We bieden een stapsgewijs protocol voor immunofluorescentiekleuring van de sinoatriale knoop (SAN) en atrioventriculaire knoop (AVN) in muizenharten.
Een abonnement op JoVE is vereist om deze inhoud te bekijken. Log in of start vandaag met uw gratis proefperiode.
Methodenartikel
Whole-Mount Immunofluorescentie kleuring, confocale beeldvorming en 3D-reconstructie van de sinoatriale en atrioventriculaire knoop in de muis
In dit artikel
Erratum-melding
Important: There has been an erratum issued for this article. View Erratum Notice
Samenvatting
Samenvatting
Het elektrische signaal dat fysiologisch wordt gegenereerd door pacemakercellen in de sinoatriale knoop (SAN) wordt geleid door het geleidingssysteem, dat de atrioventriculaire knoop (AVN) omvat, om excitatie en contractie van het hele hart mogelijk te maken. Elke disfunctie van SAN of AVN resulteert in aritmieën, wat wijst op hun fundamentele rol in elektrofysiologie en aritmogenese. Muismodellen worden veel gebruikt in aritmieonderzoek, maar het specifieke onderzoek naar SAN en AVN blijft een uitdaging.
Het SAN bevindt zich op de kruising van de crista terminalis met de superieure vena cava en AVN bevindt zich aan de top van de driehoek van Koch, gevormd door de opening van de coronaire sinus, de tricuspidalis annulus en de pees van Todaro. Vanwege het kleine formaat blijft visualisatie door conventionele histologie echter een uitdaging en het maakt de studie van SAN en AVN binnen hun 3D-omgeving niet mogelijk.
Hier beschrijven we een immunofluorescentiebenadering met volledige mount die de lokale visualisatie van gelabelde muis SAN en AVN mogelijk maakt. Whole-mount immunofluorescentiekleuring is bedoeld voor kleinere delen van weefsel zonder de noodzaak van handmatige secties. Daartoe wordt het muizenhart ontleed, waarbij ongewenst weefsel wordt verwijderd, gevolgd door fixatie, permeabilisatie en blokkering. Cellen van het geleidingssysteem binnen SAN en AVN worden vervolgens gekleurd met een anti-HCN4-antilichaam. Confocale laserscanmicroscopie en beeldverwerking maken differentiatie mogelijk tussen knooppuntcellen en werkende cardiomyocyten en kunnen SAN en AVN duidelijk lokaliseren. Bovendien kunnen extra antilichamen worden gecombineerd om ook andere celtypen te labelen, zoals zenuwvezels.
In vergelijking met conventionele immunohistologie behoudt immunofluorescentiekleuring van de hele montering de anatomische integriteit van het hartgeleidingssysteem, waardoor het onderzoek van AVN mogelijk is; vooral in hun anatomie en interacties met de omringende werkende myocardium en niet-myocytencellen.
Inleiding
Aritmieën zijn veel voorkomende ziekten die miljoenen mensen treffen en zijn de oorzaak van aanzienlijke morbiditeit en mortaliteit wereldwijd. Ondanks enorme vooruitgang in behandeling en preventie, zoals de ontwikkeling van pacemakers, blijft de behandeling van aritmieën een uitdaging, voornamelijk vanwege de zeer beperkte kennis over onderliggende ziektemechanismen 1,2,3. Een beter begrip van zowel de normale elektrofysiologie als de pathofysiologie van aritmieën kan helpen om in de toekomst nieuwe, innovatieve en causale behandelingsstrategieën te ontwikkelen. Om aritmoge....
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Protocol
Dierverzorging en alle experimentele procedures werden uitgevoerd in overeenstemming met de richtlijnen van de Animal Care and Ethics-commissie van de Universiteit van München, en alle procedures die op muizen werden uitgevoerd, werden goedgekeurd door de regering van Beieren, München, Duitsland (ROB-55.2-2532.Vet_02-16-106, ROB-55.2-2532.Vet_02-19-86). C57BL6/J muizen werden gekocht bij Jackson Laboratory.
OPMERKING: Figuur 1 toont de instrumenten die nodig zijn voor het experiment. Figuur 2 toont een illustratie van de grove harta....
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Resultaten
Door gebruik te maken van het hierboven beschreven protocol kan confocale microscopie beeldvorming van zowel SAN als AVN betrouwbaar worden uitgevoerd. Specifieke kleuring van het geleidingssysteem met behulp van fluorescerende antilichamen gericht op HCN4 en kleuring van het werkende myocardium met behulp van fluorescerende antilichamen gericht op Cx43 maakt de duidelijke identificatie van SAN (figuur 5, video 1) en AVN (
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Discussie
Cardiale anatomie is van oudsher bestudeerd met behulp van dunne histologische secties11. Deze methoden behouden echter niet de driedimensionale structuur van het geleidingssysteem en bieden dus alleen 2D-informatie. Het hier beschreven immunofluorescentiekleuringsprotocol met volledige mount maakt het mogelijk om deze beperkingen te overwinnen en kan routinematig worden gebruikt voor SAN- en AVN-beeldvorming.
In vergelijking met standaardmethoden zoals conventionele im.......
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Openbaarmakingen
De auteurs verklaren dat ze geen belangenconflicten hebben.
Dankbetuigingen
Dit werk werd ondersteund door de China Scholarship Council (CSC, aan R. Xia), het Duitse Centrum voor Cardiovasculair Onderzoek (DZHK; 81X2600255 aan S. Clauss, 81Z0600206 aan S. Kääb), de Corona Foundation (S199/10079/2019 aan S. Clauss), de SFB 914 (project Z01 tot H. Ishikawa-Ankerhold en S. Massberg en project A10 tot C. Schulz), het ERA-NET over hart- en vaatziekten (ERA-CVD; 01KL1910 aan S. Clauss) en de Heinrich-en-Lotte-Mühlfenzl Stiftung (aan S. Clauss). De financiers hadden geen rol in de voorbereiding van het manuscript.
....Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Materialen
| Naam | Bedrijf | Catalogusnummer | Opmerkingen |
|---|---|---|---|
| Anesthesie | |||
| Isofluraannevelsysteem | Hugo Sachs Elektronik | 34-0458, 34-1030, 73-4911, 34-0415, 73-4910 | Omvat een inductiekamer, een gasafvoereenheid en koolstoffilters |
| Gemodificeerde Bain-circuit | Hugo Sachs Elektronik | 73-4860 | Omvat een anesthesiemasker voor muizen |
| Chirurgische platform | Kent Scientific | SURGI-M | |
| In vivo instrumentatie | |||
| Fijne pincetten | Fine Science Tools | 11295-51 | |
| Irisschaar | Fine Science Tools | 14084-08 | |
| Verenschaar | Fine Science Tools | 91500-09 | |
| Weefselpincet | Fine Science Tools | 11051-10 | |
| Weefselpennen | Fine Science Tools | 26007-01 | Kan 27G-naalden als vervanger gebruiken |
| Algemeen labinstrument | |||
| Orbitale shaker | Sunlab | D-8040 | |
| Magneetroerder | IKA | RH basic | |
| Pipet, volume 10 µL, 100 µL, 1000 µL | Eppendorf | Z683884-1EA | |
| Microscopen | |||
| Dissectie stereo- zoommicroscoop | VWR | 10836-004 | |
| Laser Scanning Confocal microscoop | Zeiss | LSM 800 | |
| Software | |||
| Imaris 8.4.2 | Oxford instruments | ||
| ZEN 2.3 SP1 zwart | Zeiss | ||
| Algemeen labmateriaal | |||
| 0,2 µm spuitfilter | Sartorius | 17597 | |
| 100 mm petrischaal | Falcon | 351029 | |
| 27G naald | BD Microlance 3 | 300635 | |
| 50 ml Polypropyleen kegelbuis | Falcon | 352070 | |
| 5 ml spuit | Braun | 4606108V | |
| Dekglasjes | Thermo Scientific | 7632160 | |
| Eppendorfbuisjes | Eppendorf | 30121872 | |
| Chemicaliën | |||
| 0,5 M EDTA | Sigma | 20-158 | Componenten van TEA |
| 16% Formaldehyde-oplossing | Thermo Scientific | 28908 | Gebruik als een 4% oplossing |
| Azijnzuur | Merck | 100063 | Componenten van TEA |
| Agarose | Biozym | 850070 | |
| Bovine Serum Albumine | Sigma | A2153-100G | |
| DPBS (1X) Dulbecco's Phosphate Buffered Saline | Gibco | 14190-094 | |
| Normaal geitenserum | Sigma | NS02L | |
| Sucrose | Sigma | S1888-1kg | |
| Tris-base | Roche | TRIS-RO | Componenten van TEA |
| Triton X-100 | Sigma | T8787-250ml | Verdund tot 1% in PBS |
| Tween 20 | Sigma | P2287-500ml | |
| Geneesmiddelen | |||
| Fentanyl 0,5 mg/10 mL | Braun Melsungen | ||
| Isofluraan 1 mL/mL | Cp-pharma | 31303 | |
| Zuurstof 5 L | Linde | 2020175 | Omvat een drukregeling |
| Antilichamen | |||
| Geit anti-Konijn IgG Alexa Fluor 488 | Cell Signaling Technology | #4412 | verdund tot 1:200 |
| Geit anti-Rat IgG Alexa Fluor 647 | Invitrogen | #A-21247 | verdund tot 1:200 |
| Hoechst 33342, Trihydrochloride, Trihydraat (DAPI) | Invitrogen | H3570 | verdund tot 1:1000 |
| Konijn Anti-Connexin-43 | Sigma | C6219 | verdund tot 1:200 |
| Rat anti-HCN4 (SHG 1E5) | Invitrogen | MA3-903 | verdund tot 1:200 |
| Anders | |||
| Plexiglasring | Zelf ontworpen en 3D geprint | ||
| Plasticine | Cernit | 49655005 | |
| Silikonpasten, Baysilone | VWR | 291-1220 | |
| Dieren | |||
| Muis, C57BL/6 | The Jackson Laboratory |
Referenties
- Clauss, S., et al. Animal models of arrhythmia: classic electrophysiology to genetically modified large animals. Nature Reviews Cardiology. 16 (8), 457-475 (2019).
- Clauss, S., et al. Characte....
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Herprints en machtigingen
Erratum
Formal Correction: Erratum: Whole-Mount Immunofluorescence Staining, Confocal Imaging and 3D Reconstruction of the Sinoatrial and Atrioventricular Node in the Mouse
Posted by JoVE Editors on 2/21/2023. Citeable Link.
An erratum was issued for: Whole-Mount Immunofluorescence Staining, Confocal Imaging and 3D Reconstruction of the Sinoatrial and Atrioventricular Node in the Mouse. The Authors section was updated from:
Ruibing Xia1,2,3
Julia Vlcek1,2
Julia Bauer1,2,3
Stefan Kääb1,3
Hellen Ishikawa-Ankerhold1,2
Dominic Adam van den Heuvel1,2
Christian Schulz1,2,3
Steffen Massberg1,2,3
Sebastian Clauss1,2,3
1University Hospital Munich, Department of Medicine I, Ludwig Maximilian University Munich
2Walter Brendel Center of Experimental Medicine, Ludwig Maximilian University Munich
3German Center for Cardiovascular Research (DZHK), Partner Site Munich, Munich Heart Alliance
to:
Ruibing Xia1,2,3
Julia Vlcek1,2
Julia Bauer1,2,3
Stefan Kääb1,3
Hellen Ishikawa-Ankerhold1,2
Dominic Adam van den Heuvel1,2
Christian Schulz1,2,3
Steffen Massberg1,2,3
Sebastian Clauss1,2,3
1University Hospital Munich, Department of Medicine I, Ludwig Maximilians University (LMU) Munich
2Institute of Surgical Research at the Walter Brendel Center of Experimental Medicine, University Hospital Munich, Ludwig Maximilians University (LMU) Munich
3German Center for Cardiovascular Research (DZHK), Partner Site Munich, Munich Heart Alliance
