Methodenartikel

Een economisch en veelzijdig eiwitzuiveringssysteem met hoge doorvoer met behulp van een plaatadapter met meerdere kolommen

DOI:

10.3791/62075

⸱

21 mei 2021

 ,  ,  ,  ,  , 
1School of Life Sciences, University of Liverpool, 2Health Sciences Center, Texas Tech University

In dit artikel

Samenvatting

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Een multi-kolom plaatadapter maakt het mogelijk om chromatografiekolommen te koppelen aan multi-well verzamelplaten voor parallelle affiniteit of ionenuitwisselingszuivering, wat een economische eiwitzuiveringsmethode met hoge doorvoer biedt. Het kan worden gebruikt onder zwaartekracht of vacuüm het leveren van milligram hoeveelheden eiwit via betaalbare instrumentatie.

Samenvatting

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Eiwitzuivering is essentieel voor de studie van eiwitstructuur en -functie en wordt meestal gebruikt in combinatie met biofysische technieken. Het is ook een belangrijk onderdeel in de ontwikkeling van nieuwe therapieën. Het evoluerende tijdperk van functionele proteomics voedt de vraag naar eiwitzuivering met hoge doorvoer en verbeterde technieken om dit te vergemakkelijken. Er werd verondersteld dat een multi-kolom plaatadapter (MCPA) meerdere chromatografiekolommen van verschillende harsen kan koppelen aan multi-well platen voor parallelle zuivering. Deze methode biedt een economische en veelzijdige methode van eiwitzuivering die kan worden gebruikt onder zwaartekracht of vacuüm, die wedijvert met de snelheid van een geautomatiseerd systeem. De MCPA kan worden gebruikt om milligram opbrengsten van eiwitten te herstellen door middel van een betaalbare en tijd efficiënte methode voor latere karakterisering en analyse. De MCPA is gebruikt voor affiniteitszuivering met hoge doorvoer van SH3-domeinen. Ionenuitwisseling is ook aangetoond via de MCPA om eiwitten te zuiveren na Ni-NTA affiniteitschromatografie, wat aangeeft hoe dit systeem kan worden aangepast aan andere zuiveringstypen. Door de opstelling met meerdere kolommen kan individuele aanpassing van parameters in dezelfde zuivering worden gemaakt, onhaalbaar door de huidige plaatgebaseerde methoden.

Inleiding

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Eiwitzuiveringstechnieken om milligramhoeveelheden gezuiverde eiwitten te bereiken zijn noodzakelijk voor hun karakterisering en analyse, vooral voor biofysische methoden zoals NMR. Eiwitzuivering staat ook centraal in andere studiegebieden, zoals geneesmiddelenontdekkingsprocessen en eiwit-eiwitinteractiestudies; het bereiken van dergelijke hoeveelheden zuiver eiwit kan echter een knelpunt worden voor deze technieken1,2,3. De belangrijkste methode voor eiwitzuivering is chromatografie, die een verscheidenheid aan methoden omvat die afhankelijk zijn van de individuele kenmerken van eiwitten en hun tags. Bij affiniteitschromatografie hebben eiwitten een extra eiwit- of peptidemotief dat werkt als een tag die affiniteit heeft voor een bepaald substraat op de chromatografiehars4. De meest voorkomende affiniteitsmethode is geïmmobiliseerde metaalaffiniteitschromatografie (IMAC) met behulp van his-gelabelde eiwitten, terwijl een andere populaire methode ionenuitwisselingschromatografie is die eiwitten scheidt op basis van hun lading. Voor de hoogste zuiverheid wordt vaak een combinatie van affiniteitschromatografie en ionenuitwisseling samen gebruikt, waarbij meestal dure laboratoriumapparatuur nodig is voor een hoge doorvoer.

Het evoluerende tijdperk van functionele proteomica voedt de vraag naar technieken met een hoge doorvoersnelheid voor het zuiveren van niet-enkelvoudige eiwitten voor specifieke analyse, maar grote aantallen eiwitten tegelijkertijd voor uitgebreide analyse en genoombrede studies5. Geïmmobiliseerde metaalaffiniteitschromatografie (IMAC) is een van de meest gebruikte methoden voor eiwitzuivering met hoge doorvoer6,7, maar de geautomatiseerde systemen zijn duur en onbetaalbaar voor kleinere laboratoria8. De meer betaalbare plaatgebaseerde alternatieven die momenteel beschikbaar zijn, maken gebruik van toegankelijke laboratoriumapparatuur, zoals een vacuüm. Hoewel deze methoden succesvol zijn in het verbeteren van de zuiveringssnelheid, kan het alleen op kleinere schaal een zuivering met hoge doorvoer bereiken, waardoor alleen eiwitten in het microgrambereik worden opgeleverd. Deze beperkingen betekenen dat de voorverpakte 96 putfilterplaten (bijv. van GE Healthcare die nu eigendom zijn van Cytiva) niet kunnen worden gebruikt vóór biofysische technieken9. Zwaartekrachtchromatografie is de meest kostenefficiënte zuiveringsmethode; het instellen van meerdere kolommen is echter lastig en kan gevoelig zijn voor fouten voor meerdere eiwitten.

Een multi kolom plaat adapter (MCPA) is ontwikkeld en bewezen om met succes en gemakkelijk parallelle affiniteit chromatografie kolommen in een keer uit te voeren om zijn gelabelde gist SH3 domeinen te zuiveren10. De MCPA biedt een kostenefficiënte zuiveringsmethode met hoge doorvoer die niet afhankelijk is van dure instrumentatie. Het flexibele ontwerp kan effectief zuiveren milligram eiwit door meerdere affiniteit chromatografie kolommen onder zwaartekracht of vacuümspruitstuk. Bovendien kunnen harstype, volume en andere parameters voor elke afzonderlijke kolom worden aangepast voor snellere optimalisatie. Deze studie toont aan dat ionenuitwisselingschromatografie door de MCPA kan worden gebruikt in combinatie met affiniteitschromatografie door de MCPA om de zuivering van het Abp1 SH3-domein te verbeteren. Bovendien kunnen tot 24 verschillende eiwitten parallel worden gescheiden met behulp van deze methoden.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. Denatureren van Ni-NTA chromatografie

  1. Buffers voorbereiden
    OPMERKING: Zie tabel 1 voor meer informatie over alle buffers.
    1. Maak 500 ml 0,5 m NaOH, zorg ervoor dat u eerst het Milli-Q-water toevoegt en vervolgens de NaOH langzaam toevoegt terwijl het bekerglas op een roerder staat. Filter met een filter van 0,22 μm.
    2. Bereid 100 ml nikkelsulfaat van 0,1 m en filtreer met een filter van 0,22 μm.
    3. Bereid 50 ml 2 M imidazol en filtreer met een filter van 0,22 μm.
    4. Bereid en 0,22 μm filter 1,5 L denatureringsbuffer bij pH 8,0 bestaande uit 5,3 mM Tris-HCl, 4,7 mM Tris-base (Tris (hydroxymethyl)methylamine), 13,7 mM NaH2PO4,86,3 mM Na2HPO4 en 6 M guanidinehydrochloride.
    5. Bereid en 0,22 μm filter 500 ml lysisbufferoplossing van 10 mM imidazol opgelost in denatureringsbuffer (zie 1.1.4) met behulp van de 2 M imidazolvoorraad.
    6. Bereid en 0,22 μm filter 500 ml wasbufferoplossing van 10 mM imidazol opgelost in denatureringsbuffer (zie 1.1.4) met behulp van de 2 M imidazolvoorraad.
    7. Bereid en 0,22 μm filter 500 ml 100 mM EDTA buffer, stel de pH in op 8 met 1 M NaOH.
    8. Bereid en 0,22 μm filter 500 ml elutiebuffer bestaande uit 7 ml 99% ijsazijn in 6 M guanidinehydrochloride.
      OPMERKING: Als u native buffers gebruikt, past u deze aan volgens tabel 1.
  2. Lysing cellen (denatureringsmethode)
    1. Voeg 2 ml lysisbuffer toe aan elke 1 g geoogste E. coli-celkorrels die het overgeperste His-gelabelde eiwit bevatten. Vortex gedurende enkele minuten totdat de cellen opnieuw worden opgehangen. Laat de monsters 30 minuten op een schommel staan bij 4 °C.
    2. Centrifugeer gelyseerde pellets gedurende 30 minuten op 18.000 x g. Houd 50 μL opzij in een vriezer van -20 °C om later een SDS-PAGE gel te analyseren.
    3. Giet de supernatanten voorzichtig af en zorg ervoor dat de pellet niet wordt verstoord. Lysaten moeten een heldere, lichtgele kleur hebben. Als lysaten troebel zijn, centrifugeer dan opnieuw het monster; overweeg sonicatie indien beschikbaar om nucleïnezuur af te afbraak.
    4. Filtreer de supernatanten door een lege kolom (zonder hars maar met filter) en verzamel in een open opvangbak. Breng vervolgens over in een buis voor gebruik in stap 1.3.
      OPMERKING: Als u de native buffers gebruikt, behandel de monsters dan na stap 1.2.1 tot 3 cycli van bevriezen/ontdooien bij -80 °C of verwerk door sonicatie of French Press om cellen te lyseren.
  3. Vacuümzuiveringsopstelling voorbereiden en kolommen in evenwicht stellen
    OPMERKING: Zie Figuur 1 voor een set-up MCPA met 24 kolommen.
    1. Bepaal hoeveel kolommen nodig zijn, evenals het gewenste harstype en volume. Als vuistregel voor 100 ml auto-inductiecultuur (~ 2 g pellet) die zijn gelabelde SH3-domeinen uitdrukt met behulp van op T7 gebaseerde plasmiden, gebruikt u 0,6 ml Ni-NTA-hars per kolom om ongeveer 3 mg eiwit op te leveren van ongeveer 6 ml lysaat.
    2. Steek het gewenste aantal kolommen van 12 ml (zonder hars maar met filter) in een voorgemonteerde MCPA (lange druppelplaat met doorboorde afdichtingsmat). De kolommen moeten goed passen in de gaten van de afdichtingsmat die zijn doorboord.
    3. Als er minder dan 24 kolommen worden gebruikt, sluit u lege gaten met een lege gesloten kolom.
    4. Neem een open opvangplaat en plaats deze plaat in de basis van het vacuümspruitstuk en sluit met de bovenkant van het spruitstuk.
    5. Plaats de geassembleerde MCPA met kolommen op het vacuümspruitstuk.
    6. Bevestig de slang van een vacuümpompsysteem aan de inlaat/het mondstuk aan de onderkant van het vacuümspruitstuk.
    7. Zorg ervoor dat de Ni-NTA kralen in een 50% oplossing zitten met 20% ethanol. Voordat u iets met de kralen doet, schudt/mengt u de kraal/ethanoloplossing voorzichtig om gelijkmatig te resuspenderen. Vervolgens, met behulp van een pipet van 5 ml, pipet 1,2 ml van de 50% oplossing in de kolommen. Zorg er tijdens het pipetten voor dat de kralen volledig gemengd blijven.
    8. Nadat u in alle 24 kolommen hebt gepijpt, schakelt u de vacuümpomp in en voert u de 20% ethanol door de kolom en in de verzamelplaat hieronder.
    9. Schakel de pomp uit zodra alle 20% ethanol door alle kolommen is gelopen (Ni-NTA-hars kan kort drogen verdragen als het vacuüm nog steeds wordt toegepast nadat de buffer door de kolom is gegaan). Gooi wat er in de open inzamelplaat zit in een afvalbak.
      LET OP: Alle afvalproducten van de Ni-NTA kralen zijn gevaarlijk, draag bij het hanteren van de kralen of het afvoeren van het afval handschoenen, een bril en andere PBM's. Gooi bovendien al het nikkelsulfaatafval in een aparte container voor individuele verwijdering later.
      OPMERKING: Als hars nieuw is of onlangs is geregenereerd, kunnen de rest van deze stappen worden genegeerd, ga naar de volgende sectie.
    10. Voeg 3 harsvolumes (1,8 ml) 100 mM EDTA-buffer toe met een spuit van 20 ml of een repeaterspuit met een spuit van 50 ml. Schakel vervolgens de vacuümpomp in om de EDTA-buffer door te laten spoelen en schakel de pomp uit zodra deze is doorgespoeld.
      OPMERKING: Deze wasbeurt moet de nikkelblauwe kleur verwijderen, maar als dit niet het geval is, herhaal dan deze stap totdat alle kolommen hun blauwe kleur hebben verloren. Zet de pomp uit en giet de inhoud van de open opvangplaat in de afvalbak.
    11. Voeg 3 harsvolumes (1,8 ml) van 0,5 M NaOH-buffer toe aan elke kolom voordat u de pomp inschakelt en deze door elke kolom laat lopen. Lege verzamelplaat.
    12. Voeg 4 harsvolumes (2,4 ml) nikkelsulfaat van 100 mM toe aan elke kolom. Zet de vacuümpomp aan en draai deze nogmaals door de kolom.
    13. Voeg 10 harsvolumes (~6000 μL) Milli-Q water toe en laat dit door de kolommen lopen. Zet de pomp uit en giet de inhoud van de opvangplaat in de afvalbak.
    14. Was de kolommen tweemaal met 4 harsvolumes (2,4 ml) van 10 mM imidazol in wasbuffer (denatureren of inheems) elke keer om overtollig nikkel en equilibraat te verwijderen. Lege verzamelplaat.
      OPMERKING: Als kolommen aanzienlijk langzamer werken, kunt u de kolom losmaken en de lucht controleren die met een grote spuit door de MCPA kan worden geduwd. Als dit is gedeblokkeerd, gebruikt u een andere kolom met een nieuw filter.
    15. Als er meerdere verschillende monsters/eiwitten op de MCPA gezuiverd gaan worden vervang dan de open verzamelplaat door een 48 x (5 ml/put) opvangplaat. Wanneer echter alleen dezelfde eiwitmonsters op elke kolom worden uitgevoerd, is het prima om door te gaan met het gebruik van een open verzamelplaat.
  4. Laden, wassen en eluting
    1. Met vacuüm uit, laad lysaten in kolommen (de hoeveelheid lysaat zal variëren, meestal van 1 tot 12 ml of meer en kan nodig zijn om in meerdere batches te laden). Gebruik een dunne plastic roerder om de kralen en het lysaat in de kolom voorzichtig te mengen om de binding te maximaliseren.
    2. Schakel na het voorzichtig mengen van elke kolom gedurende een paar minuten de vacuümpomp in en laat de lysates door de kolommen lopen. Als er meerdere eiwitmonsters worden uitgevoerd, gebruik dan een 48 put opvangplaat en zorg ervoor dat u de opvangplaat verwisselt voor nog eens 48 putplaat nadat 4 ml is doorgelopen, omdat de putten in deze platen slechts 4 ml oplossing kunnen bevatten. Ga door met het uitvoeren van lysaat totdat alle lysaten door een kolom zijn uitgevoerd. Verzamelplaten bevriezen die de doorstroom bevatten.
      OPMERKING: Kolommen kunnen "geblokkeerd" raken waardoor het lysaat veel langzamer door de kolom stroomt dan zou moeten. Dit is gemakkelijk te zien omdat de naburige kolommen in een normaal tempo zullen stromen. Als dit gebeurt, wordt aanbevolen om het lysaat/harsmengsel over te dragen naar een kolom met een vers filter.
    3. Vervang de opvangplaat door een lege open opvangplaat en voeg vervolgens 9 harsvolumes (5,4 ml) van 10 mM imidazolwasbuffer toe aan elke kolom en zet het vacuüm aan en laat de was doordraaien. Herhaal dit 4-5 keer. Om overloop te voorkomen, moet u de afvalplaat regelmatig legen.
      1. Vervang vervolgens de verzamelplaat door een schone geschikte plaat (open plaat voor slechts één eiwit en 96 goed als er meerdere eiwitten zijn, zodat A1 zich in de linkerbovenhoek bevindt).
    4. Gebruik een repeaterspuit met een spuit van 12,5 ml, pipet ~1 harsvolume (0,75 ml) denatureringsoptrekbuffer in elke kolom.
    5. Om eiwitschuim te voorkomen, schakelt u de vacuümpomp in op de laagste stand. Til de MCPA voorzichtig op om te controleren of er niets in de opvangplaat kan druppelen.
      OPMERKING: Een alternatief voor eluting met het vacuüm of de zwaartekracht is het duwen van een 10 ml spuit plunjer in de bovenkant van de kolom om de elutiebuffer voorzichtig door de kolom te duwen. Doe dit voor elke kolom en wees voorzichtig bij het verwijderen van de zuiger van de spuit om de kralen aan de onderkant van de kolom niet te verstoren. Zodra de elutiebuffer is doorgedrukt, verwijdert u voorzichtig de zuiger van de spuit uit de laatste kolom waarin deze is gebruikt en schakelt u de vacuümpomp kort in om de laatste druppels uit de kolommen te verwijderen.
      1. Als een 96-put opvangplaat is gebruikt, controleer dan de opvangplaat om er zeker van te zijn dat wat uit elke kolom door de lange druppelplaat stroomt slechts in één put stroomt en dat er niets in naburige putten op de verzamelplaat uitdruist.
    6. Herhaal voor de volgende elutie de bovenstaande 2 stappen en verzamel in een verse multi-put (verschillende monsters) of open verzamelplaat (dezelfde monsters).
    7. Optionele stap, neem een 50 μL aliquot van elke elutie voor zuiverheids- en concentratieanalyse.
    8. Voeg 2 ml 20% ethanol toe aan elke kolom en voer dit door met behulp van de vacuümpomp. Voeg vervolgens nog eens 2 ml 20% ethanol toe aan de kolommen en gebruik een verse dunne plastic roerder om de 20% ethanol en de kralen te mengen voordat u deze overbrengt naar een buis van 50 ml voor opslag bij 4 °C. Reinig de kolommen en controleer of het water vrij door elke kolom stroomt en maak vervolgens alles schoon en opgeborgen voor later gebruik.
      OPMERKING: Sommige kolommen hebben uiteindelijk hun filters geblokkeerd en zullen te langzaam werken, deze kolommen moeten worden vervangen of filters moeten worden schoongemaakt. Als zodanig wordt aanbevolen om filters periodiek te testen door hars te verwijderen en de kolom met water te vullen om te zien of deze snel doorstroomt. Filters kunnen worden gereinigd door een gesloten kolom gevuld met denaturerende elutiebuffer achter te laten en 's nachts te schudden.

2. Ionenuitwisseling - Single protein purification

  1. De buffers voorbereiden
    OPMERKING: Zie tabel 1 voor meer informatie over alle buffers
    1. Bereid een zoutarme buffer van 2 L: 10 mM Tris pH 8.1 (5 mM Tris Acid, 5 mM Tris Base). Filteroplossing met een filter van 0,22 μm.
    2. Bereid een 0,5 L hoge zoutbuffer: 10 mM Tris pH 8.1, 4 M NaCl. Meet 116,9 g NaCl en maak tot 0,5 L met de 10 mM Tris pH 8,1 van bovenaf. Filteroplossing met een filter van 0,22 μm.
  2. Het maken van zoutconcentratiereeks: 0-1 M NaCl.
    OPMERKING: Het bereik van zoutconcentraties kan voor elk eiwit worden aangepast.
    1. Opstelling 24 x 50 ml gelabelde centrifugebuizen in een rek
    2. Bereid met behulp van de hierboven gemaakte buffers 24 x 14 ml NaCl-verdunningen van 0-1000 μM. Begin met het toevoegen van de vereiste volumes van 4 M NaCl 10 mM Tris. Dit kan worden gedaan door stappen van 25 mM of 50 mM, afhankelijk van eiwitten.
    3. Voeg vervolgens de vereiste volumes van 10 mM Tris toe aan elke buis. Keer elke buis meerdere keren om om te mengen.
  3. Monsters voorbereiden
    1. Verkrijg de monsters die moeten worden gezuiverd door ionenuitwisseling. Neem eventueel een aliquot van 50 μL voor analyse later.
      OPMERKING: Monsters moeten altijd koud worden gehouden; dit kunnen lysaten zijn, of misschien na Ni-NTA. Monsters van Ni-NTA in denaturerende buffers vereisen dialyse of bufferuitwisseling in 10 mM Tris-buffer. Monsters van Ni-NTA in inheemse buffers kunnen worden verdund met 10 mM Tris-buffer om de zoutconcentratie te verlagen, zodat het eiwit zich kan binden aan IEX-hars.
    2. Draai monsters op 18.000 x g gedurende 10 minuten.
    3. Giet de supernatant voorzichtig in een weegboot. Vermijd het verstoren van de pellet.
    4. Neem het supernatant voorzichtig op in een spuit van 20 ml en bevestig een filter van 0,22 μm.
    5. Gooi het supernatant langzaam door het filter in een verse buis van 50 ml.
    6. Als verdunning nodig is, verdun supernatant met 10 mM Tris buffer hierboven gemaakt (In dit experiment werd het supernatant verdund 1 op 2). Bewaren bij 4 °C in de tussentijd.
  4. Voorbereiden van de vacuümzuiveringsopstelling en equilibratieopstelling
    OPMERKING: In dit protocol wordt slechts één kolom gebruikt voor IEX-zuivering van één monster. Zie de volgende sectie voor meerdere zuiveringen.
    1. Bepaal het gewenste harstype en -volume. Gebruik als vuistregel voor maximaal 20 mg gedeeltelijk zuivere SH3-domeinen met een tag sh3 0,4 ml Q-sepharose fast flow hars per kolom (zie stap 2.4.8).
    2. Plaats 24 open lege kolommen (leeg zonder filter onderaan) in een voorgemonteerde MCPA. De kolommen moeten goed passen in de gaten van de afdichtingsmat die zijn doorboord.
    3. Plaats een zuiger van 10 ml spuit in elke lege kolom, behalve de eerste positie, waar de zuivering zal beginnen.
    4. Duw de onderkant van een open kolom (met filter) door een rubberen pakking van een zuiger van 5 ml (die is doorboord) om een rubberen ring aan het einde van de kolom te vormen. Deze rubberen ring zorgt voor een goede afdichting wanneer deze kolom in elke lege kolom hierboven wordt geplaatst. Voeg deze kolom voorlopig in de eerste lege kolom op de MCPA in.
    5. Neem een open opvangplaat en plaats deze plaat in de basis van het vacuümspruitstuk en sluit met de bovenkant van het spruitstuk.
    6. Plaats de gemonteerde MCPA (met kolommen) op het vacuümspruitstuk.
    7. Bevestig de slang van een vacuümpompsysteem aan de inlaat/het mondstuk aan de onderkant van het vacuüm.
    8. Snijd een blauwe pipetpunt ~ 2 cm van de bodem en gebruik om 800 μL Q-sepharose kralen (of een andere ionenuitwisselingshars) op te nemen, zodat de 50/50 kraal-ethanoloplossing wordt gemengd om gelaagdheid te voorkomen. Pipet 800 μL in de ene open kolom (met filter) in de eerste positie en zodra de kralen zich aan de onderkant van de kolommen nestelen, schakelt u het vacuüm voldoende in om door de 20% ethanol te lopen.
    9. Was de kolom met sepharose kralen met 2 x 2 ml 10 mM Tris. Schakel het vacuüm uit net voordat de Tris buffer doorloopt om uitdroging van de hars te voorkomen. Weglopen kan worden weggegooid.
      OPMERKING: Als hars eerder is gebruikt, regenereer dan door 5 harsvolumes van 4 M NaCl en vervolgens 5 harsvolumes van 10 mM Tris vóór stap 2.4.9 te wassen.
  5. Laden, wassen en eluting
    1. Breng al het te zuiveren monster (zie punt 3) in de eerste positie over naar de Q sepharose-kolom, gebruik een kleine plastic lus om het monster en de kralen ongeveer ~ 2 minuten te roeren voordat u de vacuümpomp inschakelt.
      OPMERKING: In geval van overtollig supernatant (>12 ml), pas op voor overvulling van de kolom. Laat het monster doorlopen en voeg vervolgens meer toe, meng voordat u het opnieuw doorlaat.
    2. Sla de doorstroom op/bevries deze later voor analyse.
    3. Plaats nog een open opvangplaat in het vacuümspruitstuk en was vervolgens elke sepharosekolom met 2 x 2 ml 10 mM Tris en bewaar.
    4. Plaats een 96 put verzamelplaat en zorg ervoor dat A1 zich in de linkerbovenhoek bevindt.
    5. Om de eerste elutiefractie te verzamelen, verwijdert u de zuiger van de spuit uit de volgende kolom, beweegt u de Q sepharose-kolom in deze positie en plaatst u de zuiger van de spuit in de vorige positie. Pipetteer vervolgens 1 ml van de eerste zoutconcentratie in de Q sepharose kolom. Zet de pomp aan en verzamel de elutie. Zet de pomp uit net zoals de vloeistoflijnen in de buurt van de kralen om uitdroging van de kralen te voorkomen.
    6. Om de volgende elutiefractie te verzamelen, verwijdert u de zuiger van de spuit uit de volgende kolom, beweegt u de Q sepharose-kolom in deze positie en plaatst u de zuiger van de spuit in de vorige positie.
    7. Voeg 1 ml van de volgende zoutconcentratie toe aan de kolom en herhaal het proces totdat alle concentraties zijn gebruikt en 24 elutions zijn verzameld in 24 afzonderlijke putten. Controleer of er geen vloeistof in naburige putten is gekomen.
    8. Was de kolom met 2 ml 4 M NaCl 10 mM Tris. Laat dit maar doorlopen.
    9. Wassen met 2 ml 20% ethanol. Laat ethanol lopen tot het net boven de kralen en afdichtingskolom is voor opslag.
    10. Bewaar 96 goed inzamelingsplaat en analyseer door UV spectroscopie en SDS PAGINA.

3. Ionenuitwisseling - Gelijktijdige zuiveringen van 24 verschillende eiwitten

OPMERKING: Zie stap 2.1-2.3 voor meer informatie over het maken van buffers, een reeks zoutconcentraties en het bereiden van monsters

  1. Voorbereiden van de zuiveringsinstallatie
    OPMERKING: Hoe het zuiveringssysteem is opgezet, is sterk afhankelijk van het aantal eiwitten dat wordt gezuiverd en hoeveel zoutcondities zullen worden gebruikt. Om 12 monsters tot maximaal 24 monsters tegelijk te zuiveren, is een verzamelplaat nodig voor elke zoutconcentratie die wordt gebruikt om te elute. Voor minder dan 12 monsters is het mogelijk om de chromatografiekolommen een paar posities binnen dezelfde MCPA te verplaatsen voordat de opvangplaten worden verwisseld. In dit geval is het niet nodig om de kolommen in lege kolommen te plaatsen en kunnen ze direct aan de MCPA-afdichtingsmat worden bevestigd. Het onderstaande protocol is voor 24 gelijktijdige ionenuitwisselingszuiveringen.
    1. Plaats de geassembleerde MCPA direct bevestigd aan 24 lege kolommen met filters bovenop het vacuümspruitstuk dat een open opvangplaat bevat en bereid en was 24 ionenuitwisselingskolommen zoals in één zuiveringsmethode hierboven. Voor deze zuivering is het handig om een Eppendorf repeater of spuit te gebruiken om snel in kolommen te pipetten.
  2. Laden, wassen en eluting
    1. Plaats een 48-put opvangplaat in de basis van het vacuümspruitstuk voordat u de MCPA monteert (met de gewassen zuiveringskolommen erop). Zorg ervoor dat A1 zich in de linkerbovenhoek bevindt.
    2. Pipetteer elk eiwitmonster (tot 5 ml per keer) in hun overeenkomstige kolom. Roer elke kolom met een dunne plastic lus (één lus voor elke kolom om verontreiniging te voorkomen) gedurende ongeveer 2 minuten. Schakel vervolgens de vacuümpomp in en laat het supernatant doorstromen.
      OPMERKING: In geval van overtollig supernatant, pas op voor overvulling van de kolommen. Laat het monster door de kolom lopen en voeg vervolgens meer toe, meng voordat u het opnieuw doorlaat.
    3. Bewaar/Vries de 48-well verzamelplaat in voor latere analyse, omdat deze de doorstroom voor elk eiwit bevat.
    4. Plaats nog een 48-put opvangplaat in het vacuümspruitstuk en was vervolgens elke sepharose kolom met 2 x 2 ml 10 mM Tris.
    5. Plaats de eerste 96-put opvangplaat in het spruitstuk, zorg ervoor dat A1 zich in de linkerbovenhoek bevindt en pipetteer vervolgens 1 ml van de eerste zoutconcentratie in elke kolom en schakel vervolgens de vacuümpomp in om dit door de kolommen te laten lopen. Verwijder de opvangplaat, dek af met parafilm en bewaar deze bij 4 °C voor analyse.
    6. Herhaal stap voor elke opeenvolgende zoutconcentratie die wordt gebruikt om te elute. Zorg ervoor dat voor elke elutie een nieuwe verzamelplaat wordt gebruikt en dat elke verzamelplaat wordt geëtiketteerd en opgeslagen.
    7. Was elke kolom met 2 ml 10 mM Tris, 4 M NaCl.
    8. Was elke kolom met 2 ml 20% ethanol. Laat ethanol lopen tot het net boven de kralen en afdichtingskolommen is voor opslag.
    9. Bewaar 96 put verzamelplaten en analyseer door UV spectroscopie en SDS-PAGE.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Resultaten

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Als voorbeeld heeft de MCPA met succes 14 AbpSH3 mutanten gezuiverd in denatureringsomstandigheden via Ni-NTA (Figuur 2A). Een kleine verontreiniging ~ 25 kDa is te zien, maar het eiwit is nog steeds grotendeels zuiver. Deze verontreiniging wordt verondersteld te zijn YodA, een veel voorkomende co-gezuiverde eiwit gevonden in E. coli11. Figuur 2B toont de zuivering van 11 verschillende SH3-domeinen onder inheemse omstand...

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Discussie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

De methode is robuust en eenvoudig te gebruiken voor relatief onervaren eiwit biochemici, maar er zijn een paar overwegingen om in gedachten te houden.

Let op bij overvulling van verzamelplaten

De 48-put opvangplaat zelf bevat slechts 5 ml per put, terwijl elke 96-put slechts 2 ml bevat. Dit moet in gedachten worden gehouden bij het toevoegen van buffer en het uitvoeren van monster door de kolom, omdat er het risico bestaat dat de putten worden over...

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Openbaarmakingen

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

De auteurs hebben niets bekend te maken.

Dankbetuigingen

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Onderzoek dat in deze publicatie werd gerapporteerd, werd ondersteund door een Institutional Development Award (IDeA) van het National Institute of General Medical Sciences van de National Institutes of Health onder subsidienummer P20GM103451 en een interne onderzoeksbeurs van de Universiteit van Liverpool.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel
NaamBedrijfCatalogusnummerOpmerkingen
2 mL/ well collectieplaatAgilent technologies201240-100
5 mL/ well collectieplaatAgilent technologies201238-100
12 mL chromatografiekolommenBio-Rad7311550
96 well lange druppelplaatAgilent technologies200919-100Komt met 0,25 µm filters die moeten worden verwijderd.
96 well platenseal/ matAgilent technologies201158-100Moet prikbaar zijn
His60 Ni Superflow ResinTakara Bio635660
HiTrap Q HP anionenuitwisselingskolomGE Healthcare (Cytiva)17115301
Lvis plate readerBMG LABTECHCompatibel met FLUOstar Omega plate reader
Male leur plugsCole-ParmerEW-45503-70
PlatePrep 96 well Vacuum Manifold Starter kitSigma-Aldrich575650-U
Reservoir collectieplaatAgilent technologies201244-100
The Repeater PlusEppendorf2226020Met 5 mL en 50 mL spuiten
VACUSAFE vacuümINTEGRA158 320Het VACUSAFE vacuüm heeft een vacuümbereik van 300 mBar tot 600 mBar en een 4 L afvalinzamelingfles

Referenties

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Zhang, C., et al. Development of an Automated Mid-Scale Parallel Protein Purification System for Antibody Purification and Affinity Chromatography. Protein Expression and Purification. , 128(2016).
  2. Renaud, J. P., et al. Biophysics in Drug Discovery: Impact, Challenges and Opportunities. Nature Reviews. Drug Discovery. 15 (10), (2016).
  3. Kim, Y., et al. High-throughput Protein Purification and Quality Assessment for Crystallization. Methods (San Diego, Calif). 55 (1), (2011).
  4. Pan, W., Wang, Y. A New Metal Affinity NCTR 25 Tag as a Better Alternative to the His-tag for the Expression of Recombinant Fused Proteins. Protein Expression and Purification. , 164(2019).
  5. Locatelli-Hoops, S., Sheen, F. C., Zoubak, L., Gawrisch, K., Yeliseev, A. A. Application of HaloTag Technology to Expression and Purification of Cannabinoid Receptor CB2. Protein Expression and Purification. 89 (1), 62-72 (2013).
  6. Pina, A. S., Lowe, C. R., Roque, A. C. A. Challenges and Opportunities in the Purification of Recombinant Tagged Proteins. Biotechnology Advances. 32 (2), (2014).
  7. Gaberc-Porekar, V., Menart, V. Perspectives of Immobilized-Metal Affinity Chromatography. Journal of Biochemical and Biophysical Methods. 49 (1-3), (2001).
  8. Anderson, A. C. The Process of Structure-Based Drug Design. Chemistry & Biology. 10 (9), (2003).
  9. Cummin, E., et al. A Simple High-Throughput Purification Method for Hit Identification in Protein Screening. Journal of Immunological Methods. 339 (1), (2008).
  10. Dominguez, M. J., et al. A Multi-Column Plate Adapter Provides an Economical and Versatile High-Throughput Protein Purification System. Protein Expression and Purification. , 152(2018).
  11. Bolanos-Garcia, V. M., Davies, O. R. Structural Analysis and Classification of Native Proteins From E. Coli Commonly Co-Purified by Immobilised Metal Affinity Chromatography. Biochimica et Biophysica Acta. 1760 (9), (2006).
  12. Ayyar, B. V., Arora, S., Murphy, C., O'Kennedy, R. Affinity Chromatography for Antibody Purification. Methods in Molecular Biology (Clifton, N.J.). , (1129).
  13. Jubb, H., Higueruelo, A. P., Winter, A., Blundell, T. L. Structural Biology and Drug Discovery for Protein-Protein Interactions. Trends in Pharmacological Sciences. 33 (5), (2012).
  14. Grabowski, M., Niedzialkowska, E., Zimmerman, M. D., Minor, W. The Impact of Structural Genomics: the First Quindecennial. Journal of Structural and Functional Genomics. 17 (1), 1-16 (2016).

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Herprints en machtigingen

Toestemming aanvragen om de tekst of afbeeldingen van dit JoVE-artikel te hergebruiken

Toestemming aanvragen

Trefwoorden

High throughput zuiveringaffiniteitschromatografieionenuitwisselingschromatografienikkel NTA zuiveringSH3 domeinzuiveringparallelle eiwitzuiveringvacu mm manifoldfunctionele proteomics

Gerelateerde artikelen