrechthoek). (D) Licht microscopisch beeld dat het optimale gebied vertegenwoordigt waar meerdere (2-3) PKJ-segmenten te vinden zijn (gebieden binnen witgestreepte rechthoeken). Dunne PKJ spierstrips worden opgehangen tussen het nierparenchym en sluiten nauw aan op renale arteriolen en medulla. (E) Licht microscopisch beeld van een distale niersectie. Individuele spiersegmenten zijn samengevoegd tot een enkele, continue spierband (witte stippelrechthoek) die de binnenste papilla omringt (niet aanwezig in deze afbeelding). Schaalbalken C-E = 500 μm. F-H Ingezoomde (20x) gebieden van paneel D geven de locatie van de PKJ (zwarte pijlpunten), renale arteriolen (witte pijlpunten) en snijplaatsen voor het isoleren van de PKJ (gestreepte witte lijnen) aan. Schaalbalken F-H = 100 μm. Afkorting: PKJ = bekken-nierverbinding. Klik hier om een grotere versie van deze afbeelding te bekijken.

figure-results-3
Figuur 3: Ca2+ beeldvorming van vibratoomsecties. (A) Representatief beeld met laag vermogen (4x) van een vibratoomsectie die de locatie van de renale arteriole aanduidt (asterisk). Schaalbalk = 200 μm. (B) Ingezoomd (20x) representatief beeld van de PKJ (gelabeld) opgehangen tussen nierparenchymale weefselafbakeningslocaties van de PKJ-spier (witte pijlpunt), renale arteriole (asterisk). Schaalbalk = 50 μm. (C) High-power (40x) afbeelding van de PKJ die GCaMP uitdrukt in PDGFRα+ cellen. Schaalbalk = 20 μm. (D) High-power (20x) afbeelding van de PKJ die GCaMP uitdrukt in gladde spiercellen. Schaalbalk = 20 μm. (E) Spatiotemporale kaart van Ca2+ transiënten bemonsterd uit een GCaMP+ PDGFRα+ cel aangegeven in paneel C. Tabel opzoeken gecodeerd voor F/F0. (F) Spatiotemporale kaart van Ca2+ transiënten bemonsterd uit een GCaMP+ PDGFRα+ cel aangegeven in paneel D. Tabel opzoeken gecodeerd voor F/F0. (G) Representatieve gegevens voor Ca2+ transiënte frequentie (Hz) voor GCaMP+ PDGFRα+ cellen en GCaMP+ smMHC cellen. (H) Representatieve gegevens voor Ca2+ transiënte duur(en) voor GCaMP+ PDGFRα+ cellen en GCaMP+ smMHC cellen. Afkortingen: PKJ = bekken-nierverbinding; PDGFRα+ = bloedplaatjes-afgeleide groeifactor receptor-alfa-positief; smMHC = gladde spier myosine zware ketting. Klik hier om een grotere versie van deze afbeelding te bekijken.

Video 1: Spontane Ca2+ transiënten in GCaMP+ PDGFRα+ cellen in PKJ vibratoomsecties. Afkortingen: PKJ = bekken-nierverbinding; PDGFRα+ = bloedplaatjes-afgeleide groeifactor receptor-alfa-positief. Klik hier om deze video te bekijken. (Klik met de rechtermuisknop om te downloaden.)

Video 2: Spontane Ca2+ transiënten in GCaMP+ gladde spiercellen in bekken-nier junction vibratoom secties. Klik hier om deze video te bekijken. (Klik met de rechtermuisknop om te downloaden.)

Video 3: Spontane Ca2+ transiënten in GCaMP+ PDGFRα+ cellen in renale medullaire vibratoomsecties. Afkorting: PDGFRα+ = bloedplaatjes-afgeleide groeifactor receptor-alfa-positief. Klik hier om deze video te bekijken. (Klik met de rechtermuisknop om te downloaden.)

Video 4: Lage amplitude Ca2+ transiënte activiteit in de vibratoomsecties van de renale arteriole. Klik hier om deze video te bekijken. (Klik met de rechtermuisknop om te downloaden.)

Discussie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

De RP bestaat uit een heterogene populatie van cellen met differentiële celdichtheden waargenomen in verschillende RP-regio's. PIC1's (voorheen ASMC's genoemd) komen het meest voor in de PKJ, waar de activiteit van de pacemaker ontstaat24. Het protocol, dat hier wordt beschreven, stelt onderzoekers in staat om het pacemakergebied te isoleren van de rest van de muisnier. Door delen van PKJ te snijden met behulp van een vibratoom, worden de pacemakergebieden van de RP (geïdentificeerd als spierbanden die aan parenchym zijn bevestigd) intact gehouden, waardoor het gebruik van in situ beeldvorming mogelijk is om RP-pacemakercellen nauwkeurig te bestuderen in combinatie met celspecifieke fluorescentiereporters.

Hoewel deze aanpak nieuwe inzichten kan bieden in RP-tempovorming, zijn er enkele overwegingen die experimenteerders moeten kennen om beeldresultaten en sectioning-efficiëntie te verbeteren. Voor een ongetrainde gebruiker is deze methode van PKJ-isolatie en beeldvorming gemakkelijker te leren dan typische scherpe dissectie van flat-sheet RP-preparaten. Scherpe dissectie van RP uit hele nieren vereist weken van consistente oefening om met succes levensvatbare weefsels te isoleren voor fysiologie-experimenten. Omdat dit vibratome sectioning protocol weinig scherpe dissectiekennis vereist, is het toegankelijk voor gebruikers die geen ervaring hebben met het ontleden van andere gladde spierstructuren.

Er zijn echter enkele kritieke punten om op te merken voor dit protocol. Het succesvol vasthouden van nieren aan de vibratome specimen plaat vereist behendigheid en geduld. Als de nier verkeerd is georiënteerd en naar één kant leunt, worden schuine in plaats van rechte delen gesneden. Vanwege de delicate aard van de PKJ kan de schuine hoek vaak de spierbanden van het pacemakergebied vernietigen. Bovendien resulteert beeldvorming van schuine secties in een slechte acquisitie van beeldvorming, omdat celnetwerken zich meestal niet in hetzelfde brandpuntsvlak bevinden. De procedure is ook tijdrovend, waarbij het doorsnijden van een enkele nier vaak tot een uur duurt, gedurende welke tijd de installatie monitoring vereist.

Terwijl de beweging van het vibratoom kan worden versneld, als de snelheid te veel wordt verhoogd (>20% dan wat in het protocol wordt aanbevolen), zal het mes de nier versnipperen in plaats van netjes snijden, wat resulteert in verlies van delicate PKJ-structuren. Evenzo kan een te lage snijsnelheid ervoor zorgen dat de sectie gekarteld wordt. Optimalisatie van snijsnelheid en bladamplitude is essentieel. Bij het hanteren van vibratoomsecties moet ook voorzichtig worden omgegaan. Door hun delicate aard worden PKJ-spieren gemakkelijk verstoord tijdens het hanteren en kunnen ze scheuren. Een goed opgeleide gebruiker kan ongeveer 1-2 PKJ-regio's oogsten per 4 nierschijfjes die geschikt zijn voor Ca2+ beeldvormingsexperimenten. Meestal hebben PKJ-secties die niet voldoen aan Ca2+ beeldvormingscriteria: 1) slechte GCaMP-expressie, 2) een verwrongen PKJ-muur of 3) een gebroken PKJ-muur. Voor gegevensanalyse kunnen ongeveer 3-4 cellen per gezichtsveld (FOV) worden bemonsterd.

Hoewel er veel cellen in de FOV van PDGFRα-GCaMP6f en SMC-GCaMP3 PKJ secties zijn, sluiten kleine weefselbewegingen cellen vaak uit van analyse. Dit kan meestal worden opgelost door een stabilisatieprotocol toe te passen op beelden. Onder omstandigheden waarin preparaten niet bewegen, kunnen ten minste 3-5 cellen worden bemonsterd uit PDGFRα-GCaMP6f-secties en 5-6 cellen uit SMC-GCaMP3-secties. Meestal is de tijd die nodig is om dieren te offeren (optimale leeftijd voor muizen is 8-16 weken) tot het uitvoeren van Ca2+ beeldvormingsexperimenten 2-3 uur, wat voldoende is om weefselintegriteit te garanderen, als weefsels tijdens de procedure worden geïncubeerd in ijskoude oplossingen wanneer dat nodig is. Samengevat is hier een vibratoomsnijprotocol beschreven om intacte preparaten van RP PKJ-gebieden uit de muisnier te genereren. Deze techniek maakt het mogelijk om RP pacemaker regio's te behouden voor in situ Ca2+ imaging studies om RP pacemaker mechanismen te onderzoeken.

Openbaarmakingen

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

De auteurs hebben niets bekend te maken.

Dankbetuigingen

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Dit project werd gefinancierd door R01 DK124509 van NIDDK.

Materialen

```html

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel
NaamBedrijfCatalogusnummerOpmerkingen
24-wells kweekplaatjeThermoFisher Scientific142485Voor het opslaan van nierslices in
35 mm x 10 mm Petri-schaaltjesSigma AldrichCLS430165Petrischaaltje voor calciumbeeldvorming van nierslices
48-wells kweekplaatjeThermoFisher Scientific152640Voor het opslaan van nierslices in
60 mm x 15 mm Petri-schaaltjeSigma AldrichP5481Petrischaaltje voor scherpe dissectie van de nier
AbsorbtiepapierFisher Scientific06-666AOm de nier te drogen voor het aanbrengen van lijm
B6;129S-Gt(ROSA)26Sor/JThe Jackson Laboratory13148GCaMP3 Muizen
B6;129S-Gt(ROSA)26Sor/JThe Jackson Laboratory24105GCaMP6f Muizen
B6.FVB-Tg(Myh11-cre/ERT2)1Soff/JThe Jackson Laboratory19079smMHC-CRE Muizen
C57BL/6-Tg(Pdgfra-cre)1Clc/JThe Jackson Laboratory13148PDGFRa-CRE Muizen
CyanoacrylaatlijmAmazonB001PILFVYVoor het bevestigen van de nier aan de specimenplaat
EthanolPhamco-AaperSDA 2B-6Voor dissectie
Extra-fijne Bonn-schaarFine Science Tools14083-08Gebruikt voor interne dissecerende schaar
Fijne schaarFine Science Tools14060-09Gebruikt voor externe dissecerende schaar
Fijne pincettenFine Science Tools11254-20Gebruikt voor fijne dissectie van de nier
Gillette Silver Blue dubbelzijdige messenAmazonB009XHQGYOVoor inbrengen in de meshouders van de vibratome
ImageJNIHVoor calciumbeeldvormingsanalyse
IsofluranBaxterNDC 1001936060Voor anesthesie
Minutien-pinsFisher ScientificNC9677548De pins zijn gehalveerd om hun lengte te verminderen
Siliconen elastomeerFisher ScientificNC9285739Sylgard 184
Student Adson-pincettenFine Science Tools91106-12Voor het voorzichtig vasthouden en bewegen van de nier
Student Dumont-pincettenFine Science Tools91150-20Gebruikt voor interne dissecerende pincetten
Vannas-veerknippersFine Science Tools15000-03Voor scherpe dissectie en schoonmaken van geïsoleerde nier
VibrocheckLeica14048142075Optioneel onderdeel voor het kalibreren van mesbewegingen tijdens het snijden
VT1200 S Vibrerende Blad MicrotoomLeica14912000001Configuratie 1 wordt in ons protocol gebruikt
```

Referenties

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Constantinou, C. E., Djurhuus, J. C. Pyeloureteral dynamics in the intact and chronically obstructed multicalyceal kidney. The American Journal of Physiology. 241 (5), 398-411 (1981).
  2. Constantinou, C. E., Yamaguchi, O. Multiple-coupled pacemaker system in renal pelvis of the unicalyceal kidney. TheAmerican Journal of Physiology. 241 (5), 412-418 (1981).
  3. Constantinou, C. E., Hrynczuk, J. R. Urodynamics of the upper urinary tract. Investigative Urology. 14 (3), 233-240 (1976).
  4. Schmidt-Nielsen, B., Schmidt-Nielsen, B. On the function of the mammalian renal papilla and the peristalsis of the surrounding pelvis. Acta Physiologica. 202 (3), Oxford, England. 379-385 (2011).
  5. Dwyer, T. M., Schmidt-Nielsen, B. The renal pelvis: machinery that concentrates urine in the papilla. Physiology. 18 (1), 1-6 (2003).
  6. Hill, W. G. Control of urinary drainage and voiding. Clinical Journal of the American Society of Nephrology. 10 (3), 480-492 (2015).
  7. Brading, A. F. The physiology of the mammalian urinary outflow tract. Experimental Physiology. 84 (1), 215-221 (1999).
  8. Dixon, J. S., Gosling, J. A. The musculature of the human renal calices, pelvis and upper ureter. Journal of Anatomy. 135, Pt 1 129-137 (1982).
  9. Lang, R. J., et al. Pyeloureteric peristalsis: role of atypical smooth muscle cells and interstitial cells of Cajal-like cells as pacemakers. The Journal of Physiology. 576, 695-705 (2006).
  10. Lang, R. J., Takano, H., Davidson, M. E., Suzuki, H., Klemm, M. F. Characterization of the spontaneous electrical and contractile activity of smooth muscle cells in the rat upper urinary tract. Journal of Urology. 166 (1), 329-334 (2001).
  11. Lang, R. J., Exintaris, B., Teele, M. E., Harvey, J., Klemm, M. F. Electrical basis of peristalsis in the mammalian upper urinary tract. Clinical and Experimental Pharmacology & Physiology. 25 (5), 310-321 (1998).
  12. Morita, T., Ishizuka, G., Tsuchida, S. Initiation and propagation of stimulus from the renal pelvic pacemaker in pig kidney. Investigative Urology. 19 (3), 157-160 (1981).
  13. Tsuchida, S., Morita, T., Harada, T., Kimura, Y. Initiation and propagation of canine renal pelvic peristalsis. Urologia Internationalis. 36 (5), 307-314 (1981).
  14. Yamaguchi, O. A., Constantinou, C. E. Renal calyceal and pelvic contraction rhythms. American Journal of Physiology - Regulatory Integrative and Comparative Physiology. 257 (4), 788-795 (1989).
  15. Klemm, M. F., Exintaris, B., Lang, R. J. Identification of the cells underlying pacemaker activity in the guinea-pig upper urinary tract. Journal of Physiology. 519 (3), 867-884 (1999).
  16. Lang, R. J., et al. Spontaneous electrical and Ca2+ signals in the mouse renal pelvis that drive pyeloureteric peristalsis. Clinical and Experimental Pharmacology & Physiology. 37 (4), 509-515 (2010).
  17. Lutzeyer, W. Pacemaker process of ureteral peristalsis in multicalyceal kidneys. Urologia Internationalis. 37 (4), 240-246 (1982).
  18. Lang, R. J., Hashitani, H. Pacemaker mechanisms driving pyeloureteric peristalsis: modulatory role of interstitial cells. Advances in Experimental Medicine and Biology. 1124, 77-101 (2019).
  19. Hashitani, H., et al. Interstitial cell modulation of pyeloureteric peristalsis in the mouse renal pelvis examined using FIBSEM tomography and calcium indicators. Pflugers Archiv: European Journal of Physiology. 469 (5-6), 797-813 (2017).
  20. Lang, R. J., Hashitani, H., Tonta, M. A., Suzuki, H., Parkington, H. C. Role of Ca2+ entry and Ca2+ stores in atypical smooth muscle cell autorhythmicity in the mouse renal pelvis. British Journal of Pharmacology. 152 (8), 1248-1259 (2007).
  21. Lang, R. J., Hashitani, H., Tonta, M. A., Parkington, H. C., Suzuki, H. Spontaneous electrical and Ca2+ signals in typical and atypical smooth muscle cells and interstitial cell of Cajal-like cells of mouse renal pelvis. The Journal of Physiology. 583, 1049-1068 (2007).
  22. Hashitani, H., Lang, R. J., Mitsui, R., Mabuchi, Y., Suzuki, H. Distinct effects of CGRP on typical and atypical smooth muscle cells involved in generating spontaneous contractions in the mouse renal pelvis. British Journal of Pharmacology. 158 (8), 2030-2045 (2009).
  23. Iqbal, J., et al. Potassium and ANO1/ TMEM16A chloride channel profiles distinguish atypical and typical smooth muscle cells from interstitial cells in the mouse renal pelvis. British Journal of Pharmacology. 165 (7), 2389-2408 (2012).
  24. Grainger, N., et al. Identification and classification of interstitial cells in the mouse renal pelvis. Journal of Physiology. 598 (15), 3283-3307 (2020).
  25. Hashitani, H., Mitsui, R., Lang, R. Functional heterogeneity of PDGFRα (+) cells in spontaneously active urogenital tissues. Neurourology and Urodynamics. 39 (6), 1667-1678 (2020).
  26. Hashitani, H., Lang, R. J. ATYPICAL or INTERSTITIAL, take your PIC. Journal of Physiology. 598 (15), 3061-3062 (2020).
  27. Lang, R. J., Hashitani, H., Tonta, M. A., Suzuki, H., Parkington, H. C. Role of Ca2+ entry and Ca2+ stores in atypical smooth muscle cell autorhythmicity in the mouse renal pelvis. British Journal of Pharmacology. 152 (8), 1248-1259 (2007).
  28. Grundy, D. Principles and standards for reporting animal experiments in The Journal of Physiology and Experimental Physiology. Experimental Physiology. 100 (7), 755-758 (2015).
  29. Drumm, B. T., Hennig, G. W., Baker, S. A., Sanders, K. M. Applications of spatio-temporal mapping and particle analysis techniques to quantify intracellular Ca 2+ signaling in situ. Journal of Visualized Experiments. 2019 (143), 1-13 (2019).
  30. Leigh, W. A., et al. A high throughput machine-learning driven analysis of Ca2+ spatio-temporal maps. Cell Calcium. 91, 102260(2020).

Herprints en machtigingen

Toestemming aanvragen om de tekst of afbeeldingen van dit JoVE-artikel te hergebruiken

Toestemming aanvragen

Trefwoorden

Beeldvorming van niercoupesovergang pelvis niercalciumbeeldvormingconfocale microscopiePDGFR alfacellengladde spiercellenurinetransport

Gerelateerde artikelen