Methodenartikel

Whole-Mount Immunofluorescentie kleuring, confocale beeldvorming en 3D-reconstructie van de sinoatriale en atrioventriculaire knoop in de muis

DOI:

10.3791/62058

⸱

22 december 2020

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1University Hospital Munich, Department of Medicine I, Ludwig Maximilians University (LMU) Munich, 2Institute of Surgical Research at the Walter Brendel Center of Experimental Medicine, University Hospital Munich, Ludwig Maximilians University (LMU) Munich, 3German Center for Cardiovascular Research (DZHK), Partner Site Munich, Munich Heart Alliance

In dit artikel

Erratum-melding

Important: There has been an erratum issued for this article. View Erratum Notice

Samenvatting

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

We bieden een stapsgewijs protocol voor immunofluorescentiekleuring van de sinoatriale knoop (SAN) en atrioventriculaire knoop (AVN) in muizenharten.

Samenvatting

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Het elektrische signaal dat fysiologisch wordt gegenereerd door pacemakercellen in de sinoatriale knoop (SAN) wordt geleid door het geleidingssysteem, dat de atrioventriculaire knoop (AVN) omvat, om excitatie en contractie van het hele hart mogelijk te maken. Elke disfunctie van SAN of AVN resulteert in aritmieën, wat wijst op hun fundamentele rol in elektrofysiologie en aritmogenese. Muismodellen worden veel gebruikt in aritmieonderzoek, maar het specifieke onderzoek naar SAN en AVN blijft een uitdaging.

Het SAN bevindt zich op de kruising van de crista terminalis met de superieure vena cava en AVN bevindt zich aan de top van de driehoek van Koch, gevormd door de opening van de coronaire sinus, de tricuspidalis annulus en de pees van Todaro. Vanwege het kleine formaat blijft visualisatie door conventionele histologie echter een uitdaging en het maakt de studie van SAN en AVN binnen hun 3D-omgeving niet mogelijk.

Hier beschrijven we een immunofluorescentiebenadering met volledige mount die de lokale visualisatie van gelabelde muis SAN en AVN mogelijk maakt. Whole-mount immunofluorescentiekleuring is bedoeld voor kleinere delen van weefsel zonder de noodzaak van handmatige secties. Daartoe wordt het muizenhart ontleed, waarbij ongewenst weefsel wordt verwijderd, gevolgd door fixatie, permeabilisatie en blokkering. Cellen van het geleidingssysteem binnen SAN en AVN worden vervolgens gekleurd met een anti-HCN4-antilichaam. Confocale laserscanmicroscopie en beeldverwerking maken differentiatie mogelijk tussen knooppuntcellen en werkende cardiomyocyten en kunnen SAN en AVN duidelijk lokaliseren. Bovendien kunnen extra antilichamen worden gecombineerd om ook andere celtypen te labelen, zoals zenuwvezels.

In vergelijking met conventionele immunohistologie behoudt immunofluorescentiekleuring van de hele montering de anatomische integriteit van het hartgeleidingssysteem, waardoor het onderzoek van AVN mogelijk is; vooral in hun anatomie en interacties met de omringende werkende myocardium en niet-myocytencellen.

Inleiding

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Aritmieën zijn veel voorkomende ziekten die miljoenen mensen treffen en zijn de oorzaak van aanzienlijke morbiditeit en mortaliteit wereldwijd. Ondanks enorme vooruitgang in behandeling en preventie, zoals de ontwikkeling van pacemakers, blijft de behandeling van aritmieën een uitdaging, voornamelijk vanwege de zeer beperkte kennis over onderliggende ziektemechanismen 1,2,3. Een beter begrip van zowel de normale elektrofysiologie als de pathofysiologie van aritmieën kan helpen om in de toekomst nieuwe, innovatieve en causale behandelingsstrategieën te ontwikkelen. Om aritmogenese uitgebreid te bestuderen, is het bovendien belangrijk om het specifieke hartgeleidingssysteem in diermodellen zoals de muis te lokaliseren en te visualiseren, omdat muizen veel worden gebruikt in elektrofysiologisch onderzoek.

De belangrijkste onderdelen van het hartgeleidingssysteem zijn de sinoatriale knoop (SAN), waar de elektrische impuls wordt gegenereerd in gespecialiseerde pacemakercellen, en de atrioventriculaire knoop (AVN), de enige elektrische verbinding tussen de boezems en de ventrikels4. Wanneer de elektrofysiologische eigenschappen van SAN en AVN worden gewijzigd, kunnen aritmieën zoals sick sinus syndroom of atrioventriculaire blok optreden die kunnen leiden tot hemodynamische achteruitgang, syncope en zelfs de dood, en zo de essentiële rol van zowel SAN als AVN in elektrofysiologie en aritmogenese onderstrepen5.

Uitgebreide studies over SAN of AVN vereisen een nauwkeurige lokalisatie en visualisatie van beide structuren, idealiter binnen hun fysiologische omgeving. Vanwege hun kleine omvang en locatie binnen het werkende myocardium, zonder een duidelijke macroscopisch zichtbare structuur vast te stellen, is het bestuderen van de anatomie en elektrofysiologie van SAN en AVN echter een uitdaging. Anatomische oriëntatiepunten kunnen worden gebruikt om ruwweg het gebied te identificeren dat SAN en AVN 6,7,8 bevat. Kortom, SAN bevindt zich in het inter-cavalgebied van het rechter atrium naast de musculaire crista terminalis (CT), AVN bevindt zich in de driehoek van Koch die wordt gevormd door de tricuspidalisklep, het ostium van de coronaire sinus en de pees van Todaro. Tot nu toe werden deze anatomische oriëntatiepunten voornamelijk gebruikt om SAN en AVN als individuele structuren te lokaliseren, te verwijderen en vervolgens te bestuderen (bijvoorbeeld door conventionele histologie). Om de complexe elektrofysiologie van SAN en AVN (bijv. Regulerende effecten van aangrenzende cellen van het werkende myocardium) beter te begrijpen, is het echter noodzakelijk om de geleidingssystemen binnen de fysiologische 3D-omgeving te bestuderen.

Immunofluorescentiekleuring met volledige mount is een methode die wordt gebruikt om anatomische structuren in situ te bestuderen met behoud van de integriteit van het omliggende weefsel9. Gebruikmakend van confocale microscopie- en beeldanalysesoftware, kunnen SAN en AVN worden gevisualiseerd met fluorescerend gelabelde antilichamen die gericht zijn op ionkanalen die specifiek in deze regio's tot expressie komen.

In dit volgende protocol worden de noodzakelijke stappen uitgelegd om een gevestigde kleuringsmethode voor de hele montage uit te voeren voor SAN- en AVN-microscooplokalisatie en -visualisatie. In het bijzonder beschrijft dit protocol hoe (1) SAN en AVN moeten worden gelokaliseerd door anatomische oriëntatiepunten om deze monsters voor te bereiden op kleuring en microscopieanalyse (2) om immunofluorescentiekleuring van de referentiemarkers HCN4 en Cx43 uit te voeren (3) om SAN- en AVN-monsters voor te bereiden voor confocale microscopie (4) om confocale beeldvorming van SAN en AVN uit te voeren. We beschrijven ook hoe dit protocol kan worden aangepast om extra kleuring van omringend werkend myocardium of niet-myocytencellen zoals autonome zenuwvezels op te nemen, wat een grondig onderzoek van het hartgeleidingssysteem in het hart mogelijk maakt.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Dierverzorging en alle experimentele procedures werden uitgevoerd in overeenstemming met de richtlijnen van de Animal Care and Ethics-commissie van de Universiteit van München, en alle procedures die op muizen werden uitgevoerd, werden goedgekeurd door de regering van Beieren, München, Duitsland (ROB-55.2-2532.Vet_02-16-106, ROB-55.2-2532.Vet_02-19-86). C57BL6/J muizen werden gekocht bij Jackson Laboratory.

OPMERKING: Figuur 1 toont de instrumenten die nodig zijn voor het experiment. Figuur 2 toont een illustratie van de grove hartanatomie. Figuur 3 toont de locatie van SAN en AVN in een volwassen muizenhart. Figuur 4 toont het voorbereide monster dat op de confocale microscopie is geladen.

1. Voorbereidingen

  1. Bereid een 4% formaldehyde-oplossing (4% PFA) door 10 ml 16% formaldehyde-oplossing in 30 ml PBS te verdunnen.
  2. Bereid een 15% sucrose-oplossing en 30% sucrose-oplossing door respectievelijk 15 g en 30 g sucrosepoeder op te lossen in 100 ml PBS. Nadat het sucrosepoeder volledig is opgelost, filteert u de oplossing met een spuitfilter van 0,2 μm voordat u deze bij 4 °C bewaart.
  3. Bereid een 3% -4% agarose gel, voeg 3 g of 4 g agarose poeder en 100 ml 1x TAE (verdund uit 50x TAE stock oplossing) toe aan een bekerglas. Plaats het bekerglas op een magneetroerder en kook het tot de agarose volledig is opgelost.
  4. Bereid de snijschaal door voorzichtig 30 ml agarosegel (3%-4%) in een petrischaal met een diameter van 100 mm te gieten. Laat de petrischaal op de bank op kamertemperatuur liggen om af te koelen en uit te harden.
  5. Bereid de blokoplossing en de wasoplossing volgens de recepten in tabel 1. Bereid alle oplossingen voor die op de dag van gebruik zijn bereid. Langdurige opslag wordt niet aanbevolen.
  6. Bereid de antilichaamoplossingen door ze te verdunnen in koude (4 °C) 1x PBS, bescherm de verdunning tegen licht (bijvoorbeeld door aluminiumfolie rond te wikkelen) en bewaar verdunningen op ijs totdat ze worden gebruikt. Verdun de antilichamen kort voor incubatie. Vermijd het achterlaten van de verdunde antilichamen bij kamertemperatuur.
    OPMERKING: De juiste antilichaamverdunning moet worden getest met vergelijkbare weefselmonsters door een conventionele immunofluorescente kleuring uit te voeren. Hier hebben we de antilichamen getest door bevroren secties te kleuren die met een dikte van 10 μm zijn gesneden.

2. Orgaanoogst en weefselvoorbereiding

  1. Verdoof de muis door hem in een incubatiekamer te plaatsen die is aangesloten op een isofluraanverdamper. Stel de vaporizer in om 4-5% isofluraan (respectievelijk 96-95% zuurstof) te leveren.
    OPMERKING: Volledige anesthesie wordt bevestigd door het verlies van de houdingsreactie en de rechtzettingsreflex door de kamer voorzichtig te rollen totdat de muis op zijn rug wordt geplaatst.
  2. Leg de muis in rugligging op de operatietafel. Plaats de muizenneus in een anesthesiemasker dat is aangesloten op een aangepast Bain-circuit met de binnenband aangesloten op de isofluraanverdamper. Om de anesthesie te behouden, gebruikt u 1-2% isofluraan in zuurstof bij een stroomsnelheid van 1 L / min. Ruim overtollige verdovingsdamp van de muis op via de buitenste buis van het masker en trek door een bus actieve kool, die het overtollige verdovingsgas absorbeert.
  3. Wanneer volledige anesthesie is bereikt, injecteert u fentanyl voor analgesie (0,1 μg/25 g lichaamsgewicht i.p.).
  4. Wanneer de teen-knijpreflex niet detecteerbaar is, maak dan een duidelijke snede van het jugulum naar de symfyse met behulp van een irisschaar om vacht en huid te verwijderen. Maak nog een snede van links naar rechts onder de ribben met behulp van een irisschaar om de buik voorzichtig te openen.
  5. Leven de xiphoid een beetje met behulp van gebogen tangen om het diafragma van links naar rechts te snijden zonder organen te verwonden. Knip de ribbenkast aan beide zijden in een mediale oksellijn met een irisschaar om hem craniaal om te draaien en toegang tot het hart mogelijk te maken.
  6. Knip de inferieure vena cava en dalende thoracale aorta ter hoogte van het diafragma met behulp van een irisschaar. Prik het hart door met een naald van 27 G in het gebied van de top en duw de naald vervolgens voorzichtig in de linker ventrikel (LV). Injecteer voorzichtig 5-10 ml ijskoude PBS in de LV om het hart te doordringen.
    OPMERKING: De kleur van het hart moet van rood naar grijs veranderen, wat wijst op een succesvolle perfusie met PBS.
  7. Til de top van het hart voorzichtig op met behulp van een pincet waardoor de grote vaten kunnen worden doorgesneden en het hart kan worden verwijderd.
  8. Snijd het hart weg door de grote slagaders en aderen zo ver mogelijk van het hart af te snijden om schade aan de superieure vena cava (SVC) te voorkomen. Bewaar de SVC omdat deze tijdens de latere verwerking als belangrijk oriëntatiepunt zal dienen.
  9. Schakel na het verwijderen van het hart de isofluraanverdamper uit.
  10. Leg het hart in een dissectieschaal gevuld met ijskoude PBS onder de ontleedmicroscoop. Na bepaling van de linker/rechter en voor/achterkant van het hart, draait u het hart om met de voorkant van het hart aan de onderkant van de schaal (om de grote vaten bloot te leggen die zich achteraan bevinden).
  11. Immobiliseer het hart door kleine pinnen door de top en het linker atriale aanhangsel (LAA) in de agarose aan de onderkant van de dissectieschaal te plaatsen (figuur 2A). Verwijder met behulp van een fijn pincet en een schaar voorzichtig niet-hartweefsel rond de SVC en inferieure vena cava (IVC) (bijv. Longen, vet, pericardium) om het inter-cavaleriegebied bloot te leggen (figuur 3A).
  12. Verwijder het grootste deel van de ventrikels door de groef tussen de ventrikels en de boezems parallel te snijden met de microschaar. Bewaar een klein deel van het ventriculaire weefsel voor de latere belasting van de plexiglas ring.
  13. Voor fixatie en dehydratie, breng het monster (met de atria, SVC en IVC) in 4% PFA 's nachts bij 4 °C.
  14. Breng de volgende dag het hart over op 15% sucrose-oplossing gedurende 24 uur bij 4 °C.
  15. Breng de volgende dag het hart over op 30% sucrose-oplossing gedurende 24 uur bij 4 °C.
    OPMERKING: Voor de fixatie en dehydratatie in stap 2.13, 2.14 en 2.15 worden de monsters bij 4°C gelaten zonder verder te roeren of te schommelen.

3. Immunofluorescentiekleuring met volledige montering

  1. Was het hart in 1% Triton X-100 verdund in PBS en blok en permeabiliseer in blokoplossing (tabel 1) 's nachts bij 4 °C.
  2. Plaats het hart in een buis van 1,5 ml en incubeer met konijnen-antimuis connexine-43 (verdunning van 1:200) en rat anti-muis HCN4 (verdunning van 1:200) antilichamen verdund met blokkerende oplossing gedurende 7 dagen bij 4 °C.
    OPMERKING: De optimale concentratie van primaire antilichamen moet worden getest voordat de datasheets als oriëntatie worden gebruikt. Andere antigenen van belang kunnen ook in deze stap worden gekleurd, zolang de gastheersoort van het primaire antigeen anders is dan de andere. Een hogere concentratie Triton X-100 kan helpen bij het verkrijgen van efficiëntere antilichaamkleuring zoals aangetoond vóór10, maar de concentratie kan individueel worden bepaald.
  3. Verwijder na 7 dagen de oplossing met primaire antilichamen met behulp van een pipet en was het hart 3 keer met 1% Triton X-100-oplossing (telkens gedurende 1 uur bij kamertemperatuur op de orbitale shaker).
  4. Incubeer na het wassen het hart = met Alexa Fluor 488 geitenanti-rat IgG (verdunning van 1:200) en Alexa Fluor 647 geiten anti-konijn IgG (verdunning van 1:200) gedurende 7 dagen bij 4 °C.
  5. Verwijder na 7 dagen alle oplossing die de secundaire antilichamen bevat met behulp van een pipet. Was vervolgens het hart met een wasoplossing (tabel 1) 3 keer (telkens gedurende 1 uur bij kamertemperatuur op de orbitale shaker).
  6. Om kernen te kleuren, incubeer het hart in DAPI-oplossing (10 μg / ml) 's nachts bij 4 °C.
  7. Was het hart de volgende dag 3 keer met wasoplossing (telkens gedurende 1 uur bij kamertemperatuur op de orbitale shaker).
    OPMERKING: Voor de blokkering, permeabilisatie, incubatie van antilichamen en DAPI-kleuring in stap 3.1, 3.2, 3.4 en 3.6, laat de monsters op steady state in de 4 °C, er hoeft niet te worden geroerd. Het gekleurde weefsel kon volledig worden bewaard met wasoplossing bij 4 °C en gedurende enkele dagen worden beschermd tegen licht totdat het in beeld werd gebracht met de confocale microscoop.

4. Confocale microscopie

  1. Plexiglas ringen bereiden en vullen met plasticine (figuur 1). In het midden van de plasticine wordt een kleine groef gevormd in het midden voor het laden van het hart. Maak een ondiepe groef, omdat dit gemakkelijker zou zijn om een plat beeldvlak te verkrijgen, en om de ruimte aan te passen en luchtbellen tussen het monster en de coverslips in stap 4.4 te voorkomen.
  2. Gebruik hetzelfde hartmonster voor de beeldvorming van zowel SAN als AVN sequentieel. Voor SAN-beeldvorming laadt u het hart rechtstreeks, terwijl u voor AVN-beeldvorming eerder microdissectie uitvoert.
    1. SAN-beeldvorming
      1. Identificeer het SAN aan de hand van anatomische oriëntatiepunten: het bevindt zich aan de dorsale kant van het hart in het inter-cavalgebied (het gebied tussen de superieure en inferieure vena cava). De crista terminalis (CT) is de spierstreak tussen het SAN en RAA.
      2. Plaats het hart in de plasticinegroef met de achterkant van het hart naar boven gericht. Voeg PBS toe aan het hart om alle lucht in de holte te verplaatsen totdat het hart volledig bedekt is met PBS (meestal zijn een paar druppels PBS voldoende).
      3. Druk onder de dissectiemicroscoop voorzichtig de RAA, LAA en de resterende delen van de linker ventrikel in de plasticine om het hart te fixeren. Zorg ervoor dat de hele inter-caval regio en de crista terminalis duidelijk zichtbaar waren (niet bedekt door plasticine). Het gebied dat in beeld wordt gebracht, wordt weergegeven in figuur 3A.
    2. AVN-beeldvorming
      1. Nadat u de beeldvorming van SAN hebt voltooid, herinnert u hetzelfde monster en gebruikt u het vervolgens voor de AVN-beeldvorming. Plaats voor AVN-microdissectie het hart = op een dissectieschaal onder de dissectiemicroscoop.
      2. Oriënteer het hart met de rechterkant naar boven gericht (inclusief de resterende delen van de rechter ventrikel). Steek pennen door het resterende deel van de LV-vrije wand (die nu aan de onderkant zit) om het weefsel te immobiliseren (figuur 2B).
      3. Snijd de resterende RV-vrije wand naar boven door de tricuspidalisklep en superieure vena cava. Draai vervolgens de RV en RA weg om het interventriculaire en interatriale septum bloot te leggen. (Figuur 3B)
        OPMERKING: Let op dat u de coronaire sinus (CS) niet beschadigt, omdat het een belangrijk anatomisch oriëntatiepunt is om de driehoek van Koch te vinden die vervolgens de AVN kan lokaliseren. De CS loopt dwars in de linker atrioventriculaire groef aan de achterste kant van het hart, en de CS-opening bevindt zich tussen IVC en de tricuspidalisklep op het inferieure deel van het interatriale septum (figuur 3A en B).
      4. Identificeer de driehoek van Koch die te vinden is op het endocardiale oppervlak van het rechter atrium, vooraan begrensd door de scharnierlijn van de septumfolder van de tricuspidalisklep (TV), en achterstevoren door de pees van Todaro. De basis wordt gevormd door de opening van de coronaire sinus (figuur 3B). Aangezien dit het doelgebied is voor AVN-beeldvorming, moet het duidelijk zichtbaar zijn.
      5. Breng het hart over in de plasticinegroef in de plexiglas ring met de driehoek van Koch duidelijk bloot (d.w.z. niet bedekt met plasticine). Druk het weefsel rond de Koch-driehoek voorzichtig in de plasticine om het monster te fixeren. Voeg PBS toe aan het hart om alle lucht in de holte te verplaatsen totdat het hart volledig bedekt is met PBS (meestal zijn een paar druppels PBS voldoende).
  3. Breng siliconen aan op de randen van de plexiglas ringen om de harten die in de met plasticine gevulde plexiglas ringen zijn geladen, te kunnen bedekken met afdekslips.
  4. Druk voorzichtig op de achterkant van de plasticine om delen van de PBS eruit te persen en het hart aan de coverslip te bevestigen terwijl luchtbellen in het beeldgebied worden vermeden.
    OPMERKING: Zorg ervoor dat de interessante gebieden niet worden gevouwen en bedekt tijdens het indrukken van de achterkant van de plasticine. Een plat beeldvormingsvlak zonder monsterovercompressie is noodzakelijk voor het behoud van de anatomie en voor een goede confocale beeldvorming van de monsters. Voor SAN is het belangrijk om ervoor te zorgen dat de inter-caval regio duidelijk wordt blootgesteld. Voor AVN moet de driehoek van Koch volledig worden blootgelegd.
  5. Leg de kleuringsmonsters van de hele montage ondersteboven op het platform van de confocale microscoop. De blootgestelde SAN/AVN die aan de afdekslip is bevestigd, bevindt zich nu aan de onderkant van het microscoopplatform (figuur 4).
    OPMERKING: Om foto's te maken, gebruiken we de Carl Zeiss LSM800 met Airyscan Unit en de software ZEN 2.3 SP1 zwart.
  6. Kies plaat "BP420-480 + LP605" voor de excitatie van Alexa Fluor 647 geconjugeerde anti-HCN4. Varieer de master gain van 650-750.
  7. Maak een overzichtsafbeelding van het hele SAN- en AVN-gebied met behulp van de tile scan-functie . Selecteer vervolgens het HCN4-positieve gebied door op de overzichtsafbeelding te klikken en een vierkant toe te voegen rond het interessegebied dat wordt gescand.
  8. Controleer de parameters, inclusief platen en master gain voor de resterende kanalen (Alexa Fluor 488 en DAPI) van de confocale microscoop en stel in zoals beschreven in stap 4.6.
  9. Pas de focus langzaam aan van boven naar beneden van het voorbeeld om een voorbeeld van het hele voorbeeld te bekijken en het bereik Eerste en Laatste in te stellen voor het Z-stackbereik. Stel een optimaal interval in voor de Z-stack op basis van de dikte van het optische monster. We gebruiken een 20x objectief en 0,8-1 μm als interval voor Z-stack.
  10. Nadat alle parameters correct zijn ingesteld, scant u het hele gebied van het SAN en AVN.
  11. Voer een 3D-reconstructie van de afbeeldingen uit met behulp van software (bijv. Imaris versie 8.4.2).
    1. Selecteer Beeldverwerking | Baseline Aftrekken om achtergrondvlekken te verwijderen.
    2. Selecteer het maken van oppervlakken op de instelling voor het geselecteerde kanaal en de regio die van belang is voor verwerking.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Resultaten

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Door gebruik te maken van het hierboven beschreven protocol kan confocale microscopie beeldvorming van zowel SAN als AVN betrouwbaar worden uitgevoerd. Specifieke kleuring van het geleidingssysteem met behulp van fluorescerende antilichamen gericht op HCN4 en kleuring van het werkende myocardium met behulp van fluorescerende antilichamen gericht op Cx43 maakt de duidelijke identificatie van SAN (figuur 5, video 1) en AVN (

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Discussie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Cardiale anatomie is van oudsher bestudeerd met behulp van dunne histologische secties11. Deze methoden behouden echter niet de driedimensionale structuur van het geleidingssysteem en bieden dus alleen 2D-informatie. Het hier beschreven immunofluorescentiekleuringsprotocol met volledige mount maakt het mogelijk om deze beperkingen te overwinnen en kan routinematig worden gebruikt voor SAN- en AVN-beeldvorming.

In vergelijking met standaardmethoden zoals conventionele im...

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Openbaarmakingen

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

De auteurs verklaren dat ze geen belangenconflicten hebben.

Dankbetuigingen

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Dit werk werd ondersteund door de China Scholarship Council (CSC, aan R. Xia), het Duitse Centrum voor Cardiovasculair Onderzoek (DZHK; 81X2600255 aan S. Clauss, 81Z0600206 aan S. Kääb), de Corona Foundation (S199/10079/2019 aan S. Clauss), de SFB 914 (project Z01 tot H. Ishikawa-Ankerhold en S. Massberg en project A10 tot C. Schulz), het ERA-NET over hart- en vaatziekten (ERA-CVD; 01KL1910 aan S. Clauss) en de Heinrich-en-Lotte-Mühlfenzl Stiftung (aan S. Clauss). De financiers hadden geen rol in de voorbereiding van het manuscript.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel
NaamBedrijfCatalogusnummerOpmerkingen
Anesthesie
Isofluraannevelsysteem Hugo Sachs Elektronik34-0458, 34-1030, 73-4911, 34-0415, 73-4910Omvat een inductiekamer, een gasafvoereenheid en koolstoffilters
Gemodificeerde Bain-circuitHugo Sachs Elektronik73-4860Omvat een anesthesiemasker voor muizen
Chirurgische platformKent ScientificSURGI-M
In vivo instrumentatie
Fijne pincettenFine Science Tools11295-51
IrisschaarFine Science Tools14084-08
VerenschaarFine Science Tools91500-09
WeefselpincetFine Science Tools11051-10
WeefselpennenFine Science Tools26007-01Kan 27G-naalden als vervanger gebruiken
Algemeen labinstrument
Orbitale shakerSunlabD-8040
MagneetroerderIKA RH basic
Pipet, volume 10 µL, 100 µL, 1000 µLEppendorfZ683884-1EA
Microscopen
Dissectie stereo- zoommicroscoop VWR10836-004
Laser Scanning Confocal microscoopZeissLSM 800
Software
Imaris 8.4.2Oxford instruments
ZEN 2.3 SP1 zwartZeiss
Algemeen labmateriaal
0,2 µm spuitfilterSartorius17597
100 mm petrischaalFalcon351029
27G naaldBD Microlance 3300635
50 ml Polypropyleen kegelbuisFalcon352070
5 ml spuitBraun4606108V
DekglasjesThermo Scientific7632160
EppendorfbuisjesEppendorf30121872
Chemicaliën
0,5 M EDTASigma20-158Componenten van TEA
16% Formaldehyde-oplossingThermo Scientific 28908Gebruik als een 4% oplossing 
AzijnzuurMerck100063Componenten van TEA
AgaroseBiozym850070
Bovine Serum AlbumineSigmaA2153-100G
DPBS (1X) Dulbecco's Phosphate Buffered SalineGibco14190-094
Normaal geitenserumSigmaNS02L
SucroseSigmaS1888-1kg
Tris-baseRocheTRIS-ROComponenten van TEA
Triton X-100SigmaT8787-250mlVerdund tot 1% in PBS
Tween 20SigmaP2287-500ml
Geneesmiddelen
Fentanyl 0,5 mg/10 mLBraun Melsungen
Isofluraan 1 mL/mLCp-pharma31303
Zuurstof 5 LLinde2020175Omvat een drukregeling
Antilichamen
Geit anti-Konijn IgG Alexa Fluor 488 Cell Signaling Technology#4412verdund tot 1:200
Geit anti-Rat IgG Alexa Fluor 647Invitrogen#A-21247verdund tot 1:200
Hoechst 33342, Trihydrochloride, Trihydraat (DAPI)InvitrogenH3570verdund tot 1:1000
Konijn Anti-Connexin-43SigmaC6219verdund tot 1:200
Rat anti-HCN4 (SHG 1E5)InvitrogenMA3-903verdund tot 1:200
Anders
PlexiglasringZelf ontworpen en 3D geprint
PlasticineCernit49655005
Silikonpasten, BaysiloneVWR291-1220
Dieren
Muis, C57BL/6The Jackson Laboratory

Referenties

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Clauss, S., et al. Animal models of arrhythmia: classic electrophysiology to genetically modified large animals. Nature Reviews Cardiology. 16 (8), 457-475 (2019).
  2. Clauss, S., et al. Characterization of a porcine model of atrial arrhythmogenicity in the context of ischaemic heart failure. PLoS One. 15 (5), 0232374(2020).
  3. Schuttler, D., et al. Animal Models of Atrial Fibrillation. Circulation Research. 127 (1), 91-110 (2020).
  4. van Weerd, J. H., Christoffels, V. M. The formation and function of the cardiac conduction system. Development. 143 (2), 197-210 (2016).
  5. Vogler, J., Breithardt, G., Eckardt, L. Bradyarrhythmias and Conduction Blocks. Revista Española de Cardiología (English Edition. 65 (7), 656-667 (2012).
  6. Wen, Y., Li, B. Morphology of mouse sinoatrial node and its expression of NF-160 and HCN4. International Journal of Clinical and Experimental Medicine. 8 (8), 13383-13387 (2015).
  7. Verheijck, E. E., et al. Electrophysiological features of the mouse sinoatrial node in relation to connexin distribution. Cardiovascular Research. 52 (1), 40-50 (2001).
  8. Glukhov, A. V., Fedorov, V. V., Anderson, M. E., Mohler, P. J., Efimov, I. R. Functional anatomy of the murine sinus node: high-resolution optical mapping of ankyrin-B heterozygous mice. American Journal of Physiology Heart and Circulatory Physiology. 299 (2), H482-H491 (2010).
  9. Sillitoe, R. V., Hawkes, R. Whole-mount immunohistochemistry: a high-throughput screen for patterning defects in the mouse cerebellum. Journal of Histochemistry and Cytochemistry. 50 (2), 235-244 (2002).
  10. Hulsmans, M., et al. Macrophages Facilitate Electrical Conduction in the Heart. Cell. 169 (3), 510-522 (2017).
  11. Liu, J., Dobrzynski, H., Yanni, J., Boyett, M. R., Lei, M. Organisation of the mouse sinoatrial node: structure and expression of HCN channels. Cardiovascular Research. 73 (4), 729-738 (2007).
  12. Muller-Taubenberger, A. Application of fluorescent protein tags as reporters in live-cell imaging studies. Methods Mol Biol. 346, 229-246 (2006).
  13. Müller-Taubenberger, A., Ishikawa-Ankerhold, H. C. Dictyostelium discoideum Protocol. Eichinger, L., Rivero, F. , Humana Press. 93-112 (2013).
  14. Shaw, P. J. Handbook Of Biological Confocal Microscopy. Pawley, J. B. , Springer US. 453-467 (2006).
  15. Huff, J. The Airyscan detector from ZEISS: confocal imaging with improved signal-to-noise ratio and super-resolution. Nature Methods. 12 (12), (2015).
  16. Rysevaite, K., et al. Immunohistochemical characterization of the intrinsic cardiac neural plexus in whole-mount mouse heart preparations. Heart Rhythm. 8 (5), 731-738 (2011).
  17. Acar, M., et al. Deep imaging of bone marrow shows non-dividing stem cells are mainly perisinusoidal. Nature. 526 (7571), 126-130 (2015).
  18. Brahmajothi, M. V., Morales, M. J., Campbell, D. L., Steenbergen, C., Strauss, H. C. Expression and distribution of voltage-gated ion channels in ferret sinoatrial node. Physiological Genomics. 42 (2), 131-140 (2010).
  19. Mesirca, P., et al. Cardiac arrhythmia induced by genetic silencing of 'funny' (f) channels is rescued by GIRK4 inactivation. Nature Communication. 5, 4664(2014).
  20. Liang, X., et al. HCN4 dynamically marks the first heart field and conduction system precursors. Circulation Research. 113 (4), 399-407 (2013).
  21. Verheule, S., Kaese, S. Connexin diversity in the heart: insights from transgenic mouse models. Frontiers in Pharmacology. 4, 81(2013).
  22. van der Velden, H. Cardiac gap junctions and connexins: their role in atrial fibrillation and potential as therapeutic targets. Cardiovascular Research. 54 (2), 270-279 (2002).

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Herprints en machtigingen

Toestemming aanvragen om de tekst of afbeeldingen van dit JoVE-artikel te hergebruiken

Toestemming aanvragen

Erratum

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Formal Correction: Erratum: Whole-Mount Immunofluorescence Staining, Confocal Imaging and 3D Reconstruction of the Sinoatrial and Atrioventricular Node in the Mouse
Posted by JoVE Editors on 2/21/2023. Citeable Link.

An erratum was issued for: Whole-Mount Immunofluorescence Staining, Confocal Imaging and 3D Reconstruction of the Sinoatrial and Atrioventricular Node in the Mouse. The Authors section was updated from:

Ruibing Xia1,2,3
Julia Vlcek1,2
Julia Bauer1,2,3
Stefan Kääb1,3
Hellen Ishikawa-Ankerhold1,2
Dominic Adam van den Heuvel1,2
Christian Schulz1,2,3
Steffen Massberg1,2,3
Sebastian Clauss1,2,3
1University Hospital Munich, Department of Medicine I, Ludwig Maximilian University Munich
2Walter Brendel Center of Experimental Medicine, Ludwig Maximilian University Munich
3German Center for Cardiovascular Research (DZHK), Partner Site Munich, Munich Heart Alliance

to:

Ruibing Xia1,2,3
Julia Vlcek1,2
Julia Bauer1,2,3
Stefan Kääb1,3
Hellen Ishikawa-Ankerhold1,2
Dominic Adam van den Heuvel1,2
Christian Schulz1,2,3
Steffen Massberg1,2,3
Sebastian Clauss1,2,3
1University Hospital Munich, Department of Medicine I, Ludwig Maximilians University (LMU) Munich
2Institute of Surgical Research at the Walter Brendel Center of Experimental Medicine, University Hospital Munich, Ludwig Maximilians University (LMU) Munich
3German Center for Cardiovascular Research (DZHK), Partner Site Munich, Munich Heart Alliance

Trefwoorden

3D reconstructiesinoatriale knoopmuizenhartcardiaal geleidingssysteemHCN4 antilichaamconnexine 43fluorescerende antilichamen

Gerelateerde artikelen