Methodenartikel

Registratie van elektrische stromen over het plasmamembraan van zaadcellen van zoogdieren

4.2K weergaven

⸱

DOI:

10.3791/62049

⸱

14 februari 2021

 ,  ,  ,  ,  , 
1Department of Molecular and Cell Biology, University of California, Berkeley, 2Department of Neurobiology, Peking University, 3Institute for Biology II / Chemosensation Lab, RWTH Aachen University, 4Research Training Group 2416 MultiSenses-MultiScales, RWTH Aachen University, 5Howard Hughes Medical Institute, Janelia Research Campus, 6Department of Physiology, University of California, San Francisco

In dit artikel

Samenvatting

Dit protocol beschrijft hoe elektrische opnames van zaadcellen van zoogdieren in een configuratie van de hele cel kunnen worden uitgevoerd, met als doel de activiteit van het ionkanaal direct vast te leggen. De methode heeft een belangrijke rol gespeeld bij het beschrijven van de elektrofysiologische profielen van verschillende sperma-ionkanalen en heeft geholpen om hun moleculaire identiteit en regulatie te onthullen.

Samenvatting

Het registreren van de elektrische activiteit van een van de kleinste cellen van een zoogdierorganisme - een zaadcel - is al tientallen jaren een uitdagende taak voor elektrofysiologen. De methode die bekend staat als "spermatozoaire patchklem" werd in 2006 geïntroduceerd. Het heeft de directe registratie van ionkanaalactiviteit in configuraties van hele cellen en cellen mogelijk gemaakt en heeft een belangrijke rol gespeeld bij het beschrijven van de fysiologie van zaadcellen en de moleculaire identiteit van verschillende calcium-, kalium-, natrium-, chloride- en protonionkanalen. Het registreren van enkelvoudige spermatozoa vereist echter geavanceerde vaardigheden en training in elektrofysiologie. Dit gedetailleerde protocol vat de stapsgewijze procedure samen en belicht verschillende 'kneepjes van het vak' om het beschikbaar te maken voor iedereen die de fascinerende fysiologie van de zaadcel wil verkennen. In het bijzonder beschrijft het protocol de registratie van menselijke en muizenzaadcellen, maar kan worden aangepast aan in wezen elke zoogdierzaadcel van elke soort. Het protocol behandelt belangrijke details van de toepassing van deze techniek, zoals isolatie van zaadcellen, selectie van reagentia en apparatuur, immobilisatie van de zeer beweeglijke cellen, vorming van de strakke (Gigaohm) afdichting tussen een registratie-elektrode en het plasmamembraan van de zaadcellen, overgang naar de hele spermatozoaire modus (ook bekend als break-in), en voorbeeldige opnames van het calciumionkanaal van de zaadcellen, CatSper, van zes zoogdiersoorten. De voordelen en beperkingen van de spermapleisterklemmethode, evenals de meest kritische stappen, worden besproken.

Inleiding

Vergelijkbaar met de traditionele patchklem uitgevonden door Erwin Neher en Bert Sakmann1, maakt de spermacelpatchklem het mogelijk om de activiteit van individuele ionkanaalactiviteiten te ondervragen en de activiteit van de gehele ionkanaalpopulatie binnen de enkele cel 2,3 vast te leggen. De methode maakt het mogelijk om een specifiek ionkanaaltype te identificeren onder graden van ontkoppeling van enzymatische intracellulaire processen. Deze methode is cruciaal voor de bepaling van de ionkanaalactiviteit op basis van de elektrofysiologische en farmacologische vingerafdrukken en biedt daarom een betrouwbare identificatiestrategie. Het nadeel van de methode is het onvermogen om niet-elektrogene transporters te detecteren. Bovendien is elementaire elektrofysiologische training nuttig om de nuances van het protocol te begrijpen. Om de patchklemtechniek onder de knie te krijgen en toe te passen op spermatozoa van zoogdieren, raden we aan om de basisliteratuur over patchklemmen 4,5 te bestuderen. In dit artikel geven we een gedetailleerde stap-voor-stap procedure en belichten we unieke praktijken die deze techniek gemakkelijk te begrijpen en beschikbaar maken voor iedereen die elektrofysiologie van zaadcellen wil beoefenen.

Ionenhomeostase is een essentiële fysiologische functie van zaadcellen die sterk afhankelijk is van ionenkanalen en ionentransporters om fysiologisch belangrijke ionengradiënten te behouden, intracellulair calcium te variëren en de transmembraanspanning te veranderen. Ionenkanalen en ionentransporters reguleren essentiële spermacelfuncties zoals beweeglijkheid, navigatie in het vrouwelijke voortplantingsstelsel, rijping van spermatozoën en in mariene organismen, chemotaxis naar het ei 6,7,8,9,10,11,12 . De beweeglijkheid van het sperma is een geleidelijk verworven proces. Zaadcellen zijn voornamelijk in rust tijdens hun rijping in de testis en tijdens hun daaropvolgende passage door de bijbal. Hun beweeglijkheid wordt beperkt door een zure bijbal Dit schaadt de functie van het axonem omdat het niet kan functioneren onder pH 6,0 13,14. Bij blootstelling aan de zaadvloeistoffen of een meer alkalische omgeving ondergaan de intracellulaire ionenconcentraties van het sperma en de cytoplasmatische pH echter grote veranderingen en wordt de spermatozoön beweeglijk 15,16,17. De beweging van het flagellum van het sperma wordt aangedreven door ATP-hydrolyse die het glijden van axonemale microtubuli ondersteunt18 en dit proces is sterk pH-afhankelijk14. Bovendien wordt de beweging van flagellaire voertuigen ook gecontroleerd door een verhoging van intraflagellair calcium en cAMP 13,19,20,21,22,23,24. Deze factoren, d.w.z. de intracellulaire calciumconcentratie van het sperma [Ca2+]i, pH, ATP en cAMP, zijn de belangrijkste regulerende mechanismen die veranderingen in de motiliteit mogelijk maken en hun concentraties worden strak gereguleerd door de sperma-ionkanalen en transporters.

Zaadcellen zijn uniek omdat ze een aantal eiwitten tot expressie brengen die nergens anders in het lichaam te vinden zijn. Bekende voorbeelden zijn sperma-ionkanalen, zoals het kaliumkanaal, Slo3 25,26,27,28,29 en het Cat-ionkanaalvan Sperm, CatSper 2,30,31,32. Dit laatste is het belangrijkste calciumkanaal van spermatozoa van zoogdieren31 en wordt gereguleerd door intracellulaire alkalisatie 2,30,31,32,33,34. CatSper wordt ook gereguleerd door soortspecifieke signalen 7,35 en is georganiseerd in vierhoekige longitudinale nanodomeinen langs het spermaflagellum 36,37,38. Bij primaten wordt CatSper geactiveerd door een combinatie van flagellaire alkaliteit, membraandepolarisatie en progesteron 3,39,40,41, terwijl voor muizen CatSper-activering progesteron niet vereist is 2,39. Een ander specifiek kenmerk van dit kanaal is de organisatie van meerdere subeenheden: CatSper is een complex van ten minste 10 verschillende subeenheden 31,32,34,37,38,42,43,44,45,46,47 . Een dergelijke geavanceerde structuur en specifieke kenmerken van de regulatie belemmerden de recombinante expressie van CatSper in elk bekend heteroloog expressiesysteem, en daarom is de fysiologische karakterisering van CatSper beperkt tot het oorspronkelijke expressiesysteem - de zaadcel. Terwijl moleculaire karakterisering van het CatSper-eiwit in 2000 werd bereikt in baanbrekend artikel door D. Ren et. al.31, het ultieme bewijs dat CatSper een bonafide ionenkanaal is, was pas mogelijk na de introductie van de spermapleisterklemmethode in 20062. Sindsdien maakte deze techniek een nauwkeurige karakterisering mogelijk van veel ionengeleidende routes in zaadcellen 9,28,37,39,40,44,46,48-54.

De klassieke en meest eenvoudige methode om de kenmerken van ionenkanalen te bestuderen - de patchklemtechniek - werd verondersteld niet toepasbaar te zijn op zaadcellen vanwege hun beweeglijkheid en specifieke morfologie (Figuur 1A). Met name het minuscule volume van het spermacytoplasma en de strakke hechting van het spermaplasmamembraan aan de stijve intracellulaire structuren zoals de fibreuze schede en de kern van het sperma waren de belangrijkste uitdagingen55. Deze twee structurele kenmerken resulteren in een slanke, pijlvormige cel die is ontworpen om door zeer viskeuze omgevingen zoals de beschermende gewaden van eieren te dringen, zonder significante vervorming of schade aan het plasmamembraan.

De eerste stap van de patchklemmethode is het tot stand brengen van de goede afdichting tussen een opnamepipet (een glazen micropipet) en het plasmamembraan van de cel. Om dit te bereiken, moet men voldoende plasmamembraan in de opnamepipet trekken om een mechanisch stabiele gigaseal te vormen tussen het plasmamembraan en het glas. Het plasmamembraan moet flexibel en niet stijf zijn (Figuur 1B). Zoals hierboven vermeld, is het hele oppervlak van het plasmamembraan van het sperma vrij stevig aangehecht, met uitzondering van het gebied dat bekend staat als de cytoplasmatische druppel (Figuur 1A en Figuur 2). Daarom werd de stijve aard van het plasmamembraan van het sperma beschouwd als een belangrijk obstakel bij het verkrijgen van de strakke afdichting of 'gigaseal', zo genoemd omdat >109 ohm nodig zijn voor goede opnames. De introductie van de spermapleisterklemtechniek in 20062 verwijderde deze barrière echter en deze methode kon met succes worden toegepast op zaadcellen van verschillende zoogdiersoorten 2,41,51,56. Deze doorbraak is bereikt door zich te concentreren op de cytoplasmatische druppel (CD)2,8, een kleine structuur die zich langs het middenstuk van het sperma bevindt (Figuur 1A en Figuur 2), en is gewoon het overblijfsel van de langwerpige spermatide - een voorloper van zaadcellen waaruit de kop en de staart zich ontwikkelen. Functioneel kan het de cel helpen zich aan te passen aan veranderingen in extracellulaire osmolariteit tijdens de ejaculatie. Het belangrijke kenmerk is dat het plasmamembraan in de CD flexibel genoeg is om in de pipet te worden getrokken om een gigaohm-afdichting te vormen. De sperma-CD is dus het beste deel op het spermaoppervlak waardoor men een succesvolle gigasealvorming kan bereiken en kan overgaan naar een hele-celmodus die de zaadcel uiteindelijk elektrisch koppelt aan een patch-clamp-versterker 2,8. Het is vermeldenswaard dat eerdere publicaties melding maakten van succesvolle gigasealvorming aan de spermakop, waardoor registratie in de cel-bevestigde configuratie 54,57,58,59 mogelijk is. De opnames in de hele celconfiguratie zijn tot nu toe echter alleen gerapporteerd door gigasealvorming uit te voeren in het CD-gebied. Deze modus voor de hele cel biedt elektrische toegang tot het volledige volume van de zaadcellen en maakt daarom detectie mogelijk van ionkanaalactiviteiten op het spermflagellum en op de spermakop. Sinds slechts een paar jaar sinds de ontwikkeling ervan, heeft de spermapleisterklemtechniek geresulteerd in een enorme vooruitgang in ons begrip van de sperma-ionkanalen en is het tot nu toe een van de meest robuuste technieken om de functionaliteit van de sperma-ionkanalen direct te onderzoeken 9,28,37,39,40,44,46,48,49, 50,51,52,53 (Figuur 1).

De spermapleisterklem wijkt in sommige details af van de klassieke patchklemtechniek, zoals hieronder beschreven. Ten eerste is het grootste deel van het plasmamembraan van het sperma stevig bevestigd aan de stijve intracellulaire structuur en daarom hebben spermatozoa bijna geen "reserve" plasmamembraan om in de pipet te worden getrokken. Het enige gebied dat flexibel is, is het membraan van de CD dat lijkt op het plasmamembraan van veel somatische cellen en daarom gemakkelijk in de pipet kan worden getrokken. Om een gigaohm-afdichting met de CD te vormen, wordt negatieve druk gecreëerd door lichte zuigkracht aan de bovenkant van de pipet om een klein deel van het plasmamembraan van het sperma in de punt van de micropipet te trekken (Figuur 1B). Dit deel van het membraan vormt een Ω-vormige invaginatie in de punt van de pipet en zorgt voor een goede afdichting met de interne wanden.

Ten tweede ligt de cytoplasmatische druppel in spermatozoa bij mensen en muizen tussen 1 en 2 μm (Figuur 1 en Figuur 2). Daarom vereist de toepassing van de patch-clamp-techniek op zo'n klein object optica met een hoge resolutie. De meeste sperma patch-clamp rigs zijn uitgerust met een omgekeerde microscoop met een differentieel interferentiecontrast (DIC) of Nomarski optische componenten (Figuur 2 en Figuur 3). Het gebruik van een microscoop die is uitgerust met DIC-optiek voor de klem van de spermapleister wordt ten zeerste aanbevolen ten opzichte van meer conventionele fasecontrastoptica, omdat de ruimtelijke informatie die in DIC wordt gezien, helpt bij het bereiken van superieure precisie bij het positioneren van een patchpipet op de kleine cd. We raden ook aan om een 60x wateronderdompelingsobjectief of een vergelijkbare lens te gebruiken, met een numeriek diafragma van 1,2. Dit objectief heeft een lange werkafstand (0,28 mm), waardoor vrijzwemmende zaadcellen in oplossing kunnen worden waargenomen (Figuur 2). Het objectief heeft ook een verstelkraag om zich aan te passen aan de dikte van de dekslip (variabel van 0,13 tot 0,21 mm). Deze combinatie van de lange werkafstand en de verstelkraag maakt observatie mogelijk door middel van twee afdekstrips van 0,13 mm; Eén dekstrookje dient als glazen bodem van de opnamekamer en daarop wordt het 5 mm grote dekglaasje met afgezette zaadcellen geplaatst. Zoals hieronder besproken, is het deponeren van zaadcellen op gemakkelijk verwisselbare ronde dekglaasjes van 5 mm, in plaats van rechtstreeks op de bodem van de opnamekamer, een handige manier om verse zaadcellen in de opnamekamer te laden.

Ten derde moet de spermapleisterkleminstallatie zijn uitgerust met een ruisarme patchklemversterker en een digitizer om kleine (picoampèrebereik) elektrische stromen en minuscule veranderingen in membraanpotentiaal te registreren. Deze apparatuur moet zorgen voor de laagste versterkerruis. De afwezigheid van trillingen is een essentieel onderdeel van een succesvolle patchklemopname. Het klemmen van spermapleisters vereist een driftvrije, nauwkeurige micromanipulator die met een micromanipulatorplatform aan de omgekeerde microscoop kan worden bevestigd om een betere stabiliteit te garanderen dan een onafhankelijke micromanipulatorstandaard (Figuur 3A). Om de opstelling te testen, mag men geen enkele beweging van de pipetpunt zien (onder een vergroting van 60x), zelfs niet wanneer een persoon op en neer springt op de vloer in de buurt van de trillingsisolatietafel.

Protocol

Alle experimenten werden uitgevoerd in overeenstemming met de NIH-richtlijnen voor dieronderzoek en goedgekeurd door het UC Berkeley Animal Care and Use Committee (AUP 2015-07-7742), waarbij alles in het werk werd gesteld om dierenleed tot een minimum te beperken. Alle beschreven methoden zijn in overeenstemming met de aanbevelingen van het Panel on Euthanasia van de American Veterinary Medical Association en de IACUC-commissie. Alle experimentele procedures waarbij gebruik wordt gemaakt van monsters van menselijke oorsprong, zijn goedgekeurd door het Committee on Human Research van de University of California, Berkeley, IRB-protocolnummer 2013-06-5395.

1. Het maken van glazen micropipetten voor het opnemen van sperma-patch-clamp van de hele cel.

OPMERKING: De kleine omvang van de cytoplasmatische druppel vereist glazen micropipetten met fijne punten.

  1. Begin voor de fabricage van micropipetten met capillairen van borosilicaatglas met een buitendiameter van 1,5 mm, een binnendiameter van 0,86 mm en een inwendig filament. Trek aan de punt van een micropipettrekker (Figuur 3B).
  2. Voor het vormen en polijsten van de pipetpunt plaatst u een hete draad even in de buurt van de punt. Voer dit proces van brandpolijsten uit onder een vergroting van 100x met behulp van een pipetpolijstmachine (Figuur 3C,D).
  3. Zorg ervoor dat de binnendiameter van de pipetpunt ~2 μm is vóór het brandpolijsten en wordt teruggebracht tot ~0.5 μm na goed polijsten.
    OPMERKING: Alleen vers getrokken pipetten die op de dag van opname zijn gemaakt, worden aanbevolen voor gebruik. Dit voorkomt de ophoping van stofdeeltjes op de pipetpunt.

2. Het opzetten van de rig

  1. Montage van de opnamekamer
    1. Gebruik een ruitvormige perfusiekamer met een laag volume met laminaire stroming en relatief snelle oplossingsuitwisselingssnelheden (Figuur 4). Sluit de kamer via een spruitstuk aan op een door zwaartekracht gevoed perfusiesysteem (afbeelding 5).
    2. Om een oplossing door de registratiekamer te perfuseren, stelt u een eenvoudig, zelfgemaakt perfusiesysteem met zwaartekracht samen met een polytetrafluorethyleenverdeelstuk dat de perfusiekamer verbindt met acht afzonderlijke perfusieleidingen.
      OPMERKING: De slang mag geen weekmakers in de oplossingen uitlogen, aangezien dergelijke chemicaliën de normale functie van zaadcellen aanzienlijk kunnen beïnvloeden60 en de activiteit van het ionenkanaal kunnen veranderen61,62 . Een polytetrafluorethyleenslang met een kleine diameter wordt ten zeerste aanbevolen als de belangrijkste perfusieslang.
    3. Omdat polytetrafluorethyleenslangen vrij stijf zijn, moet u flexibele verbindingen met zeer zuivere siliconenslangen over de polytetrafluorethyleenslangen laten passen. Gebruik daarnaast spuiten (bijv. Luer Lock-spuittype) zonder smeermiddel, aangezien minerale olie of andere smeermiddeladditieven de opname van ionenkanalen kunnen verstoren (Afbeelding 5).
  2. Montage van een agarbrug
    1. Om veranderingen in de vloeistofjunctiepotentiaal tijdens opnames te voorkomen, moet u de omgeving rond de referentie-elektrode stabiel houden met behulp van een agarbrug (Figuur 4).
    2. Om een agarbrug te maken, maak je een L-vormig glazen capillair door het onder een klein bunsenbrandervuur te buigen en af te laten koelen.
    3. Maak een oplossing van 1% agarose in 1 M KCl en verwarm het in een magnetron tot de agarose smelt en de oplossing transparant wordt. Vul het L-vormige glazen capillair voorzichtig met de bovenstaande oplossing om luchtbellen te voorkomen en laat het afkoelen tot kamertemperatuur. De agarbruggen kunnen ~2 maanden worden bewaard in 1 M KCl bij +4 °C.
    4. Om een agarbrug te gebruiken, vult u een Ag/AgCl-pelletreferentie-elektrode met 1 M KCl en brengt u de agarbrug voorzichtig in om te voorkomen dat gestolde agarose uit het glazen capillair springt.
    5. Steek vervolgens de gouden pin (2 mm) van de draad van de amplifier headstage in de sleuf van de referentie-elektrode 2 mm (goud) en steek het uiteinde van de L-vormige agarbrug in de perfusiekamer zoals weergegeven in afbeelding 4.
  3. Oplossingen en recepten
    OPMERKING: Alle reagentia en chemicaliën moeten van de hoogste zuiverheid zijn. Alle bereide oplossingen worden gefilterd door een steriel PES-filter van 0,22 μm en maximaal een maand bij 4 °C bewaard. Opgemerkt moet worden dat de exacte afstelling van de osmolariteit een voorwaarde is voor een succesvolle patchklemming.
    1. Bereid een oplossing voor menselijke buisvormige vloeistof (HTF) zoals beschreven in tabel 1. Pas de pH aan op 7,4 met NaOH. De osmolariteit moet 280 ± 5 mOsm zijn, gemeten met behulp van een dampdrukosmometer.
    2. Bereid een "bad" of "extracellulaire" oplossing met een hoge zoutoplossing (HS) zoals aangegeven in tabel 2. Pas de pH aan op 7,4 met NaOH. De osmolariteit moet 320 ± 5 mOsm zijn.
    3. Bereid het cesiummethaansulfonaat "bad" of de "extracellulaire" oplossing zoals beschreven in tabel 3. Stel de pH in op 7,4 met CsOH en de osmolariteit op 320 ± 5 mOsm.
    4. Om de cesiummethaansulfonaat (CsMeSO3) intracellulaire "pipet"-oplossing te bereiden, volgt u tabel 4 en stelt u de pH in op 7.4 met CsOH. De osmolariteit moet tot 10 mOsm hoger zijn dan die van de HS-oplossing.

3. Isolatie en zuivering van spermatozoa van zoogdieren

OPMERKING: Euthanaseer C57BL/6 mannelijke muizen van 3-6 maanden door inademing van CO2 gevolgd door cervicale dislocatie. Voer na cervicale dislocatie onmiddellijk weefselverzameling (cauda of corpus epididymis) van muizen uit.

  1. Isolatie van epididymale spermatozoa van muizen
    OPMERKING: Euthanaseer C57BL/6 mannelijke muizen van 3-6 maanden door inademing van CO2 gevolgd door cervicale dislocatie. Voer na cervicale dislocatie onmiddellijk weefselverzameling (cauda of corpus epididymis) van muizen uit.
    1. Open de onderbuik van de muis met een schaar en verwijder beide bijballen.
    2. Plaats ze in een celkweekschaaltje van 35 mm gevuld met HS-oplossing (hoge zoutoplossing, zie tabel 2). Zorg ervoor dat een aliquoot van de HS-oplossing wordt voorverwarmd tot kamertemperatuur voordat deze in contact komt met de zaadcellen.
    3. Breng de bijballen over in een nieuw celkweekschaaltje met HS-oplossing en verwijder al het resterende vet grondig.
    4. Scheid de bijballen in caput, corpus en cauda met behulp van een #15 scalpelmes (Figuur 6).
    5. Breng het corpus (of cauda indien nodig) van elke bijbal over in een nieuw celkweekschaaltje met HS-oplossing. Maak meerdere incisies in het geïsoleerde deel van de bijbal met behulp van een puntig #11 scalpelmes.
    6. Breng de delen van de bijbal met meerdere incisies over in een microcentrifugebuis van 1,5 ml die 1,5 ml HS-oplossing bevat.
    7. Schud de zaadcellen van de bijbal kort in de oplossing met behulp van een superfijne Dumont type 5a pincet. Gooi de bijballen weg en laat de tube 10 minuten op kamertemperatuur staan.
    8. Wacht tot de vaste stof (niet-zaadcellen) naar de bodem van de buis is gezonken en breng het bovenstaande dan over in een andere microcentrifugebuis van 1,5 ml.
    9. Bewaar het spermamengsel maximaal 2 uur bij kamertemperatuur met toegang tot lucht, gedurende welke tijd de experimenten kunnen worden uitgevoerd. Geïsoleerd sperma verliest zijn prestaties 3 uur na isolatie.
  2. Capaciteit van spermatozoa van muizen
    OPMERKING: Alle epididymale spermatozoa zijn geschikt voor patch-clamp, maar alleen spermatozoa van de cauda epididymis zijn volwassen genoeg om bevruchtingsbekwaam te worden. Aangezien caudale spermatozoa capacitatie kunnen ondergaan, moet u experimenten uitvoeren, met name spermacapaciteit, met behulp van caudale zaadcellen.
    1. Voer spermaverzameling uit op caudale of geëjaculeerde spermatozoa (zie stappen 3.1.1-4).
    2. Neem caudae geïsoleerd zoals beschreven in stap 3.1.4. en breng meerdere incisies aan zoals beschreven in stap 3.1.5. Breng de caudae over naar een celkweekschaaltje van 10 mm met 2 ml capacitatieoplossing.
    3. Incubeer het staartweefsel in deze capacitatieoplossing eerst gedurende 10 minuten bij 37 °C en 5% CO2, gooi het weefsel vervolgens weg en incubeer de vrijgekomen zaadcellen nog eens 50-80 minuten.
      OPMERKING: In vitro capacitatie van caudale spermatozoa van muizen wordt bereikt door incubatie van 60-90 minuten. Gecapaciteerde zaadcellen worden visueel geïdentificeerd op basis van overmatige asymmetrische buiging van hun flagellen, bekend als hyperactivering. Dit type beweeglijkheid zorgt ervoor dat spermatozoa op een niet-lineaire manier kunnen zwemmen.
  3. Verzameling en zuivering van menselijk sperma
    OPMERKING: In dit geval werden verse spermamonsters verkregen van in totaal 21 gezonde vrijwilligers in de leeftijd van 21-38 jaar en spermatozoa gezuiverd met de swim-up-techniek op kamertemperatuur, zoals in detail beschreven in48,63. In het kort is de procedure als volgt:
    1. Laat de menselijke ejaculaatmonsters 60 minuten bij kamertemperatuur staan om vloeibaarmaking mogelijk te maken voordat ze worden gezuiverd (langere duur kan de kwaliteit van het sperma negatief beïnvloeden).
    2. Verwarm ongeveer 7 ml HTF-oplossing voor op 37 °C in een centrifugebuis van 50 ml. Beoordeel visueel het volume van het ejaculaat - als het volume groter is dan 1 ml, bereid dan meerdere buisjes HTF-oplossing voor.
    3. Leg voorzichtig 1 ml vloeibaar ejaculaat op de bodem van elke buis zonder spermastrengen naar het oppervlak van de buffer te tillen. De sperma-naar-HTF-interface moet zo duidelijk mogelijk zijn. Vermijd luchtbellen.
    4. Plaats de buizen gedurende 1 uur in een incubator van 37 °C op een standaard die ze in een hoek van 45° houdt voor een maximale oppervlakte. Als de incubator een CO2 -incubator is, sluit dan de dop goed af om verzuring van de buffer te voorkomen (CO2 is niet vereist voor deze procedure). Tijdens de incubatie zal beweeglijk sperma geleidelijk naar het oppervlak van de HTF-buffer zwemmen.
    5. Verzamel na 1 uur de bovenste fractie van 1 ml van alle monsters in een centrifugebuis van 15 ml, en combineer zo het sperma van de hoogste kwaliteit, zeer beweeglijk, voor het opspannen van pleisters. Probeer niet al het bovenstaande te verwijderen, laat enkele ml HTF over die boven het zaadplasma achterblijft om besmetting te voorkomen. De gezuiverde celsuspensie kan enkele uren bij kamertemperatuur worden bewaard.
      OPMERKING: Een normaal ejaculaat moet ten minste 15 x 106 zaadcellen per ml64 bevatten, maar het aantal zaadcellen varieert sterk tussen de monsters. Het obstakel van een laag celgetal kan worden overwonnen door de gezuiverde spermensuspensie 30-60 minuten bij kamertemperatuur te laten staan voordat de pleister wordt vastgeklemd. Onder deze omstandigheden zullen de cellen zich geleidelijk ophopen op de bodem van de centrifugebuis en een zichtbare celwolk vormen van waaruit u cellen in de opnamekamer kunt pipetteren (zie hieronder).
  4. Capaciteit van menselijke spermatozoa
    OPMERKING: In-vitrocapacitatie van menselijke spermatozoa kan worden bereikt door incubatie van 4 uur in capacitatieoplossing: 20% foetaal runderserum, 25 mM NaHCO3 in HTF- of HS-buffers48,51 . Gecapaciteerde zaadcellen kunnen visueel worden geïdentificeerd op basis van hun krachtige beweeglijkheid en overmatige asymmetrische buiging van de flagellen waardoor spermatozoa op een niet-lineaire manier kunnen zwemmen.
    1. Bereid een 2x capacitatieoplossing voor en meng 1:1 met de spermasuspensie.
    2. Voer de incubatie uit bij 37 °C en 5% CO2 gedurende minimaal 4 uur. Om een hoog percentage gecapaciteerde cellen te garanderen, mag de incubatietijd niet korter zijn dan 4 uur.

4. Voorbereiden van coatingoplossing (alleen nodig voor patch-clamp voor menselijk sperma)

OPMERKING: Een essentiële stap is om de bijgevoegde spermatozoön van het dekglaasje te tillen voordat u inbreekt. Deze stap is alleen nodig voor menselijke zaadcellen en vereist een coating van het glazen dekglaasje om een minder hechtend glasoppervlak te creëren. De dekglaasjeslaag verkleint de kans dat de zaadcellen aan het dekglaasje blijven plakken en zorgt ervoor dat menselijke spermatozoa na een succesvolle gigasealvorming uit het glazen dekglaasje kunnen worden getild.

  1. Verdun 200 μl van het ejaculaat in 5 ml HS-oplossing in een centrifugebuis van 15 ml.
  2. Draai gedurende 5 minuten op 300 x g en verwijder supernatant.
  3. Resuspendeer de pellet in 1 ml HS-oplossing en breng over naar een microcentrifugebuis.
  4. Sonificeer gedurende 10 minuten bij 25 °C met behulp van een met water gevuld sonicatiebad.
  5. Draai 5 minuten naar beneden op 10.000 x g .
  6. Breng het bovenstaande over in een nieuwe microcentrifugebuis en gebruik het voor het coaten (instructies hieronder).

5. Registratie van ionengeleiding van het hele plasmamembraan van het sperma.

  1. Sperma aan het dekglaasje bevestigen.
    OPMERKING: Vóór de opname van de patch-clamp worden spermatozoa geplateerd op ronde dekstroken van 5 mm.
    1. Als u met menselijke cellen werkt, dompelt u de dekglaasjes kort met een scherpe tang in de voorbereide coatingoplossing.
    2. Plaats vier afdekglaasjes in een enkel putje van een plaat met 4 putjes en bedek ze met 300 μl HS-oplossing. Voorkom dat de afdekslips gaan drijven door ze op de bodem van de plaat met 4 putjes te plakken en ze met de plastic punt van een pipettor te duwen.
    3. Resuspendeer de geconcentreerde suspensies van spermatozoa van mensen (stap 3.3.5) of muizen (stap 3.1.9) voorzichtig opnieuw uit de bewaarbuis (20-50 μl geconcentreerd sperma) in 300 μl HS-oplossing boven het dekglaasje.
    4. Zorg ervoor dat spermatozoa zich ophopen op de bodem van het putje waar hun kop aan het dekglaasje zal hechten en hun flagella krachtig zal kloppen in de oplossing net boven het dekglaasje. Het is belangrijk om spermatozoa ongeveer 10 minuten bij kamertemperatuur op het dekglaasje te laten bezinken voordat u het opneemt.
      OPMERKING: Als menselijke spermatozoa slecht hechten, ga dan terug naar stap 5.1.1 en verdun de bereide coatingoplossing met HS-oplossing (1:20 tot maximaal 1:2). Deze stap moet worden aangepast aan spermamonsters van verschillende menselijke donoren op basis van de variabele beweeglijkheid van het sperma die gebruikelijk is bij menselijke spermapreparaten.
  2. Het dekglaasje plaatsen
    1. Haal een dekglaasje met licht aangehechte cellen uit het putje en plaats dit in een ruitvormig putje van de registratiekamer met HS-oplossing (figuur 4).
    2. Zet het perfusiesysteem (Figuur 5) gevuld met HS-oplossing aan om de kamer te spoelen en vuil en overtollige losgeraakte spermatozoa uit de kamer te verwijderen. Dit vergroot de kans dat de opnamepipet schoon blijft wanneer deze de cellen bereikt. Deze stap is handig bij het werken met niet-gecapaciteerde cellen die de neiging hebben om sterker aan het dekglaasje te blijven plakken.
      OPMERKING: Als er wordt opgenomen met gecapaciteerd sperma, moet men voorkomen dat de perfusie wordt ingeschakeld onmiddellijk nadat een nieuw dekglaasje in de kamer is geplaatst. Gecapaciteerde spermatozoa hebben een krachtige beweeglijkheid en hechten zich slechts losjes aan het dekglaasje. Daarom, om ervoor te zorgen dat het grootste aantal gecapaciteerde spermacellen beschikbaar is, is het belangrijk om ~ 10 minuten te wachten en gecapaciteerde spermatozoa aan het dekglaasje te laten hechten voordat u perfusie inschakelt. Zodra de juiste gecapaciteerde cel is gekozen en een gigaseal is gevormd, kan de perfusie weer worden ingeschakeld.
  3. Selectie van een zaadcel voor patch-clamp opname.
    1. Zoek een geschikte zaadcel met een cytoplasmatische druppel met een vergroting van 600x (zie hieronder). Dit wordt gedaan met behulp van een 60x wateronderdompelingslens zoals beschreven in de methoden met een oculair met een vergroting van 10x. In zaadcellen geïsoleerd uit corpus epididymis, bevindt de CD zich meestal dicht bij het midden van het middenstuk. In caudale cellen kan de CD meestal dicht bij de annulus worden gevonden (Figuur 2C). Voor menselijk sperma bevindt de CD zich in het nekgebied (Figuur 2A,B).
      OPMERKING: Bovendien kan de uittrekbare vergrotingsoptie van 1,6x van de microscoop worden gebruikt om de morfologie van het sperma nauwkeurig te onderzoeken (vergroting 960x).
    2. Zorg ervoor dat de cytoplasmatische druppel ovaal is en een iets langwerpige (Figuur 2G), spoelachtige vorm heeft. Cd's die er erg rond en vergroot uitzien, zijn vaak kwetsbaar en ongeschikt om te patchen (Figuur 2D,F).
    3. Kies een spermatozoön die beweeglijk is met de kop aan het dekglaasje, zodat de zaadcel gedeeltelijk gefixeerd is, maar de CD en de rest van het flagellum blijven bewegen met flagellaire slagen. Zorg ervoor dat de kop van het sperma losjes aan het dekglaasje is bevestigd, zodat het een beetje draait terwijl het flagellum van links naar rechts beweegt.
      OPMERKING: Losse bevestiging is belangrijk omdat na de vorming van de gigaohm-afdichting en vóór de overgang naar de hele-celmodus de spermatozoön van het dekglaasje in de oplossing moet worden getild.
  4. Vorming van een gigaseal
    OPMERKING: Om monovalente CatSper-stromen in de hele-celmodus te registreren, worden pipetten gevuld met Cs-methaansulfonaat (ook wel pipet of intracellulair genoemd) oplossing (Tabel 4) - dit levert een pipetweerstand op van 11-17 MΩ (Figuur 7A), zoals automatisch berekend door de versterker bij het toepassen van een spanningsstap van 0 mV tot 10 mV. Pipetten kunnen ook worden gevuld met andere oplossingen, afhankelijk van de toepassing. Het wordt aanbevolen om oplossingen te maken met mobiele anionen zoals methaansulfonaat, Cl- , aspartaat of soortgelijke ionen om de pipetweerstand te verminderen. De osmolariteit van de pipetoplossing moet tot 10 mOsm hoger zijn dan die van de badoplossing. Een iets hogere toniciteit van de pipetoplossing helpt om de toegangsweerstand tot de zaadcellen zo laag mogelijk te houden tijdens de patch-clamp-opname.
    1. Na visuele selectie van een zaadcel met de juiste morfologie (Figuur 2G), vult u de micropipet met een pipetoplossing (Tabel 4) en bevestigt u deze in de pipethouder.
    2. Om de pipetpunt vrij te houden van vuil, oefent u positieve druk uit op de pipet met behulp van de U-buisvormige constructie om ervoor te zorgen dat de pipetoplossing uit de punt stroomt nadat deze is ondergedompeld in de extracellulaire oplossing, hieronder ook wel de "badoplossing" genoemd (zie tabel 2).
      OPMERKING: Als de omstandigheden het toelaten, wordt de vorming van de afdichting onder constante perfusie ten zeerste aangeraden, omdat deze toestand zorgt voor de schoonste pipetpunt.
    3. Laat de pipet zakken en dompel de punt onder in de badoplossing (Tabel 2). Op dit moment kan de pipetweerstand worden gemeten (Figuur 7A).
    4. Om de cel duidelijk zichtbaar te maken, plaatst u de punt van de pipet boven de cd met de opening van de punt diagonaal (ongeveer 45°) uitgelijnd in de richting van de cd.
    5. Laat de punt van de pipet snel in de richting van de cd zakken om zich in hetzelfde brandpuntsvlak te bevinden, binnen een paar μm van de cd.
    6. Zodra de punt van de pipet de cd raakt, oefent u onderdruk uit op de pipet met behulp van het "mondstuk" om een deel van de druppel in de punt te bewegen en een gigaohm-afdichting te vormen - in de elektrofysiologie ook bekend als een "zuiggebeurtenis". Gewoonlijk kan na het eerste contact met de pipetpunt de onderdruk in de pipet tot een minuut worden gehandhaafd om geleidelijk een gigaohm-afdichting te bereiken.
    7. Na succesvolle vorming van de gigaohm-afdichting (> 4-20 GΩ), tilt u de spermatozoön van het dekglaasje (Figuur 7B).
      OPMERKING: Deze stap is vanwege hun lengte niet vereist voor zaadcellen van knaagdieren; Gedeeltelijke loslating van het flagellum van het sperma is echter gunstig om mogelijke pipetdrift te verlichten. Loslating van menselijk sperma is een essentiële stap, aangezien de CD klein is (1~3 μm); als de cel aan het dekglaasje blijft zitten, kan zelfs een kleine afwijking van de pipet tijdens het experiment de cd verstoren. Nadat de spermatozoön is opgetild, blijft het flagellum normaal gesproken kloppen, terwijl de cel alleen aan de micropipet is bevestigd.
  5. Inbreken en overgaan naar de hele-celmodus.
    1. Compenseer verdwaalde capaciteitstransiënten met behulp van de compenserende modus van de versterker voordat u overschakelt naar de modus voor de hele cel (Afbeelding 7B). Om capaciteitstransiënten in eerste instantie waar te nemen, houdt u het membraanpotentiaal op 0 mV en past u 10 mV-pulsen toe met behulp van de "Membrane Test"-tool (Figuur 7B).
    2. Voer een inbraak uit en ga over naar de modus voor de hele cel door korte (1 ms) geleidelijk toenemende (430-650 mV, ~50 mV stap) spanningspulsen toe te passen in combinatie met een zeer lichte zuigkracht (Figuur 7C).
      OPMERKING: Om inbraakpulsen toe te passen, gebruikt u het eerder geprogrammeerde inbraakprotocol in de patchklemsoftware. De inschakelspanningspulsen worden op de spermatozoön toegepast met behulp van de hoogspanningsopdrachtingang (achtergeschakeld) aan de achterkant van de versterker.
    3. Start na het toepassen van elke inbraakspanningspuls de membraantesttool om te controleren of er transiënten met een grotere capaciteit verschijnen.
      OPMERKING: De aanwezigheid van transiënten met grote capaciteit (Figuur 7C) geeft aan dat de inbraak heeft plaatsgevonden en dat de volledige capaciteit van de cel wordt gemeten (~1 pF voor menselijk sperma en ~2,5 pF of meer voor muizensperma).
    4. Monteer de transiënten met grote capaciteit met behulp van de membraantesttool om de capaciteit van de hele cel en de toegangsweerstand te bepalen.
      OPMERKING: De toegangsweerstand moet zo laag mogelijk zijn voor een efficiënte perfusie van het inwendige van de zaadcel met de micropipetoplossing, evenals voor een betrouwbare spanningsklem van het plasmamembraan van het sperma. De toegangsweerstand is meestal 25-30 MΩ en 50-70 MΩ voor respectievelijk Cs+ /K+ - en NMDG-gebaseerde intracellulaire oplossingen.
    5. Ga na een succesvolle inbraak verder met de geplande patch-clamp-experimenten met hele cellen, zoals het aanbrengen van verschillende badoplossingen (Figuur 8) met verschillende verbindingen of het meten van kanaalactiviteiten met behulp van spanningsstap- (Figuur 8, Figuur 9) of spanningsverhogingsprotocollen. Als de inbraak niet is gelukt, gaat u terug naar stap 6.4.1. door een verse micropipet te kiezen en een andere geschikte zaadcel te selecteren.

Resultaten

De klemmethode voor spermapleisters maakt directe opname van het CatSper-kanaal mogelijk.
Zoals hierboven vermeld, werden CatSper-opnames uitgevoerd door een afdichting met hoge weerstand (gigaohm) tot stand te brengen tussen de patchpipet en de spermatozoön van zoogdieren bij de cytoplasmatische druppel. Bij het inbreken en overgaan naar de hele-celmodus, wordt volledige elektrische toegang tot het hele lichaam van de zaadcel en het inwendige ervan, inclusief de spermakop en het flagellum, verkregen 2,8,39,51. Deze toestand maakt het uiteindelijk mogelijk om op te nemen vanuit elk actief ionkanaal dat zich op het plasmamembraan van het sperma bevindt. Een badoplossing die nominaal tweewaardig vrij (DVF) is en cesium of natrium als hoofdpermeenion bevat, heeft de voorkeur voor het registreren van monovalente CatSper-stromen 2,8,39,51. Terwijl het CatSper-kanaal tweewaardige ionen zoals Ca2+ en Ba2+ geleidt, bewegen ze veel langzamer door de CatSper-porie, wat resulteert in nauwelijks detecteerbare geleiding van enkele picoampères (~10-20 pA)2,8,39,51. Daarom is het meten van monovalente en dus grotere stromen via het CatSper-kanaal een handigere manier om de stroom te beoordelen (Figuur 8). Het is belangrijk op te merken dat CatSper ook doorlaatbaar is voor kalium; daarom moet het CatSper-kanaal worden geblokkeerd, of CatSper-deficiënte zaadcellen moeten worden gebruikt in situaties waarin men alleen de kaliumkanalen van zaadcellen 2,3,8,28,65 wil bestuderen. Door de ionensamenstelling van de pipet- en badoplossing te variëren, kan men selectief bepaalde ionenkanalen uitsluiten, terwijl voorwaarden worden gecreëerd voor selectieve registratie van alleen specifieke ionkanaaltypes. Toevoeging van Cs+ aan de pipetoplossing resulteert bijvoorbeeld in het blokkeren van de ionenpermeabiliteit door de kaliumkanalen van het sperma.

Het CatSper-kanaal wordt anders gereguleerd tussen zoogdiersoorten.
Zaadcellen van verschillende soorten zijn divers in hun morfologie en interne regulerende routes66. Het is geen verrassing dat hun ionenkanalen ook uniek worden gereguleerd op manieren die de gespecialiseerde micro-omgevingen van de mannelijke en vrouwelijke voortplantingsorganen weerspiegelen. De sperma-patch-clamp-methode is met succes toegepast op zes zoogdiersoorten: muizen2, ratten56, mensen39,51, runderen, zwijnen en makaken41, zoals weergegeven in figuur 9. Voor deze experimenten werden zaadcellen van volwassen mannelijke resusapen [Macaca mulatta] verkregen van het California National Primate Research Center in overeenstemming met de normen van de Association for Assessment and Accreditation of Laboratory Animal Care International (AAALAC) onder goedgekeurde dierprotocollen door de University of California, Davis, zoals beschreven in41; en alle onderzoeken werden uitgevoerd in overeenstemming met de Amerikaanse National Institutes of Health Guide for the Care and Useof Laboratory Animals. Stieren- en berensperma werden verkregen als bijproducten die waren vrijgesteld van specifieke IACUC-goedkeuring van de faciliteiten van het UCD Department of Animal Science en alle dieren werden gehouden in door AAALAC goedgekeurde faciliteiten. Sperma van stieren en beren kan ook uit commerciële bronnen worden verkregen.

Primaat (resusaap) en menselijke spermatozoa vertoonden vergelijkbare eigenschappen en regulatie van het CatSper-kanaal. Interessant is dat progesteronactivering van CatSper uniek lijkt te zijn voor spermatozoa van primaten (Figuur 9 en 41), aangezien sperma van zwijnen, stieren en knaagdieren geen progesteron-gestimuleerde verandering van hun CatSper-stromen vertoonde. In spermatozoa van stieren en zwijnen lag zelfs de basale activiteit van het CatSper-kanaal onder de detecteerbare limieten (Figuur 9), wat suggereert dat bij deze soorten de calciuminstroom en de daaruit voortvloeiende hyperactivatie wordt aangedreven door andere kanalen/transporters, of dat een andere natuurlijke stimulator nodig is voor de activering van hun CatSper-kanalen. Bij alle hier genoemde spermasoorten, inclusief stieren- en zwijnenspermacellen, werd de volledige elektrische toegang tot het inwendige van de zaadcellen verkregen en werden de cellen geregistreerd in de hele-celmodus, zoals bleek uit het verschijnen van de artefacten met grote capaciteit bij het inbreken (Figuur 7). Deze aandoening maakt het mogelijk om het functionele CatSper-kanaal gemakkelijk te registreren, en de afwezigheid ervan in spermatozoa van beren en runderen geeft aan dat dit kanaal ofwel wordt geblokkeerd door een nog onbekende endogene remmer die aanwezig is in de zaadcellen van deze soorten, ofwel een specifieke modulator vereist om te worden geactiveerd. Dit zijn echter voorbereidende experimenten en er zullen aanvullende experimenten nodig zijn voor spermacellen van beren en stieren om het functionele belang van het CatSper-kanaal bij deze soorten te garanderen. Dit brede spectrum van diversiteit aan sperma-ionkanalen tussen soorten kan verband houden met de verhouding tussen sperma en eigrootte, de relatie tussen de grootte van het sperma en de beschermende gewaden van het ei, of dienen als een barrière voor bevruchting door andere soorten66.

figure-results-1
Figuur 1: Morfologische diversiteit van het sperma van zoogdieren. (A) Onderste paneel: schematische weergave van een spermatozoön; Mobiele compartimenten zijn gelabeld. Bovenste panelen: DIC-afbeeldingen van spermatozoa van verschillende soorten met de klok mee: rat (Rn; Rattus norvegicus); muis (Mm; Mus musculus); stier (Bt; Bos taurus); zwijn (Sd; sus scrofa domesticus); menselijk (Hs; Homo sapiens) en resusaap (Mmu; Macaca mulatta). De schaalbalk is van toepassing op alle DIC-afbeeldingen. Inlegvellen geven cytoplasmatische druppeltjes aan. (B) Patchen van de zaadcellen van zoogdieren. Om een succesvolle afdichtingsvorming tussen de pipetpunt en het plasmamembraan te bereiken, wordt een deel van het plasmamembraan voorzichtig in de pipetpunt gezogen. De overdracht naar de hele-celmodus wordt uitgevoerd door het plasmamembraan tussen de punt en de cel te scheuren (dit cijfer is gereproduceerd van8). Rechterpaneel: menselijke zaadcellen bevestigd aan een registrerende micropipet. (C) Schematische weergave van menselijke spermatozoön en enkele van de flagellaire ionenkanalen die in menselijke zaadcellen zijn bestudeerd met behulp van de patch-clamp-methode, evenals de ionen die ze geleiden. CatSper- calciumionenkanaal 39,51; Hv1- protonkanaal 51,56,67; Slo3/Slo1- kaliumkanalen 50,53,65,68; TRPV4- transiënte receptorpotentiaal kationkanaal vanilloïde type 448. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

figure-results-2
Figuur 2: Spermagrootte en variabele morfologie van cytoplasmatische druppeltjes. De DIC-beelden van intacte levende zaadcellen. (A) Vergelijking van de grootte van een menselijke zaadcel (onder) en twee CHO-cellen (boven). (B) Intacte menselijke (Homo sapiens) spermatozoön (onder) en een zaadcel zonder kop (flagellum, boven). Cytoplasmatische druppeltjes worden aangegeven door gele pijlpunten; Dit cijfer is gereproduceerd uit8. (C) Intacte muizen (Mus musculus) spermatozoön met de normaal gevormde cytoplasmatische druppeltjes (CD) aangegeven door de gele pijlpunt. (D-G) Epididymale muizenzaadcellen hebben cytoplasmatische druppeltjes van verschillende groottes en vormen; alleen (C) en (G) zijn geschikt voor patch-clamp. (D) CD is microscopisch klein en eenzijdig; (E) CD ontbreekt; (F) de cd bevat deeltjes die de opnamepipet kunnen verstoppen; (G) CD is glad, uniform en niet gezwollen. Het vormen van een gigaseal met dit type CD zal waarschijnlijk resulteren in een succesvolle opname. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

figure-results-3
Figuur 3: Componenten van de klemopstelling van de spermapleister. (A) Typische elektrofysiologische opstelling van het sperma met essentiële componenten: (1) omgekeerde microscoop; (2) digitalisator met weinig ruis; (3) versterker; (4) micromanipulator met lage drift die is gekoppeld aan de omgekeerde microscoop met een micromanipulatorplatform; (5) PC-computer; (6) een trillingsdempende luchttafel; (7) Kooi van Faraday om de opstelling te beschermen tegen elektrische interferentie in de omgeving. Het is essentieel dat alle elektrisch aangedreven componenten van de rig, inclusief het toetsenbord en de muis van de computer, weinig of geen elektrisch geluid (50 Hz of 60 Hz) produceren en dat alle componenten van de rig goed geaard zijn. (B) Micropipettrekker die wordt gebruikt voor het registreren van de fabricage van pipetten. (C) (1) microForge gebruikt voor het brandpolijsten van pipetten; (2) capillairen van borosilicaatglas met een buitendiameter van 1,5 mm, een binnendiameter van 0,86 mm en een inwendig filament; (3) pipet opvangdoos. (D) Stadia van succesvol pipetten brandpolijsten: (a) Ongepolijste pipet met een binnendiameter van 2 mm; b) vuurgepolijste pipet met een binnendiameter van 0,5 mm; (c) Te gepolijste verzegelde pipet, niet geschikt voor opname. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

figure-results-4
Figuur 4: Componenten van het registratiekamersysteem en de assemblage ervan. (A) Essentiële componenten van het registratiekamersysteem: (1) microscooptrapadapter voor serie 20-platforms met (2) tweetraps klemmen; (3-4) PM-serie magnetisch verwarmd platform met (3) magnetische klemmen om de perfusiekamer vast te houden; (5) perfusiekamer; (6) Agar-brug; (7) magnetische klem, referentie-elektrode met 2 mm aansluiting naar Ag/AgCl-pellet; (8) magnetische houder (MAG-1) voor de zuigleiding; (9) zuigbuis; (10) O-houder van de zuigbuis. (B) Geassembleerd registratiekamersysteem met aangegeven componenten van (A). Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

figure-results-5
Figuur 5: Componenten van het perfusiesysteem. (A) Geassembleerde perfusieleiding en (B) de essentiële componenten ervan: (1) spuiten van 20 ml en 3 ml; (2) kraan met Luer-aansluitingen; 4-voudig; mannelijk slot; (3) Vrouwelijke Luer Slang Weerhaakadapter, 1/16"; (4) Perfusieslang van polytetrafluorethyleen (PTFE) (Microbore PTFE-slang, 0,022" ID × 0,042" OD); (5) Polytetrafluorethyleen perfusiespruitstuk met 8 posities; (6) Siliconen connectorslang (platina-uitgeharde siliconen slang, 1/32" ID × 3/32" OD); (7) Connectorslangen voor spruitstuk (PTFE-slang, 1/32" ID × 1/16" OD). Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

figure-results-6
Figuur 6: Dissectie van mannelijke muizen. (A) Mannelijke voortplantingsorganen van muizen; Zowel de testis als de bijbal worden getoond. (B) De epididymiden worden overgebracht naar een celkweekschaaltje van 35 mm dat de HS-oplossing bevat en het resterende vet en de zaadleider worden verwijderd. (C) Elke bijbal wordt vervolgens verdeeld in caput, corpus en cauda met behulp van een #15 scalpelmes. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

figure-results-7
Figuur 7: Gigaseal-vorming en inbraak met de muizenzaadcel. De interface van de "Membrane Test" tool van de commerciële patch clamp software. Drie fasen van het afklemmen van de spermapleister: (A) de opgenomen pipet wordt ondergedompeld in een HS-badoplossing met een pipetweerstand van 14,8 MΩ; (B) Er wordt een gigaseal gevormd (weerstand is 4,7 GΩ), capaciteitstransiënten worden gecompenseerd en de spermatozoön wordt van het dekglaasje getild; (C) Overgang naar de modus voor de hele cel. Inbraak en overgang naar de hele-celmodus wordt uitgevoerd door korte (1 ms) geleidelijk toenemende (430-650 mV, ~50 mV stap) spanningspulsen toe te passen in combinatie met een lichte zuigkracht, zoals links weergegeven. Inbraak heeft plaatsgevonden, zoals blijkt uit het verschijnen van de transiënten met grote capaciteit die de volledige capaciteit van de cel weerspiegelen (~2,93 pF voor deze zaadcel). Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

figure-results-8
Figuur 8: Muriene CatSper-opname van wildtype (WT) cauda epididymale, gecapaciteerde en CatSper knock-out spermatozoa. Om monovalente CatSper-activiteit te registreren, wordt elke 5 s een ramp-protocol toegepast en CatSper-stromen opgewekt door spanningshellingen vanaf een houdpotentiaal van 0 mV39,51. Spanningshellingen (-80 mV tot 80 mV; 850 ms) worden toegepast in HS en nominaal tweewaardige vrije oplossing (DVF). Gegevens werden bemonsterd op 2-5 kHz en gefilterd op 1 kHz. Basisstromen worden geregistreerd in HS-oplossing, die geen CatSper-stroom produceert als gevolg van remming door hoog extracellulair magnesium39,51. Basisstromen zijn nuttig om de lekgeleiding (niet-ionkanaalroutes) te schatten. Representatieve, Cs+ volcellige CatSper-stroomdichtheden (pA/pF; blauw) geregistreerd van caudale WT-muizenzaadcellen (niet-gecapaciteerd; links en gecapaciteerd; midden) en CatSper-deficiënte caudale muizenzaadcellen (rechts). Stromen werden opgewekt door spanningshellingen met een houdpotentiaal van 0 mV en hellingen werden toegepast van -80 mV tot 80 mV in HS en nominaal tweewaardige oplossing. Basisstromen (zwart) geregistreerd in HS-oplossing. Om stroomdichtheden te verkrijgen, werden de stroomamplitudes van CatSper genormaliseerd naar celcapaciteit (pA/pF). Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

figure-results-9
Figuur 9: Progesteronregulatie van CatSper bij verschillende zoogdiersoorten. (A) Representatieve CatSper-stroom opgewekt uit zaadcellen van verschillende soorten door middel van een spanningshellingsprotocol zoals aangegeven. Soort: mens (Hs; H. sapiens); resusaap (Mmu; M. mulatta), muis (Mm; M. musculus), stier (Bt; B. taurus); rat (Rn; R. norvegicus); zwijn (Sd; S. scrofa domesticus). CatSper-stromen in afwezigheid (blauw) en aanwezigheid (rood) van 1 mM progesteron werden geregistreerd, evenals de basale stromen in HS-oplossing (zwart). (B) CatSper stroomamplitudes (ICatSper, pA) en (C) Gemiddelde stroomdichtheden (pA/pF) opnames van zaadcellen van verschillende soorten zoals aangegeven; n geeft het aantal gebruikte individuele zaadcellen aan. Gegevens zijn gemiddeld +/- S.E.M. Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.

figure-results-10
Figuur 10: Het verschil in flagellaire motiliteit. Twee representatieve voorbeelden van cytoplasmatische druppeltjes en flagellaire motiliteit. De over elkaar heen gelegde beelden van dezelfde rat (Rn) en menselijke (Hs) zaadcellen werden genomen op twee verschillende tijdstippen wanneer ze de meest distale flagellaire afbuiging vertonen. Gestippelde rechthoeken geven het gebied aan met cytoplasmatische druppeltjes en de bijbehorende ruimtelijke mobiliteit. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

figure-results-11
Figuur 11: U-buis en de essentiële onderdelen daarvan. (A) Onderdelen van de U-buis: (1) Serologische pipet van 10 ml; (2) Siliconen slang; (3) Het buizenstelsel van de siliconeschakelaar; (4) Spuit van 1 ml; (5) Vrouwelijke luer weerhaakadapter; (6) mannelijke Luer integrale slotadapter 1/8"; (7) kraan met Luer-aansluitingen; 4-voudig; mannelijk slot; (8) mannelijke Luer-serie barb-adapter, 1/16". (B) Volledig gemonteerde U-buis en (C) U-buis bevestigd aan de kooi van Faraday. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

figure-results-12
Figuur 12: Een schematische weergave van de U-buis. Linkerpaneel: Positieve luchtdruk wordt via de mond geleverd om een verschil in vloeistofniveaus in de U-buis te creëren. Het vloeistofgehalte in de rechterhoorn stijgt met 2 cm. Nadat dit niveauverschil is ontstaan, wordt de kraan gedraaid om de U-buis aan te sluiten op de leiding die naar een opnamepipet leidt. Rechterpaneel: het hogere vloeistofniveau in de rechterhoorn zorgt voor positieve druk die de pipetoplossing constant uit de pipetpunt duwt en de punt vrij houdt van vuil. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

ChemicaliënMolair gewicht (g/mol)Mmg voor 1L
NaCl58.4497.85,72 gr
Kcl74.5550.373 gr
KH2PO4136.090.3750,4 mg
MgSO4 x 7.H2O246.480.249,3 mg
CaCl2 x 2.H2O147.0220,294 gr
HEPES238.3204.766 gr
Glucose180.230.540 gr
Natriumlactaat (60% w/m)112.06203 ml
Natriumpyruvaat1100.444 mg

Tabel 1: Oplossing van menselijke tubulaire vloeistof (HTF)

ChemicaliënMolair gewicht (g/mol)Mmg voor 1L
NaCl58.441357.889 gr
Kcl74.5550.373 gr
CaCl2 x 2. H2O147.0220,294 gr
MgSO4 x 7. H2O246.4810.247 gr
HEPES238.3204.766 gr
Glucose180.250,901 gr
Natriumlactaat (60% w/m)112.06101,5 ml
Natriumpyruvaat11010,110 gr

Tabel 2: Oplossing met een hoog zoutgehalte (HS)

ChemicaliënMolair gewicht (g/mol)Mmg (voor 500 ml)
CsMeSO3 228.014015.960 gr
HEPES238.3404.766 gr
EDTA292.2410,146 gr

Tabel 3: CsMeSO3 badoplossing (Tweewaardige vrije badoplossing: DVF)

ChemicaliënMolair gewicht (g/mol)Mmmg (voor 25 ml)
CsMeSO3228.0130741 mg
HEPES238.370417 mg
EDTA292.24214,6 mg
EGTA380.35328,5 mg
CsCl1 M oplossing125 μl

Tabel 4: CsMeSO3 pipetoplossing

Discussie

We beschrijven een gedetailleerd protocol om elektrofysiologische opnames uit te voeren van zaadcellen van verschillende soorten. Gezien de fysiologische betekenis van ionkanalen en elektrogene transporters voor spermatozoa, is deze techniek een krachtig hulpmiddel om de fysiologie van zaadcellen te bestuderen, evenals defecten die leiden tot mannelijke onvruchtbaarheid. De experimentator kan de uitvoering van deze techniek in het begin een uitdaging vinden, maar met doorzettingsvermogen en uithoudingsvermogen volgt succes.

Spermatozoa van zoogdieren zijn lang (meestal >50 μm), smal en zeer beweeglijk. De basale slagfrequentie (BF) van spermatozoa van zoogdieren varieert sterk met waarden van gemiddeld 4 Hz (muis 69), 7-15 Hz (zwijn 70,71), 11 Hz (rat 72), 11-20 Hz (stier 18), 24 Hz (resusaap 23) en tot 25 Hz (mens 3). De cytoplasmatische druppel (CD) is de ingang voor het opnemen van zaadcellen. Bij spermatozoa van knaagdieren is de CD vaak distaal maar beweegt hij langs het flagellum (Figuur 10), wat een extra obstakel vormt voor de registratie. In menselijke zaadcellen bevindt de CD zich echter vaker in de buurt van het hoofd. De belangrijkste componenten van een succesvolle sperma-patch-klem zijn daarom uitstekende optica om een helder, scherp beeld van de CD mogelijk te maken en een zeer nauwkeurig micromanipulatorsysteem zonder drift of trillingen. Een aanvankelijke hoge mate van falen wordt verwacht en is normaal binnen de eerste paar dagen na de klem van de spermapleister. We raden aan om routinematig te oefenen met meerdere pogingen per week. Door meerdere opnames per dag per week te maken, ontstaat er een routine en verbetert u de motoriek.

Tot voor kort werd de identificatie en farmacologische karakterisering van sperma-ionkanalen belemmerd door het onvermogen om ze rechtstreeks te bestuderen. Het veld vertrouwde grotendeels op immunocytochemische studies, die vaak lijden aan niet-specificiteit van antilichamen en/of het ontbreken van overeenkomstige genetische modellen. Om calciumkanalen te bestuderen, is de klassieke calciumbeeldvormingsmethode op grote schaal gebruikt, die zijn eigen voordelen en beperkingen heeft 73,74,75,76,77. Hoewel calciumbeeldvorming een relatief eenvoudige methode is die toepasbaar is voor onderzoeken met een gemiddelde tot hoge doorvoer 78,79,80,81 en minder invasief is, vereist het relatief intacte cellen en vormt het daarom een hindernis om de functie van ionenkanalen die zijn losgekoppeld van intracellulaire signaalcascades te ontleden of om ze te onderscheiden van calciumionenwisselaars. Bovendien is het moeilijk om de membraanpotentiaal te controleren en daarom moeilijker om de bijdrage van de spanningsafhankelijke calciumkanalen uit te sluiten. Een van de voordelen van calciumfluorometrie is het gebruik van calciumratiometrische kleurstoffen die een nauwkeurige meting van de veranderingen in de calciumionenconcentratie mogelijk maken. Tegelijkertijd moet men zich ervan bewust zijn dat de gevoeligheid van deze kleurstoffen kan variëren op basis van de veranderingen in de intracellulaire pH.

Hieronder beschrijven we de kritieke stappen binnen het protocol, inclusief stappen voor het oplossen van problemen van de methode. Het is van essentieel belang om alleen zuivere reagentia te gebruiken voor de bereiding van de experimentele oplossingen, omdat zelfs kleine verontreinigingen met ongewenste ionen (zoals magnesium of zware metalen) de detectie van monovalente stromen kunnen belemmeren. Gezien de kleine omvang van de zaadcellen kan men een relatief laag aantal ionenkanalen per cel verwachten. De nettostroom varieert dus van enkele pA tot enkele honderden pA. Daarom moet de interne elektrische ruis van de installatie minimaal zijn om detectie van kleine stromen te garanderen, en het gebruik van driftvrije apparatuur wordt ten zeerste aanbevolen. Om een specifieke geleiding te onderscheiden van elektrische ruis en achtergrondlek, moeten het opnameapparaat en het aardingssysteem worden gemaximaliseerd. Dit wordt bereikt door de rig goed te aarden om elektrische interferentie te voorkomen82. Het gebruik van een kooi van Faraday wordt ten zeerste aanbevolen om te beschermen tegen elektrische interferentie die wordt geproduceerd door een verscheidenheid aan elektrische apparaten, zoals verlichting voor gebouwen en elektrische bedrading in de muur. Het is essentieel dat alle elektrisch aangedreven componenten van de rig, inclusief het computertoetsenbord en de muis, weinig of geen elektrisch geluid (50 Hz of 60 Hz) uitstralen en dat alle componenten van de rig goed geaard zijn. De elektrische ruis in de configuratie van de hele cel, wanneer alle ionenkanalen gesloten zijn, moet < 0,5-1 pA bedragen.

Een ander belangrijk punt is het bewaken van de juiste osmolariteiten van de werkende oplossingen. De samenstelling van de intra- en extracellulaire oplossingen moet nauwkeurig worden bepaald en hun osmolariteiten moeten correct worden gemeten. De extracellulaire oplossing moet enigszins hypotoon zijn in vergelijking met de pipetoplossing, omdat dit leidt tot minuscule celzwelling en voorkomt dat de pipet verstopt raakt door het spermamembraan. Opmerking: als de pipetoplossing te hypertoon is en meer dan 10 mOsm afwijkt van de badoplossing, ontstaat overmatige celzwelling en scheuring van de afdichting. Als gevolg hiervan zal de cel kwetsbaar zijn en zal de gigaseal binnen enkele seconden na inbraak verloren gaan. Onze ervaring is dat een onnauwkeurige voorbereiding van de oplossing een van de meest voorkomende fouten is die een succesvolle patch-klemming in de weg staat.

Een ander mogelijk obstakel dat moet worden vermeden, zijn weekmaker/ftalaatbevattend plastic, evenals spuiten met minerale olie. De slangen, spuiten en alle plastic apparatuur die in aanraking komt met oplossingen, en dus zaadcellen, mogen geen weekmakers of andere milieutoxines of oliën uitlogen, aangezien dergelijke chemicaliën de activiteit van het ionenkanaal aanzienlijk kunnen veranderen. We gebruiken Teflon-slangen met een kleine diameter als de belangrijkste perfusielijn. Teflon (PTFE) heeft weinig uitloogbare verbindingen, maar is vrij stijf. Flexibele verbindingen zijn gemaakt van zeer zuivere siliconen slangen die over de teflonslang passen. Alle spuiten die voor het perfusiesysteem worden gebruikt, bevatten geen smeermiddel, omdat de minerale olie of andere smerende additieven de opname van ionenkanalen kunnen verstoren.

We kunnen het belang van het gebruik van het juiste glas en het trekken van de juiste micropipetvorm niet genoeg benadrukken. Daarom is de optimale fabricage van glazen micropipetten een voorwaarde voor succesvol patchen. We gebruiken glazen micropipetten die alleen zijn gemaakt van borosilicaatglas met een filament voor een betere vulling van de oplossing. De punt van de pipetten moet vuurgepolijst zijn om de ideale goede afdichting te bieden. Pipetpunten met een diameter van meer dan 2 μm (en dus een weerstand van 10 MΩ of lager) zijn over het algemeen niet geschikt voor zaadcellen patch-clamp.

Een andere belangrijke stap is ervoor te zorgen dat de punt van de micropipet vrij wordt gehouden van vuil of luchtbellen voordat de afdichting wordt gevormd. Dit is een moeilijke taak, aangezien de micropipet in een oplossing vol beweeglijke cellen wordt geladen. Een factor die helpt voorkomen dat de pipet per ongeluk in vrijzwemmende zaadcellen "stoot", is het gebruik van een constante perfusie om alle niet-aanhangende cellen weg te spoelen. Een ander hulpmiddel is een zelfgemaakte "U-buis" waarmee men kan schakelen tussen positieve en negatieve drukmodi om de punt schoon te houden (Figuur 11 en Figuur 12).

Omdat zaadcellen sterk variëren in de vorm en grootte van hun cytoplasmatische druppeltjes (CD), is het belangrijk om een druppel met een geschikte morfologie te kiezen. Zoals weergegeven in figuur 2, zijn alleen cd's die klein (1-3 μm), glad, uniform en niet overdreven gezwollen zijn, geschikt voor patch-clamp. Klein, eenzijdig; "opgeblazen", volledig transparante cd's produceren zwakke of geen afdichtingen. Cd's met grote oplosbare deeltjes kunnen de opnamepipet verstoppen. Wanneer spermatozoa van testiculaire muizen de bijbal binnendringen, bevinden hun cd's zich in het nekgebied, dicht bij het hoofd. Terwijl ze door de bijbal reizen, bewegen hun cd's langs het middenstuk en komen uiteindelijk aan bij de verbinding tussen het middenstuk en het hoofdstuk (de annulus) wanneer spermatozoa de cauda epididymis bereiken. Daarom, zoals hierboven vermeld in zaadcellen geïsoleerd uit de corpus epididymis, bevindt de CD zich meestal dicht bij het midden van het middenstuk. In caudale cellen kan de CD meestal dicht bij de annulus worden gevonden (Figuur 2C). Voor menselijk sperma bevindt de CD zich in het nekgebied (Figuur 2A,B).

Hoewel dit geen probleem is voor spermatozoa geïsoleerd uit proefdieren, bestaat er een aanzienlijke variabiliteit tussen menselijke donoren. Variatie in spermakwaliteit binnen dezelfde donor heeft vooral invloed op de kwaliteit van het plasmamembraan van het sperma en maakt zeehondenvorming soms relatief moeilijk. Er is minder variabiliteit in ionkanaalgedrag en farmacologie, factoren die waarschijnlijk correleren met individuele genetica of fysiologie. Men moet volhardend zijn en monsters van verschillende donaties gedurende meerdere dagen beoordelen, en ook vertrouwen op meerdere menselijke donordeelnemers. Het werken met menselijk materiaal vereist extra geduld, aangezien gedoneerd sperma sterk varieert in spermakwaliteit binnen dezelfde donor, afhankelijk van verschillende omgevingsfactoren. We raden aan om monsters van verschillende donatiedagen te beoordelen om een definitieve beslissing te nemen over de donorstatus. Terwijl geëjaculeerde gezuiverde spermatozoa over het algemeen binnen enkele uren geschikt zijn voor elektrofysiologie (tot 12 uur na isolatie voor menselijk sperma), zijn epididymale muizenzaadcellen alleen geschikt om te patchen binnen een periode van 2 uur na isolatie.

En last but not least verschilt de vorming van gigasealers tussen zaadcellen. Voor zaadcellen van muizen/knaagdieren vindt de vorming van gigasealers vrijwel onmiddellijk plaats, terwijl er enkele seconden (en soms tot een minuut) nodig zijn om een gigaseal te vormen met een menselijk sperma. Vaak resulteert de initiële afzuiging in een ingangsweerstand van 200 MΩ tot 800 MΩ. Het omschakelen van de houdpotentiaal naar -60 mV en het verstrekken van "Membrane Test" korte pulsen tot 10 mV helpt vaak bij het redden van gigasealvorming (door door spanningsveld geïnduceerde beweging van het membraan in de pipet).

De spermacel pleisterklemtechniek maakt het mogelijk om specifieke ionenkanalen in hun natuurlijke expressiesysteem gedetailleerd te bestuderen. Het succes van de techniek hangt af van de juiste apparatuur, levensvatbare zaadcellen van hoge kwaliteit, zuivere reagentia, basisvaardigheden op het gebied van elektrofysiologie, geduld en doorzettingsvermogen. De methode opent nieuwe grenzen in de fysiologie van het sperma door de evolutionaire diversiteit van ionenkanalen, mechanismen van hun regulatie en veranderingen in hun functie te bestuderen wanneer ze van het mannelijke naar het vrouwelijke voortplantingsstelsel gaan en worden veranderd door exogene omstandigheden, zoals pH en liganden.

Openbaarmakingen

De auteurs hebben niets te onthullen.

Dankbetuigingen

Dit werk werd ondersteund door NIH Grant R01GM111802, Pew Biomedical Scholars Award 00028642, Alfred P. Sloan Award FR-2015-65398 en Packer Wentz Endowment Will (aan P.V.L.). Dit werk werd ook ondersteund door Deutsche Forschungsgemeinschaft (Duitse Stichting voor Onderzoek) 368482240/GRK2416 (naar N.M.) en door China Scholarship Council Fellowship naar B.L. We danken Dr. Dan Feldman voor het delen van rattenweefsel, Katie Klooster en Stuart Meyers van UC Davis voor hun hulp bij het verwerven van zaadcellen van primaten, en Steven Mansell voor de hulp bij het analyseren van gegevens over de analyse van spermacellen van beren en stieren.

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel
NaamBedrijfCatalogusnummerOpmerkingen
IX71 met DIC-opticsOlympus IncIX71Nikon TiU-microscoop kan ook worden gebruikt
UplanSApo 60xOlympus Incwater-immersieobjectief
Vibratiedemping luchttafelNewport IncTMC luchttafels of soortgelijke kunnen worden gebruikt
Axopatch™ 200B versterkerAxon™  /Molecular DevicesSutter IPA®/Double IPA® Geïntegreerd patch clamp systeem is ook een uitstekende versterker
Axon Digidata analoog naar digitaal converterAxon™  /Molecular Devices1440 of 1550kan ook worden gebruikt
Vapordruk osmometerWescormodel 5600
MPC 385 micromanipulatorSutter Instruments, Novato CAMPC 385De Eppendorf micromanipulator TransferMan-serie kan ook worden gebruikt
Micropipet-trekkerSutter Instruments, Novato CAP1000P97 kan worden gebruikt
MicroForgeNarishigeMF-830Moet zijn uitgerust met Nikon MPlan 100/0.80 ELWD 210/0 objectief
Faraday kooiZelfgemaaktom de opstelling te beschermen tegen elektrische interferentie uit de omgeving
 5 mm glazen dekglasWPI #502040
PerfusiekamerWarner Instruments, Inc RC-24E
Borosilicaatglas capillairSutter Instruments, Novato CABF 150-85-7.5buitendiameter 1,5 mm, binnendiameter 0,86 mm en een intern filament
Teflon manifold MP-8Warner Instruments, Inc64-0211Teflon 8-posities perfusie manifold
Nunc 4-putjesplaatNunc#179820
1 X HTF bufferEmbryoMaxMR-070-Dcapacitatieoplossing
SA-Oly/2 stages adapterWarner Instruments, Incvoor series 20 platformsalleen voor Olympus microscoop
Magnetische verwarmde platformWarner Instruments, IncPM-1 of soortgelijke serieom RC-24E kamer vast te houden
MAG-1 magnetische klemWarner Instruments, Inc#64-0358
Micro-elektrodehouder met 2 mm Ag/AgCl pelletWPIMEH3F4515
Stopkraan met Luer-aansluitingen; 4-weg; mannelijke vergrendelingCole-Parmer, IncEW-30600–09
vrouwelijke luer slangaansluiting, 1/16”Cole-Parmer, IncEW-45508–00
Polytetrafluorethyleen (PTFE) perfusieslangCole-Parmer, IncEW-06417–21(Microbore PTFE slang, 0,022” ID × 0,042” OD)
Silicone verbindingsslang (platina-gecureerde siliconen slang, 1/32” ID × 3/32” OD)Cole-Parmer, IncEW-95802–01
Manifold verbindingsslang (PTFE slang, 1/32” ID × 1/16” OD)Cole-Parmer, IncEW-06407–41
mannelijke Luer-serie slangaansluiting, 1/16”Cole-Parmer, Inc45518–00
Mannelijke Luer integrale vergrendelingsadapter 1/8”Cole-Parmer, Inc45-503-04
Silicone verbindingsslangDow Silicone Corporation;  MI#508-008
SpuitenFisher Scientific of VWRAir-Tite, Norm-Ject Luer1 mL, 3mL, en 20 mL
NaClSigma-AldrichS7653
KH2PO4Sigma-Aldrich60216
MgSO4 x 7.H2OSigma-Aldrich63140
CaCl2 x 2.H2OSigma-Aldrich21097
HEPESSigma-AldrichH7523-250G
GlucoseSigma-AldrichG8270
Natriumlactaat (60% w/w)Sigma-AldrichL7900
NatriumpyruvaatSigma-AldrichP2256
EDTASigma-AldrichBCBG2421V
CsMeSO3Sigma-AldrichC1426Cesium methaansulfonaat
KClFisher ScientificP217
EGTASigma-AldrichBCBF5871V
Tris-HClQuality Biological315-006-7211 M oplossing van vergelijkbaar
NaOHSigma-Aldrich221465
CsOHSigma-Aldrich232041
Embryomax Human Tubal Fluid-medium:MilliporeMR-070-Dcapacitatiemedium voor muisspermacellen
(Embryomax-HTF)
Dieren
Mannelijke Wistar-rattenWistarHarlan Laboratories (Livermore, CA)volwassen ratten
Mannelijke C57BL/6 muizenC57BL/6 muizenHarlan Laboratories (Livermore, CA)3-6 maanden oud

Referenties

  1. Sakmann, B., Neher, E. Patch clamp techniques for studying ionic channels in excitable membranes. Annual Review Physiology. 46, 455-472 (1984).
  2. Kirichok, Y., Navarro, B., Clapham, D. E. Whole-cell patch-clamp measurements of spermatozoa reveal an alkaline-activated Ca2+ channel. Nature. 439, 737-740 (2006).
  3. Smith, J. F., et al. Disruption of the principal, progesterone-activated sperm Ca2+ channel in a CatSper2-deficient infertile patient. Proceedings of the National Academy of Science U. S. A. 110, 6823-6828 (2013).
  4. Hille, B. Ion Channels of Excitable Membranes 3rd Edition. , Sinauer Associates - an imprint of Oxford University Press. (2001).
  5. Molleman, A. An Introductory Guide to Patch Clamp Electrophysiology. , John Wiley & Sons Ltd. (2003).
  6. Darszon, A., et al. Measuring ion fluxes in sperm. Methods Cell Biology. 74, 545-576 (2004).
  7. Lishko, P. V., et al. The control of male fertility by spermatozoan ion channels. Annual Review Physiology. 74, 453-475 (2012).
  8. Lishko, P., Clapham, D. E., Navarro, B., Kirichok, Y. Sperm patch-clamp. Methods in Enzymology. 525, 59-83 (2013).
  9. Ren, D., Xia, J. Calcium signaling through CatSper channels in mammalian fertilization. Physiology (Bethesda). 25, 165-175 (2010).
  10. Darszon, A., Labarca, P., Nishigaki, T., Espinosa, F. Ion channels in sperm physiology. Physiological Reviews. 79, 481-510 (1999).
  11. Cook, S. P., Brokaw, C. J., Muller, C. H., Babcock, D. F. Sperm chemotaxis: egg peptides control cytosolic calcium to regulate flagellar responses. Developmental Biology. 165, 10-19 (1994).
  12. Miller, R. L. Chemotaxis of the spermatozoa of Ciona intestinalis. Nature. 254, 244-245 (1975).
  13. Goltz, J. S., Gardner, T. K., Kanous, K. S., Lindemann, C. B. The interaction of pH and cyclic adenosine 3',5'-monophosphate on activation of motility in Triton X-100 extracted bull sperm. Biology of Reproduction. 39, 1129-1136 (1988).
  14. Gibbons, B. H., Gibbons, I. R. Flagellar movement and adenosine triphosphatase activity in sea urchin sperm extracted with triton X-100. Journal of Cell Biology. 54, 75-97 (1972).
  15. Carr, D. W., Acott, T. S. Intracellular pH regulates bovine sperm motility and protein phosphorylation. Biology of Reproduction. 41, 907-920 (1989).
  16. Babcock, D. F., Rufo, G. A., Lardy, H. A. Potassium-dependent increases in cytosolic pH stimulate metabolism and motility of mammalian sperm. Proceedings of the National Academy of Science U. S. A. 80, 1327-1331 (1983).
  17. Zeng, Y., Oberdorf, J. A., Florman, H. M. pH regulation in mouse sperm: identification of Na(+)-, Cl(-)-, and HCO3(-)-dependent and arylaminobenzoate-dependent regulatory mechanisms and characterization of their roles in sperm capacitation. Developmental Biolgy. 173, 510-520 (1996).
  18. Lindemann, C. B., Gibbons, I. R. Adenosine triphosphate-induced motility and sliding of filaments in mammalian sperm extracted with Triton X-100. Journal of Cell Biology. 65, 147-162 (1975).
  19. Lindemann, C. B., Goltz, J. S., Kanous, K. S. Regulation of activation state and flagellar wave form in epididymal rat sperm: evidence for the involvement of both Ca2+ and cAMP. Cell Motility and Cytoskeleton. 8, 324-332 (1987).
  20. Brokaw, C. J. Calcium-induced asymmetrical beating of triton-demembranated sea urchin sperm flagella. Journal of Cell Biology. 82, 401-411 (1979).
  21. Suarez, S. S. Control of hyperactivation in sperm. Human Reproduction Update. 14, 647-657 (2008).
  22. Suarez, S. S., Varosi, S. M., Dai, X. Intracellular calcium increases with hyperactivation in intact, moving hamster sperm and oscillates with the flagellar beat cycle. Proceedings of the National Academy of Science U. S. A. 90, 4660-4664 (1993).
  23. Ishijima, S., Mohri, H., Overstreet, J. W., Yudin, A. I. Hyperactivation of monkey spermatozoa is triggered by Ca2+ and completed by cAMP. Molecular Reproduction and Development. 73, 1129-1139 (2006).
  24. Ho, H. C., Granish, K. A., Suarez, S. S. Hyperactivated motility of bull sperm is triggered at the axoneme by Ca2+ and not cAMP. Developmental Biology. 250, 208-217 (2002).
  25. Schreiber, M., et al. Slo3, a novel pH-sensitive K+ channel from mammalian spermatocytes. Journal of Biological Chemisty. 273, 3509-3516 (1998).
  26. Santi, C. M., et al. The SLO3 sperm-specific potassium channel plays a vital role in male fertility. FEBS Letters. 584, 1041-1046 (2010).
  27. Zeng, X. H., Yang, C., Kim, S. T., Lingle, C. J., Xia, X. M. Deletion of the Slo3 gene abolishes alkalization-activated K+ current in mouse spermatozoa. Proceedings of the National Academy of Science U. S. A. 108, 5879-5884 (2011).
  28. Navarro, B., Kirichok, Y., Clapham, D. E. KSper, a pH-sensitive K+ current that controls sperm membrane potential. Proceedings of the National Academy of Science U. S. A. 104, 7688-7692 (2007).
  29. Navarro, B., Kirichok, Y., Chung, J. J., Clapham, D. E. Ion channels that control fertility in mammalian spermatozoa. International Journal of Developmental Biology. 52, 607-613 (2008).
  30. Quill, T. A., Ren, D., Clapham, D. E., Garbers, D. L. A voltage-gated ion channel expressed specifically in spermatozoa. Proceedings of the National Academy of Science U. S. A. 98, 12527-12531 (2001).
  31. Ren, D., et al. A sperm ion channel required for sperm motility and male fertility. Nature. 413, 603-609 (2001).
  32. Carlson, A. E., et al. Identical phenotypes of CatSper1 and CatSper2 null sperm. Journal of Biological Chemistry. 280, 32238-32244 (2005).
  33. Carlson, A. E., et al. CatSper1 required for evoked Ca2+ entry and control of flagellar function in sperm. Proceedings of the National Academy of Science U. S. A. 100, 14864-14868 (2003).
  34. Quill, T. A., et al. Hyperactivated sperm motility driven by CatSper2 is required for fertilization. Proceedings of the National Academy of Science U. S. A. 100, 14869-14874 (2003).
  35. Xia, J., Reigada, D., Mitchell, C. H., Ren, D. CATSPER channel-mediated Ca2+ entry into mouse sperm triggers a tail-to-head propagation. Biology of Reproduction. 77, 551-559 (2007).
  36. Chung, J. J., et al. Structurally distinct Ca(2+) signaling domains of sperm flagella orchestrate tyrosine phosphorylation and motility. Cell. 157, 808-822 (2014).
  37. Chung, J. J., et al. CatSperzeta regulates the structural continuity of sperm Ca2+ signaling domains and is required for normal fertility. eLife. 6, 23082(2017).
  38. Hwang, J. Y., et al. Dual Sensing of Physiologic pH and Calcium by EFCAB9 Regulates Sperm Motility. Cell. 177, 1480-1494 (2019).
  39. Lishko, P. V., Botchkina, I. L., Kirichok, Y. Progesterone activates the principal Ca2+ channel of human sperm. Nature. 471, 387-391 (2011).
  40. Strünker, T., et al. The CatSper channel mediates progesterone-induced Ca2+ influx in human sperm. Nature. 471, 382-386 (2011).
  41. Sumigama, S., et al. Progesterone accelerates the completion of sperm capacitation and activates CatSper channel in spermatozoa from the rhesus macaque. Biology of Reproduction. 93, 130(2015).
  42. Chung, J. J., Navarro, B., Krapivinsky, G., Krapivinsky, L., Clapham, D. E. A novel gene required for male fertility and functional CATSPER channel formation in spermatozoa. Nature Communication. 2, 153(2011).
  43. Wang, H., Liu, J., Cho, K. H., Ren, D. A novel, single, transmembrane protein CATSPERG is associated with CATSPER1 channel protein. Biology of Reproduction. 81, 539-544 (2009).
  44. Qi, H., et al. All four CatSper ion channel proteins are required for male fertility and sperm cell hyperactivated motility. Proceedings of the National Academy of Science U. S. A. 104, 1219-1223 (2007).
  45. Liu, J., Xia, J., Cho, K. H., Clapham, D. E., Ren, D. CatSperbeta, a novel transmembrane protein in the CatSper channel complex. Journal of Biological Chemistry. 282, 18945-18952 (2007).
  46. Jin, J., et al. Catsper3 and Catsper4 are essential for sperm hyperactivated motility and male fertility in the mouse. Biology of Reproduction. 77, 37-44 (2007).
  47. Lobley, A., Pierron, V., Reynolds, L., Allen, L., Michalovich, D. Identification of human and mouse CatSper3 and CatSper4 genes: characterisation of a common interaction domain and evidence for expression in testis. Reproductive Biology and Endocrinology. 1, 53(2003).
  48. Mundt, N., Spehr, M., Lishko, P. V. TRPV4 is the temperature-sensitive ion channel of human sperm. eLife. 7, 35853(2018).
  49. Zeng, X. H., Yang, C., Xia, X. M., Liu, M., Lingle, C. J. SLO3 auxiliary subunit LRRC52 controls gating of sperm KSPER currents and is critical for normal fertility. Proceedings of the National Academy Science U. S. A. 112, 2599-2604 (2015).
  50. Mansell, S. A., Publicover, S. J., Barratt, C. L., Wilson, S. M. Patch clamp studies of human sperm under physiological ionic conditions reveal three functionally and pharmacologically distinct cation channels. Molecular Human Reprodroduction. 20, 392-408 (2014).
  51. Lishko, P. V., Botchkina, I. L., Fedorenko, A., Kirichok, Y. Acid extrusion from human spermatozoa is mediated by flagellar voltage-gated proton channel. Cell. 140, 327-337 (2010).
  52. Miller, M. R., et al. Unconventional endocannabinoid signaling governs sperm activation via the sex hormone progesterone. Science. 352, 555-559 (2016).
  53. Brenker, C., et al. The Ca2+-activated K+ current of human sperm is mediated by Slo3. eLife. 3, 01438(2014).
  54. Orta, G., et al. Human spermatozoa possess a calcium-dependent chloride channel that may participate in the acrosomal reaction. Journal of Physiology. 590, 2659-2675 (2012).
  55. Kirichok, Y., Lishko, P. V. Rediscovering sperm ion channels with the patch-clamp technique. Molecular Human Reproduction. 17, 478-499 (2011).
  56. Miller, M. R., et al. Asymmetrically positioned flagellar control units regulate human sperm rotation. Cell Reports. 24, 2606-2613 (2018).
  57. Espinosa, F., et al. Mouse sperm patch-clamp recordings reveal single Cl- channels sensitive to niflumic acid, a blocker of the sperm acrosome reaction. FEBS Letters. 426, 47-51 (1998).
  58. Gu, Y., Kirkman-Brown, J. C., Korchev, Y., Barratt, C. L., Publicover, S. J. Multi-state, 4-aminopyridine-sensitive ion channels in human spermatozoa. Developmental Biology. 274, 308-317 (2004).
  59. Jimenez-Gonzalez, M. C., Gu, Y., Kirkman-Brown, J., Barratt, C. L., Publicover, S. Patch-clamp 'mapping' of ion channel activity in human sperm reveals regionalisation and co-localisation into mixed clusters. Journal of Cell Physiology. 213, 801-808 (2007).
  60. Khasin, L. G., et al. The impact of di-2-ethylhexyl phthalate on sperm fertility. Frontiers in Cell and Developmental Biology. 8, 426(2020).
  61. Tavares, R. S., et al. p,p'-DDE activates CatSper and compromises human sperm function at environmentally relevant concentrations. Human Reproduction. 28, 3167-3177 (2013).
  62. Schiffer, C., et al. Direct action of endocrine disrupting chemicals on human sperm. EMBO Reports. 15, 758-765 (2014).
  63. Skinner, W. M., Mannowetz, N., Lishko, P. V., Roan, N. R. Single-cell motility analysis of tethered human spermatozoa. Bio-Protocols. 9, 5(2019).
  64. World Health Organization. World Health Organization Laboratory Manual for the Examination and Processing of Human Semen. 5th edn. , (2010).
  65. Mannowetz, N., Naidoo, N. M., Choo, S. A., Smith, J. F., Lishko, P. V. Slo1 is the principal potassium channel of human spermatozoa. eLife. 2, 01009(2013).
  66. Miller, M. R., Mansell, S. A., Meyers, S. A., Lishko, P. V. Flagellar ion channels of sperm: similarities and differences between species. Cell Calcium. 58, 105-113 (2015).
  67. Berger, T. K., et al. Post-translational cleavage of Hv1 in human sperm tunes pH- and voltage-dependent gating. Journal Physiology. 595, 1533-1546 (2017).
  68. Chavez, J. C., et al. SLO3 K+ channels control calcium entry through CATSPER channels insperm. Journal Biological Chemistry. 289 (46), 32266-32275 (2014).
  69. Wennemuth, G., Babcock, D. F., Hille, B. Calcium clearance mechanisms of mouse sperm. The Journal of General Physiology. 122, 115-128 (2003).
  70. de Wagenaar, B., et al. Spermometer: electrical characterization of single boar sperm motility. Fertility and Sterility. , (2016).
  71. Satake, N., Elliott, R. M., Watson, P. F., Holt, W. V. Sperm selection and competition in pigs may be mediated by the differential motility activation and suppression of sperm subpopulations within the oviduct. The Journal of Experimental Biology. 209, 1560-1572 (2006).
  72. Dostal, L. A., Faber, C. K., Zandee, J. Sperm motion parameters in vas deferens and cauda epididymal rat sperm. Reproductive Toxicology. 10, 231-235 (1996).
  73. Umehara, T., et al. The acceleration of reproductive aging in Nrg1(flox/flox); Cyp19-Cre female mice. Aging Cell. 16, 1288-1299 (2017).
  74. Florman, H. M., Tombes, R. M., First, N. L., Babcock, D. F. An adhesion-associated agonist from the zona pellucida activates G protein-promoted elevations of internal Ca2+ and pH that mediate mammalian sperm acrosomal exocytosis. Developmental Biology. 135, 133-146 (1989).
  75. Carlson, A. E., Hille, B., Babcock, D. F. External Ca2+ acts upstream of adenylyl cyclase SACY in the bicarbonate signaled activation of sperm motility. Developmental Biology. 312, 183-192 (2007).
  76. Cook, S. P., Babcock, D. F. Activation of Ca2+ permeability by cAMP is coordinated through the pHi increase induced by speract. Journal of Biological Chemistry. 268, 22408-22413 (1993).
  77. Babcock, D. F., Pfeiffer, D. R. Independent elevation of cytosolic [Ca2+] and pH of mammalian sperm by voltage-dependent and pH-sensitive mechanisms. Journal of Biological Chemistry. 262, 15041-15047 (1987).
  78. Rehfeld, A., et al. Medium-throughput screening assays for assessment of effects on Ca2+-signaling and acrosome reaction in human sperm. Journal of Visualized Experiments. (145), e59212(2019).
  79. Rehfeld, A., et al. Chemical UV filters can affect human sperm function in a progesterone-like manner. Endocrine Connections. 7 (1), 16-25 (2017).
  80. Martins da Silva, S. J., et al. Drug discovery for male subfertility using high-throughput screening: a new approach to an unsolved problem. Human Reproduction. 32, 974-984 (2017).
  81. Alasmari, W., et al. The clinical significance of calcium-signalling pathways mediating human sperm hyperactivation. Human Reproduction. 28, 866-876 (2013).
  82. Jim Rae, R. L. Optimizing your Axopatch 200B setup for low-noise recording. Axobits. 38, (2003).

Herprints en machtigingen

Toestemming aanvragen om de tekst of afbeeldingen van dit JoVE-artikel te hergebruiken

Toestemming aanvragen

Trefwoorden

Sperm patch clampplasmamembraanstromensperma ionkanalenwhole cell recordingCatSper kanaalelektrofysiologische techniekisolatie van spermacellengigaohm sealregistratie van calciumkanalen

Gerelateerde artikelen