Methodenartikel

De voorbereiding van Chicken Ex Ovo Embryo's en Chorioallantoic Membrane Vessels als In Vivo Model voor Contrast-Enhanced Ultrasound Imaging en Microbubble-Gemedieerde Drug Delivery Studies

7.6K weergaven

⸱

DOI:

10.3791/62076

⸱

9 februari 2021

 ,  ,  ,  , 
1Department of Biomedical Engineering, Thoraxcenter, Erasmus MC University Medical Center Rotterdam, 2Laboratory of Acoustical Wavefield Imaging, Faculty of Applied Sciences, Delft University of Technology

In dit artikel

Samenvatting

Dit protocol beschrijft drie methoden voor het verkrijgen en gebruiken van 5 tot 8 dagen oude kippenembryo's en hun chorioallantoic membrane (CAM) als een in vivo model om contrastverbeterde ultrasone beeldvorming en microbubbel-gemedieerde medicijnafgifte te bestuderen.

Samenvatting

Het kippenembryo en het bloedvatrijke chorioallantoïsche membraan (CAM) is een waardevol in vivo model om biomedische processen, nieuwe ultrasone pulserende schema's of nieuwe transducers voor contrastverbeterde ultrasone beeldvorming en microbubbel-gemedieerde medicijnafgifte te onderzoeken. De redenen hiervoor zijn de toegankelijkheid van het embryo- en vaatnetwerk van de CAM en de lage kosten van het model. Een belangrijke stap om toegang te krijgen tot het embryo en cam-vaten is om het eigehalte uit de eierschaal te halen. In dit protocol worden drie methoden beschreven om de inhoud uit de eierschaal te halen tussen dag 5 en 8 van de incubatie, waardoor de embryo's zich tot op de dag van vandaag in de eierschaal kunnen ontwikkelen. De beschreven methoden vereisen alleen eenvoudige gereedschappen en apparatuur en leveren een hoger overlevingssuccespercentage op van 90% voor 5 dagen, 75% voor 6 dagen, 50% voor 7 dagen en 60% voor 8 dagen oude bebroede eieren in vergelijking met ex ovo gekweekte embryo's (~ 50%). Het protocol beschrijft ook hoe cavitatiekernen, zoals microbubbels, in het CAM-vasculaire systeem kunnen worden geïnjecteerd, hoe het membraan met het embryo en CAM kan worden gescheiden van de rest van de ei-inhoud voor optisch transparante studies, en hoe het kippenembryo en CAM te gebruiken in een verscheidenheid aan echografie-experimenten op korte termijn. Het in vivo kippenembryo en CAM-model is uiterst relevant om nieuwe beeldvormingsprotocollen, ultrasone contrastmiddelen en ultrasone pulserende schema's voor contrastverbeterde echografie te onderzoeken en om de mechanismen van echografie-gemedieerde medicijnafgifte te ontrafelen.

Inleiding

Ex ovo kippenembryo's en het bloedvatrijke chorioallantoische membraan (CAM) hebben bewezen een geschikt model te zijn om verschillende biologische en biomedische processen zoals embryogenese, oncologie en medicijnafgifte te onderzoeken 1,2,3,4. Echografie is gebruikt voor beeldvorming van de embryonale hartontwikkeling 4,5 en voor het activeren van cavitatiekernen bij injectie, zoals microbubbels, voor vasculaire medicijnafgifte 6,7. Kippenembryo's zijn goedkoop, vereisen minder infrastructuur en apparatuur en hebben minder strenge wetgeving in vergelijking met andere diermodellen8. Het kippenembryo en de CAM-vaten zijn gemakkelijk toegankelijk na het openen van het ei, terwijl dit veel moeilijker blijkt te zijn met zoogdierembryo's en -vaten. Daarnaast zorgen de kippenembryo- en CAM-vaten voor een hartslag en een pulserende bloedstroom. De CAM vertoont overeenkomsten in de anatomie van bloedvaten met zoogdieren en kan worden gebruikt voor drugsscreening 8,9,10. Vanwege deze kenmerken hebben de CAM-vaten ook bewezen een geschikt model te zijn om contrastverbeterde ultrasone beeldvorming (CEUS) te onderzoeken 11,12,13,14,15,16. Daarnaast kan het model worden gebruikt om het gedrag van ultrasone contrastmiddelen in een ultrasoon veld optisch te onderzoeken met behulp van een ultrasnelle camera en het effect van akoestische stralingskracht op het voortstuwen, binden en extravaseren van geneesmiddelen 7,17,18,19. Hoewel het kippenembryo en CAM minder geschikt zijn voor langetermijnexperimenten, kunnen ze gunstig zijn voor in vivo experimenten op korte termijn.

Om de zichtbaarheid en controleerbaarheid van het kippenembryo en CAM tijdens experimenten te vergroten, is het belangrijk om het eigehalte met het embryo en CAM uit de eierschaal te halen18. Eerdere kippenembryostudies met ultrasone contrastmiddelen gebruikten 5 tot 6 dagen oude embryo's 7,11,12,17,19 en 14 tot 18 dagen oude embryo's 13,14,15,16. Meerdere benaderingen zijn in detail beschreven om het eigehalte uit de schaal te halen 18,20,21. Voor zover wij weten, richten de eerder gepubliceerde benaderingen zich echter op het verwijderen van het eigehalte uit de eierschaal na 3 dagen incubatie (d.w.z. Hamburger & Hamilton (HH) fase 19-2022), en zetten de cultuur ex ovo voort. Deze ex ovo-cultuurbenadering heeft meerdere nadelen, waaronder een verhoogd risico op sterfgevallen tijdens de kweek (~ 50%)1,18, het gebruik van antibiotica18,20 en een verminderde totale vaatlengte in vergelijking met in ovo-groei 23. Omdat het kweken van het embryo in de eierschaal de meest natuurlijke omgeving biedt, is het het gemakkelijkst om het embryo in de eierschaal te incuberen tot de dag van het experiment. Om deze reden zou een aanpak waarbij het eigehalte na 5 tot 8 dagen incubatie uit de eierschaal wordt gehaald, vooral gunstig zijn voor experimenten met embryo's van 5 tot 8 dagen oud.

In dit protocol beschrijven we drie methoden om het eigehalte uit de eierschaal te halen wanneer het embryo op dag 5 tot 8 van ontwikkeling is (HH 26-3522) waardoor het embryo zich tot de dag van het experiment in de eierschaal kan ontwikkelen. De grootte van het CAM-vat varieert van 10-15 μm in diameter, in de kleinere haarvaten van een 8 dagen oud embryo24, tot 115-136 μm in diameter in het grotere vat van 6 en 8 dagen oude embryo's24,25. De drie beschreven methoden vereisen alleen basislaboratoriumhulpmiddelen en verminderen het risico op complicaties voordat het experiment is begonnen, waardoor onnodige kosten en arbeid worden verminderd. We beschrijven ook een methode om het membraan met het embryo en de CAM te scheiden van de dooierzak, waardoor de CAM optisch transparant wordt voor microscopiestudies. Omdat het membraan met het embryo en CAM kan worden vastgepind op bijvoorbeeld een houder met een akoestisch membraan, kan de opstelling ook akoestisch transparant worden gemaakt26, waardoor de combinatie van microscopie en echografie mogelijk is wanneer het lichtpad wordt beïnvloed door de dooier. Ten slotte beschrijven we verschillende andere echografie-opstellingen die kunnen worden gebruikt voor echografie of CEUS-beeldvorming.

Protocol

Alle dierproeven zijn uitgevoerd in overeenstemming met de Nederlandse Wet op het dierenexperiment en in overeenstemming met de Europese Raad (2010/63/EU) over de bescherming van diergebruik voor wetenschappelijke doeleinden.

1 . Embryovoorbereidingsprotocol

  1. Incubatie van de bevruchte kippeneieren
    1. Bewaar vers bevruchte kippeneieren bij 15 °C gedurende maximaal één week.
    2. Om de bevruchte eieren te incuberen, plaatst u ze verticaal met de puntige kant naar beneden in een bevochtigde incubator van 37 °C. Het draaien van de eieren tijdens de incubatie is niet nodig.
      OPMERKING: Schrijf de begindatum van incubatie van de bovenkant van het ei met behulp van een permanente marker.
  2. Voorbereiding tot 5-daagse (120 h) oude embryo's (HH stadium 26-28)22
    1. Voorbereiding van het werkgebied
      1. Warm een verwarmingsplaat op tot 37 °C.
      2. Plaats een metalen eierhouder (figuur 1A,B), een metalen weegboothouder (figuur 1C,D) en een Erlenmeyer van 10 ml gevuld met PBS op de verwarmingsplaat.
      3. Vul een weegboot (85 mm × 85 mm × 25 mm) met een laag ultrasone gel van 10 mm en plaats de gevulde weegboot in de voorbewarmde metalen weegboothouder.
        OPMERKING: Het vullen van de weegboot met ultrasone gel zal het embryo en CAM verhogen. Dit kan gunstig zijn voor de injectie of beeldvorming van het embryo en CAM, maar is niet nodig om het embryo en cam uit de eierschaal te halen.
      4. Bereid een paar stukjes tape (ongeveer 3 cm lengte) met een deel van het ene uiteinde teruggevouwen op zichzelf, zodat dat niet meer blijft plakken.
    2. Het eigehalte uit de eierschaal halen
      1. Neem een 5 dagen oude bebroede eicel en breng deze over naar de voorgewarmde metalen eicelhouder (figuur 1A,B). Zorg ervoor dat u het ei in dezelfde richting houdt (d.w.z. de datum bovenaan).
        OPMERKING: Het is belangrijk om het ei in dezelfde richting te houden om de luchtzak en het embryo en CAM op dezelfde positie in de bovenkant van het ei te houden.
      2. Gebruik de puntige achterkant van een pincet (of iets dergelijks; Figuur 1E) om een kleine inkeping te maken op de bovenkant van het ei (waar de datum staat geschreven) (figuur 2A).
      3. Gebruik de puntige achterkant van het pincet om een tweede inkeping te maken aan de zijkant van het ei ongeveer 2/3 van het ei (figuur 2B).
        OPMERKING: Pas op dat u de inkeping niet te groot maakt en een gat maakt. Als er per ongeluk een gat ontstaat, sluit het gat dan af met tape en maak geen nieuwe inkeping.
      4. Gebruik het grotere pincet (figuur 1E) en haal een klein stukje eierschaal uit het ingesprongen gebied bovenop het ei (met geschreven datum). Zorg ervoor dat de luchtzak in de bovenkant van de eierschaal contact maakt met de lucht buiten het ei, maar dring niet te diep door de schaal.
        OPMERKING: Als de schaal te diep wordt gepenetreerd bij het maken van de bovenste inkeping, kunnen het embryo en CAM worden beschadigd en zal het embryo de verwijdering uit de schaal niet overleven. Het is belangrijk dat het kleine gaatje aan de bovenkant luchtcontact maakt tussen de binnen- en buitenkant van het ei. Als dit niet gebeurt, wordt er in de volgende stappen van de procedure een vacuüm gecreëerd dat ertoe zal leiden dat grote luchtbellen vast komen te zitten onder de CAM, waardoor het embryo en de CAM nutteloos worden. Om de positie van de luchtzak in het ei te controleren, kan een lichtbron worden gebruikt, omdat de positie niet altijd precies aan de bovenkant is en ook meer aan de zijkant kan zijn.
      5. Gebruik een spuit van 5 ml en een naald van 19 g om de schaal door het tweede streepje aan de kant 2/3 langs het ei te dringen en trek ~ 2 ml eiwit op (figuur 2C).
        OPMERKING: Zorg ervoor dat de naald naar de bodem van het ei wijst om de kans op beschadiging van het embryo en CAM te voorkomen. Deze stap creëert een grotere luchtzak in de bovenkant van het ei die nodig is voor het verwijderen van het eigehalte. Als er per ongeluk een gat is ontstaan in plaats van een inkeping in stap 1.2.2.3, prik dan de tape door met de naald om het eiwit op te nemen. Sluit de punctie opnieuw met een ander stuk tape.
      6. Haal de naald eruit en gebruik tape om de opening aan de zijkant af te dichten (figuur 2D).
        OPMERKING: Om te voorkomen dat eiwit uit het ei lekt, kan het bovenste gat met een vinger worden gesloten voordat de naald eruit wordt gehaald. Als eiwit blijft lekken met de tape al op zijn plaats, verwijder dan eerst het eiwit met een stukje tissue om ervoor te zorgen dat de tape goed blijft plakken.
      7. Leeg de spuit door het eiwit aan de weegboot toe te voegen.
      8. Gebruik het grote pincet (figuur 1E) om de kleine opening aan de bovenkant van het ei te vergroten (figuur 2E). Wanneer je door de opening aan de bovenkant in het ei kijkt, zijn het embryo en cam zichtbaar. Blijf het embryo en de CAM lokaliseren terwijl u zoveel mogelijk van de eierschaal wegneemt (figuur 2F).
        OPMERKING: Blijf het ei bewegen om maximaal zicht te houden op de positie van het embryo en cam in de schaal. Zorg ervoor dat de rand van de opening in de schaal niet lager wordt dan de CAM. Dring daarnaast niet door het binnenmembraan en voorkom scherpe randen.
      9. Draai na het maken van de opening het ei 180° en plaats het ei zo terug in de eihouder dat de ontstane opening aan de bovenkant van het ei nu naar beneden gericht is. Het embryo zal omhoog drijven en onzichtbaar worden vanaf de bodem (figuur 2G), wat 1-2 minuten duurt. Zorg ervoor dat het hele embryo en cam (inclusief alle vaten) zijn verdwenen en dat alleen dooier zichtbaar is voordat u doorgaat naar de volgende stap (figuur 2H).
        OPMERKING: Als het embryo na 2 minuten nog steeds zichtbaar is vanaf de bodem, draai het ei dan 1-2 minuten met de klok mee. Dit zal het embryo en CAM helpen om omhoog te drijven.
      10. Verwijder de tape uit de zijopening. Kijk of de binnenkant van het ei nu uit de onderste opening puilt. Als dit het geval is, gaat u verder met de volgende stap. Zo niet, gebruik dan de naald op de spuit om de opening aan de zijkant nogmaals te doorboren om het vacuüm in het ei vrij te maken. Zorg ervoor dat u met de naald naar boven wijst om de kans op het doorboren van de dooierzak te voorkomen. Ga door totdat het ei uit de onderste opening puilt.
      11. Terwijl u de bodem van het ei dicht bij de weegboot in de metalen weegboothouder houdt (figuur 1C,D), maakt u voorzichtig maar snel een horizontale kras in het membraan over de gehele breedte van de opening met behulp van een van de scherpe punten van het kleine pincet (figuur 1F) en laat u het eigehalte voorzichtig in de weegboot vallen (figuur 2I).
        OPMERKING: Als de ei-inhoud er niet uitkomt, gebruik dan de naald op de spuit om de zijopening opnieuw te doorboren met de naald naar boven gericht.
      12. Als het embryo zijwaarts in de weegboot ligt, gaat het meestal vanzelf omhoog. Als dit niet gebeurt, gebruik dan een stuk tissuepapier om het embryo te herpositioneren. Leg de ene kant van het tissuepapier op het embryo, sleep het tissuepapier naar het andere uiteinde en laat het tissuepapier los met een paar druppels van ~ 30 μL PBS (37 ° C) met behulp van een plastic Pasteur-pipet.
      13. Controleer visueel of het embryo in leven is door ervoor te zorgen dat de hartslag nog steeds aanwezig is, de CAM-vaten intact zijn en er geen bloeding is en er geen lekkage van dooier is. Als een van deze dingen niet correct is, gooi dan het embryo en CAM weg omdat het niet levensvatbaar zal zijn.
      14. Zorg ervoor dat het embryo en CAM op 37 °C worden gehouden en niet uitdrogen, want hierdoor zullen de CAM-vaten verslechteren en uiteindelijk zal het embryo sterven. Om dit te voorkomen, plaatst u regelmatig kleine druppels van ~ 30 μL van 37 ° C PBS op het embryo en CAM.
  3. Voorbereiding van 6 tot 7 dagen (144-168 uur) oude embryo's (HH stadium 28-32)22
    1. Voorbereiding van het werkgebied
      1. Bereid de fase voor zoals beschreven in punt 1.2.1.
    2. Het eigehalte uit de eierschaal halen
      1. Neem twee uur voor het experiment een 6 tot 7 dagen oud bebroed ei en draai het ei 180° in de couveuse zodat de bovenkant van het ei naar beneden is gericht. Draai het ei na 1 uur terug naar zijn oorspronkelijke positie en laat het nog 1 uur staan.
        OPMERKING: Door het ei 2 uur voorafgaand aan het experiment te draaien, wordt het gemakkelijker om het eigehalte uit de schaal te halen.
      2. Neem na het draaien het ei uit de couveuse.
      3. Voer stap 1.2.2.2 uit tot stap 1.2.2.4.
      4. Gebruik een spuit van 5 ml en een naald van 19 g om de schaal door het tweede streepje aan de kant 2/3 langs het ei te penetreren en trek tussen 5-6 ml eiwit op. Zorg ervoor dat de naald naar beneden wijst naar de bodem van het ei.
        OPMERKING: Met de spuit van 5 ml die we hebben gebruikt, is het mogelijk om tot 6 ml op te zuigen, zodat er slechts één penetratie nodig is.
      5. Haal de naald eruit en gebruik een stuk tape om de opening aan de zijkant af te dichten (figuur 2D).
      6. Leeg de spuit door het eiwit toe te voegen aan de ultrasone gel in de weegboot.
      7. Gebruik het grote pincet (figuur 1E) om de kleine opening aan de bovenkant van het ei te vergroten (figuur 2E). Probeer de opening zo groot mogelijk te maken maar zorg ervoor dat de rand van de opening in de schaal niet lager gaat dan de CAM. Dring daarnaast niet door het binnenmembraan en probeer scherpe randen te voorkomen.
      8. Vul een spuit met ~1 ml meer van 37 °C PBS dan het opgezogen volume tijdens stap 1.3.2.4.
      9. Verwijder de tape van de zijspleet, penetreer de opening met de gevulde spuit en leeg deze in de schaal. Zorg ervoor dat de naald naar beneden wijst naar de bodem van het ei.
        OPMERKING: Aangezien eiwit een hogere viscositeit heeft (~ 160 cP) 27 dan PBS (~ 1 cP), vermindert het vervangen van het eiwit door PBS zowel de spanning als de stress op het embryo en CAM terwijl het eigehalte uit de schaal wordt gehaald.
      10. Haal de naald eruit en sluit de opening snel opnieuw met een stuk tape (figuur 2D).
      11. Draai het ei 180° en plaats het ei zo terug in de eierhouder dat de ontstane opening aan de bovenkant van het ei nu naar beneden gericht is. Draai het ei met de klok mee totdat het hele embryo en CAM (inclusief alle vaten) zijn verdwenen en alleen dooier zichtbaar is.
      12. Voer stap 1.2.2.10 uit tot stap 1.2.2.14.
  4. Voorbereiding van 8-daagse (192 u) oude embryo's (HH stadium 32-35)22
    1. Voorbereiding van het werkgebied
      1. Warm een verwarmingsplaat op tot 37 °C.
      2. Plaats een metalen weegboothouder (figuur 1C,D) en een Erlenmeyer van 10 ml gevuld met PBS op de verwarmingsplaat.
      3. Neem een ondiepe container van 170 x 110 x 70 mm, of iets dergelijks, en vul de container met 1 L van 37 °C PBS.
      4. Plaats een weegboot (85 × 85 × 25 mm) in een petrischaaltje met een diameter van 90 mm. Plaats de petrischaal en de weegboot op de bodem van de container en zorg ervoor dat ze volledig onder water staan.
    2. Het eigehalte uit de eierschaal halen
      1. Neem twee uur voor het experiment een 8 dagen oud bebroed ei en draai het ei 180° in de broedmachine zodat de bovenkant van het ei naar beneden is gericht. Draai het ei na 1 uur terug naar zijn oorspronkelijke positie en laat het nog 1 uur staan.
        OPMERKING: Door het ei 2 uur voorafgaand aan het experiment te draaien, wordt het gemakkelijker om het eigehalte uit de schaal te halen.
      2. Neem een 8 dagen oud bebroed ei uit de couveuse.
      3. Houd het ei horizontaal en gebruik de puntige achterkant van het grote pincet (figuur 1E) om een kleine inkeping 1/2 van het ei te maken. Ga door met het maken van kleine inkepingen in een ringpatroon 360° rond de eierschaal. Gebruik een afstand van ~10 mm tussen de inspringingen.
        OPMERKING: Tijdens deze procedure kunnen zich kleine scheuren tussen de inkepingen beginnen te vormen.
      4. Nadat je de kleine inkepingen rondom de schaal hebt gemaakt, maak je een groter gat door de schaal tussen twee kleine inkepingen te kraken met behulp van de puntige achterkant van het grote pincet.
      5. Dompel het ei volledig onder in de PBS van 37 °C en houd het gedurende 5 minuten ondergedompeld. Houd het ei na 5 minuten dicht bij de weegboot in de container. Steek de bovenkant van beide duimen in het grote gat en open voorzichtig het ei. Het ei zal langs de kleine inkepingen barsten.
      6. Wanneer de scheur helemaal rond de eierschaal is gevormd, probeer dan voorzichtig de twee eierschaalstukken uit elkaar te trekken en blijf de twee stukken voorzichtig heen en weer bewegen totdat de ei-inhoud van de schaal is gescheiden. Laat vervolgens het eigehalte voorzichtig in de weegboot vallen.
        OPMERKING: Door de twee stukken eierschaal heen en weer te bewegen, zal er meer PBS in de eierschaal stromen, wat zal helpen bij het scheiden van de ei-inhoud van de schaal. Soms blijft er een beetje eiwit aan de binnenkant van de eierschaal plakken. Wanneer dit gebeurt, gebruik dan het pincet om het eiwit van de schaal te scheiden.
      7. Til langzaam de petrischaal met het weegboot- en eigehalte van de PBS op. Wanneer u uit de PBS komt, kantelt u de weegboot iets om de overtollige PBS te verwijderen.
      8. Plaats de weegboot met het eigehalte in de metalen weegboothouder en ga naar de gewenste experimentele opstelling.

2. Geselecteerde toepassingen

  1. Injecteren van microbubbels en/of andere oplossingen in de CAM-vaten
    1. De injectie-instelling voorbereiden
      1. Trek glazen naalden uit glazen capillaire buizen met behulp van een microsmederij (figuur 3A) of koop getrokken glazen capillaire naalden.
      2. Als de punt van de glazen capillaire naald niet is afgeschuind, breekt u een klein deel van de punt van de naald af. Vul de glazen naald met minerale olie en plaats deze in een micro-injectiesysteem. Zorg ervoor dat er geen luchtbellen in de minerale olie in de glazen naald zitten.
        OPMERKING: De minerale olie wordt toegevoegd volgens de instructies van de fabrikant van het injectiesysteem dat we hebben gebruikt.
      3. Leeg de capillaire naald van getrokken glas voor zover het micro-injectiesysteem dit toelaat en vul de glazen naald gedeeltelijk opnieuw met lucht.
        OPMERKING: Het kleine beetje lucht voorkomt het mengsel van de minerale olie en de te injecteren oplossing.
      4. Doe 10 μL van de gewenste oplossing, in dit protocol microbubbels, op een stuk wasachtige film (figuur 3B). Als er meer dan één oplossing nodig is, kunnen oplossingen worden gemengd voordat ze worden gepipetteerd7.
        OPMERKING: Voordat u de naald met microbubbels vult, laat u de microbubbeldruppel ~1 minuut op de wasachtige film zitten, zodat de microbubbels naar de top van de druppel drijven en geconcentreerd worden. Voor het F-type op maat gemaakt ultrasoon contrastmiddel28 zal deze concentratiestap de te injecteren microbubbelconcentratie met ~ 30% verhogen. De post-injectieconcentratie in het kippenembryobloed ligt tussen 32 x 103 microbubbels/μL voor 5 dagen oude embryo's en 19 x 103 microbubbels/μL voor 6 dagen oude embryo's.
      5. Vul de glazen naald met de microbubbel en/of andere oplossing door de glazen naaldpunt in de druppel op de wasachtige film te plaatsen. Wanneer u microbubbels aspirateert, zorg er dan voor dat u de naaldpunt in de bovenkant van de vloeistofdruppel plaatst om de met microbubbel verrijkte oplossing te aspirateren.
        OPMERKING: Voordat u microbubbels injecteert, verhoogt u de punt van de glazen naald naar het hoogste punt en wacht u ~ 2 minuten. Dit zorgt ervoor dat de microbubbels zich concentreren in de punt van de glazen naald.
  2. Injectie in de CAM-vaten
    1. Kijk vóór de injectie naar de CAM onder een stereomicroscoop en selecteer het beste vat om te injecteren. Injecteer altijd in een van de aderen van het embryo. Dit zijn de vaten waarin de bloedstroom naar het embryo beweegt. Aderen zijn lichter van kleur dan de slagaders vanwege het zuurstofrijke bloed29. Bovendien bevinden aderen zich altijd bovenop de slagader, met twee uitzonderingen, namelijk de voorste en achterste vitellijnaders (d.w.z. de minder vertakte aderen, aangegeven met sterretjes in figuur 6A, B) die geen slagader in hun omgeving hebben.
      OPMERKING: Injecteren in een van de takken zal de obstructie van de bloedstroom tijdens de injectie beperken. Goede injectieplaatsen zijn aangegeven met pijlpunten in figuur 6A,B. Het is cruciaal om in de ader te injecteren, omdat dit de geïnjecteerde stof zal dwingen om naar het embryo te stromen. Daarnaast zal het injecteren in de slagader resulteren in een enorme bloeding bij het verwijderen van de glazen naald die het embryo zal doden.
    2. Plaats de glazen naald en het embryo zo dat de glazen naaldpunt en de geselecteerde ader zich in hetzelfde brandpuntsvlak en in dezelfde richtingslijn bevinden. Probeer de naald zo horizontaal mogelijk parallel aan de geselecteerde ader te plaatsen. De punt van de naald moet de vaatwand raken.
      LET OP: Door de glazen naald zo horizontaal mogelijk te plaatsen, is de kans om door het hele vat te prikken kleiner.
    3. Ga na het positioneren langzaam vooruit en penetreer de vaatwand met de glazen naald. Tijdens de penetratie wordt de CAM eerst weggeduwd door de beweging van de glazen naald. Blijf de glazen naald naar voren schuiven totdat de vaatwand is doorboord.
      OPMERKING: Als per ongeluk het vat door en door wordt doorboord, trek dan langzaam de naald in om terug in het lumen te komen. Wanneer u weer in het lumen bent, tilt u de naald iets op en beweegt u langs het vat naar voren om de naald te verplaatsen.
    4. Trek na penetratie de glazen naald iets in om de punt beter in het lumen van het vat te positioneren en beweeg de glazen naald zijwaarts om te controleren of deze niet aan de vaatwand is bevestigd. Injecteer langzaam een kleine hoeveelheid van de oplossing om te bevestigen dat de punt zich in het lumen van het vat bevindt (figuur 3C).
    5. Zorg ervoor dat de geïnjecteerde oplossing de bloedstroom volgt. Als dit niet het geval is, beweegt u de glazen naald iets en blijft u kleine hoeveelheden injecteren totdat de glazen naald correct is geplaatst17.
    6. Wanneer de gewenste hoeveelheid wordt geïnjecteerd, laat u de glazen naald in het vat gedurende ~ 15 s om een massale bloeding te voorkomen. Beweeg vervolgens de glazen naald een beetje zijwaarts, op en neer en een paar keer heen en weer om een voorzichtige intrekking van de glazen naald mogelijk te maken.
      OPMERKING: Sommige bloedingen zijn normaal. Gebruik voor elke injectie een nieuwe glazen naald omdat de glazen naald gemakkelijk verstopt raakt met en stomp van eiwit.
  3. Microscopie beeldvorming van het embryo en/of CAM-vaten
    1. Voorbereidingshouder met akoestisch membraan
      1. Neem een celkweekkamer bestaande uit een vierkante plastic houder met twee parallelle 50 μm dikke akoestisch transparante polycarbonaatmembranen26, verder aangeduid als houder met akoestisch membraan. Sluit beide poorten met een deksel.
      2. Gebruik een scalpel om een van de twee membranen van de houder met akoestisch membraan te verwijderen.
        OPMERKING: Om het membraan te verwijderen, snijdt u het membraan net naast de lijmlijn op het plastic. Zorg ervoor dat u niet van de rand afglijdt om schade aan het andere membraan te voorkomen.
      3. Bereid ~15 ml van 2% agarose in demi wateroplossing door te verwarmen tot tussen 80-95 °C in een klein glazen bekerglas. Koel het glazen bekerglas met de opgeloste agarose-oplossing onder een stromende koudwaterkraan.
        OPMERKING: Als de agarose te heet is, zal het akoestische membraan smelten, waardoor een ongelijk oppervlak ontstaat.
      4. Wanneer de oplossing is afgekoeld tot ongeveer 37 °C, giet u de oplossing langzaam in de houder met akoestisch membraan totdat deze de hele houder vult. Kantel de houder met akoestisch membraan iets zodat de agaroselaag gelijkmatig in het kunststof frame wordt verdeeld (figuur 4A). Zorg ervoor dat de agaroselaag vlak is en laat de agarose op kamertemperatuur zetten.
    2. Embryo en CAM uit dooierzak verwijderen en op houder met akoestisch membraan plaatsen
      1. Haal het eigehalte uit het ei zoals beschreven in rubriek 1.2, 1.3 of 1.4.
      2. Injecteer de CAM indien nodig met microbubbels en/of andere oplossing(en) zoals beschreven in rubriek 2.1.2.
      3. Vul een petrischaaltje van 1 L met ~500 ml van 37 °C PBS en plaats de houder met akoestisch membraan met agarose op de bodem van de schotel. Zorg ervoor dat de agaroselaag naar boven is gericht.
      4. Gebruik een kleine schaar om snel in het membraan van de dooierzak, ook wel Vitellus-membraan genoemd, rond de hele CAM te snijden terwijl het eigehalte zich in de weegboot bevindt (figuur 4B). Houd de schaar in dezelfde positie en draai de weegboot tijdens het snijden voor een betere precisie en meer snelheid.
        OPMERKING: Vanaf het moment dat de eerste snede is gemaakt, begint de dooier te lekken. Dit vermindert de zichtbaarheid van het embryo en CAM. Probeer helemaal rond de CAM te snijden binnen 6-7 sneden. Dit mag niet veel langer duren dan 20 s. Het kleine pincet (figuur 1F) kan worden gebruikt om de rand van het vitellinemembraan vast te houden en te voorkomen dat in de CAM wordt gesneden.
      5. Gebruik een eetlepel om het uitgesneden membraan met het embryo en CAM uit de weegboot te scheppen. Til de lepel langzaam op van de weegboot en inspecteer visueel of het uitgesneden membraan met het embryo en CAM nog steeds aan het resterende dooierzakmembraan zijn bevestigd. Wanneer dit het geval is, gebruik dan de schaar om een extra knipbeurt te maken. Kantel de lepel tijdens het scheppen iets om zoveel mogelijk dooier kwijt te raken, maar laat het niet uitdrogen. Breng het uitgesneden membraan met het embryo en cam over in de petrischaal van 1 L, dompel het onder in de PBS van 37 °C en verwijder de lepel.
      6. Wanneer het membraan met het embryo en de CAM is ondergedompeld in de PBS van 37 °C, gebruikt u het kleine pincet (figuur 1F) om een rand van het membraan te pakken en voorzichtig rond het membraan te draaien om de dooier die nog vastzit te verwijderen.
      7. Wanneer alle dooier is verwijderd, gebruikt u het kleine pincet om het membraan met het embryo en CAM te verplaatsen en boven de houder met akoestisch membraan te plaatsen.
      8. Gebruik een insectenspecimenspeld om het membraan met het embryo en CAM in een hoek vast te pinnen. Vermijd het doorboren van de vaten in de CAM en pin alleen het membraan vast.
      9. Gebruik een tweede insectenspecimenspeld om het membraan met het embryo en CAM op de diagonaal tegenoverliggende hoek vast te pinnen.
      10. Til de houder met het akoestische membraan met het embryo en de CAM langzaam op van de PBS van 37 °C. Kantel de houder iets om het grootste deel van de PBS kwijt te raken.
      11. Gebruik het kleine pincet (figuur 1F) om het membraan met het embryo en cam uit te rekken en gelijkmatig te verdelen over de houder met akoestisch membraan en de rest van het membraan vast te pinnen. Zorg ervoor dat het membraan met het embryo en cam iets is uitgerekt om er zeker van te zijn dat het vlak is (figuur 4C).
      12. Plaats de houder met akoestisch membraan met het vastgepinde membraan dat het embryo en cam bevat in een microscopieopstelling die op 37 °C wordt gehouden.
      13. Plaats een coverslip of een akoestisch en optisch transparant membraan (afhankelijk van het gewenste doel en gebruik van echografie of niet) bovenop het interessegebied op het embryo of CAM (figuur 4D) om optische visualisatie mogelijk te maken.
  4. Echografie van het kippenembryo en/of CAM-vaten
    1. Echografie van de zijkant van het kippenembryo en CAM-vaten
      1. Verwijder het eigehalte zoals beschreven in rubriek 1.2, 1.3 of 1.4. Gebruik echter geen standaard weegboot. Gebruik in plaats daarvan een op maat gemaakte weegboot met één akoestisch transparante wand.
        OPMERKING: De standaard weegboot werd aangepast door één kant van de weegboot af te snijden en te vervangen door een venster van polyesterfolie dat met epoxylijm aan elkaar was gelijmd.
      2. Dompel de gewenste ultrasone transducer onder in een waterbad van 37 °C en plaats deze op de gewenste plek met de vereiste afstand.
      3. Plaats de weegboot zo in het waterbad dat de transparante wand naar de transducer is gericht. Zorg ervoor dat de weegboot diep genoeg is om op gelijke hoogte te staan met de transducer, maar voorkom dat er water in de weegboot komt (figuur 5A).
      4. Voeg desgewenst een andere opstelling toe aan de bovenkant van de embryo- of CAM-vaten, zoals een microscoop of een laser (figuur 5A).
    2. Echografie van de bovenkant van de embryo- en CAM-vaten zonder akoestische interferentie
      1. Vul een bekerglas van 2 L met 37 °C PBS. Leg een bekerglas van 500 ml ondersteboven op de bodem van het bekerglas van 2 L. Vermijd lucht in het bekerglas van 500 ml.
        OPMERKING: Het bekerglas van 500 ml is bedoeld om de weegboot met het eigehalte dichter bij het PBS-oppervlak te brengen. Door het bekerglas te vervangen door objecten door andere maten, kan de afstand tussen de transducer en het eigehalte worden gevarieerd.
      2. Plaats het gevulde bekerglas van 2 L met het bekerglas van 500 ml erin in een waterbad van 37 °C.
      3. Verwijder het eigehalte zoals beschreven in rubriek 1.2, 1.3 of 1.4.
      4. Maak het eigehalte nat met 37 °C PBS en bedek het embryo met heldere vershoudfolie. Dit kan worden gedaan om het embryo in dezelfde positie te houden en te voorkomen dat het draait of wegdrijft.
        OPMERKING: Door het eigehalte nat te maken met PBS, wordt het minder plakkerig, waardoor het gemakkelijker wordt om het eigehalte te bedekken met heldere vershoudfolie.
      5. Plaats de weegboot met het eigehalte in een petrischaal met een diameter van 90 mm en dompel de petrischaal langzaam onder in de PBS (figuur 5B).
        OPMERKING: Het gebruik van twee klemmen aan de zijkanten van de petrischaal tegenover elkaar maakt het gemakkelijker om de petrischaal onder te dompelen.
      6. Plaats de ultrasone transducer met de gewenste afstand.
    3. Echografie van het kippenembryo en CAM-vaten met een beweegbare transducer
      1. Verwijder het eigehalte zoals beschreven in rubriek 1.2, 1.3 of 1.4.
      2. Bereid een 2% agarose oplossing in demi water door de oplossing te verwarmen tot tussen 80-95 °C in een klein glazen bekerglas. Koel het glazen bekerglas af met de opgeloste agarose-oplossing onder een stromend koudwaterlipje.
      3. Giet de agarose-oplossing in een platte container om een ongeveer 1 mm dik agarose-pad te maken. Wanneer volledig afgekoeld en ingesteld, snijdt u de agarose pad op de gewenste grootte met behulp van een scalpel.
        OPMERKING: De dikte van de agarose pad kan worden gewijzigd om de gewenste brandpuntsafstand te verkrijgen die nodig is voor een correcte werking van de ultrasone transducer.
      4. Plaats het agarose-kussen bovenop het embryo en CAM (figuur 5C). Voeg een paar druppels van ~ 30 μL van 37 °C PBS toe aan de bovenkant van de agarose pad om een dunne PBS-laag te creëren tussen de agarose pad en de transducer.
        OPMERKING: Als u PBS gebruikt, voorkomt u dat de transducer aan de agarose-pad blijft kleven. Dit is gunstig wanneer bijvoorbeeld een motor wordt gebruikt om een tweedimensionale transducer mechanisch te bewegen om een driedimensionale scan te maken (figuur 9B)11. Wanneer de transducer niet hoeft te worden verplaatst, kan de PBS ook worden vervangen door ultrasone gel.
      5. Plaats de gewenste ultrasone transducer.

Resultaten

In dit protocol beschrijven we drie methoden om het eigehalte uit de schaal te halen op dag 5-8 van de incubatie (HH 26-3522). Figuur 6 toont het eigehalte in weegboten nadat het uit de schaal is gehaald. Het 5 dagen oude embryo en CAM (figuur 6A) werden verwijderd volgens de in rubriek 1.2 beschreven methode. De embryo's van 6 en 7 dagen oud en CAM (figuur 6B,C) werden verwijderd volgens de in rubriek 1.3 beschreven methode. Het 8 dagen oude embryo en CAM (figuur 6D) werden verwijderd volgens de in rubriek 1.4 beschreven methode. Er kan geen bloeding of schade aan het embryo of CAM worden waargenomen, wat aangeeft dat deze methoden kunnen worden gebruikt om het eigehalte veilig uit de schaal te krijgen zonder het embryo of de CAM-vaten te beschadigen. Indien correct uitgevoerd, zal de methode voor de 5-dagen oude embryo's een levensvatbaar embryo en intacte CAM bieden in 90% van alle procedures. De levensvatbaarheid is gebaseerd op het totale aantal bevruchte eieren dat met succes uit de eierschaal is geëxtraheerd. Met de tweede methode, voor 6 en 7-daagse bebroede eieren, is de kans op een levensvatbaar embryo en intacte CAM ongeveer 75% voor 6-dagen oude en ongeveer 50% voor 7-daagse oude. Met de derde methode beschreven voor 8-dagen oude embryo's, is de kans op een levensvatbaar embryo en intact CAM ongeveer 60%. Verschillen in ontwikkelingsstadia tussen de 5- en 8-daagse embryo's kunnen worden waargenomen, wat overeenkomt met Hamburger en Hamilton22. Zowel de grootte van het embryo als de complexiteit van de CAM-vaten nemen toe tijdens de ontwikkeling (figuur 6A-D). Figuur 6C toont een dunne vlek van agarose bovenop het eigehalte waarmee het embryo en CAM in beeld kunnen worden gebracht met behulp van de ultrasone opstelling in figuur 5C. Nadat het eigehalte uit de schaal is gehaald, is de hartslag van het embryo met het blote oog zichtbaar. De hartslag van deze ex ovo embryo's is vergelijkbaar met in ovo embryo's bij 183 slagen per minuut (bpm) op dag 5 tot ~208 bpm op dag 830. Wanneer het embryo bevochtigd en bij 37 °C wordt gehouden, zal het deze hartslag gedurende ~ 5 uur handhaven in de experimentele echografie-opstellingen.

Meerdere complicaties kunnen optreden tijdens de eerder beschreven drie methoden. Figuur 7A toont opgesloten lucht onder de CAM waardoor het embryo ongeschikt is voor echografie en de druk van de luchtbel(s) kan ook het embryo en/of CAM beschadigen. Dit probleem ontstaat wanneer de luchtzak in de schaal geen contact maakt met de lucht buiten de schaal bij het verwijderen van het eigehalte uit de schaal. Figuur 7B toont een kleine lekkage van dooier uit de dooierzak in de rechterbovenhoek van de afbeelding. Dit kan gebeuren tijdens het verwijderen van het eigehalte uit de schaal wanneer de dooierzak beschadigd raakt door scherpe randen van de schaal of wanneer de dooierzak wordt gepenetreerd door het pincet. Lekkage van de dooier kan de zichtbaarheid van het embryo en de CAM-vaten beïnvloeden. Figuur 7C toont een embryo waarin een luchtbel gevangen zit onder de CAM. Dit komt soms voor in de embryonale ontwikkeling. Een andere complicatie die kan optreden is schade aan de vaten. Deze schade kan worden veroorzaakt tijdens het verwijderen van het eigehalte uit de schaal of bij het uitvoeren van een injectie (figuur 7D). Daarnaast kunnen het embryo en de vaten na verloop van tijd ook uitdrogen (figuur 7E). Dit gebeurt wanneer het eigehalte niet wordt besprenkeld met PBS. Het uitdrogen van het embryo kan leiden tot enorme capillaire obstructies (figuur 7F) die de levensvatbaarheid van het embryo beïnvloeden. De massieve capillaire obstructies kunnen ook optreden tijdens de ontwikkeling of wanneer de hartslag van het embryo niet stabiel is.

Nadat het eigehalte zonder enige complicatie uit de schaal is gehaald, kan het embryo worden geïnjecteerd met bijvoorbeeld ultrasone contrastmiddelen zoals microbubbels (figuur 3C). Figuur 8 toont circulerende microbubbels in het lumen van het bloedvat bij injectie. Deze microbubbels worden meegevoerd met de bloedstroom en blijven enkele uren aanwezig in de bloedcirculatie (Aanvullende video 1). De aanwezigheid van deze microbubbels in de circulatie creëert de mogelijkheid om verschillende soorten CEUS- en medicijnafgifte-experimenten uit te voeren 7,11,12. De CAM is ideaal om nieuwe ultrasone contrastdetectiemethoden te onderzoeken waarvoor we drie voorbeelden laten zien. Figuur 9A toont hoogfrequente echografie subharmonische beeldvorming van een 6 dagen oud kippenembryo in B-Mode en CEUS voor en na microbubbelinjectie. Hier werden de CAM-vaten geïnjecteerd met 5 μL ultrasoon contrastmiddel en werd beeldvorming uitgevoerd met een preklinisch dierlijk echoapparaat met een MS250-sonde (30 MHz zenden en 15 MHz ontvangen frequentie, 10% vermogen). Vóór microbubbelinjectie is contrast al te zien in het embryonale hart in de B-Mode-beelden (figuur 9A-I). Dit fenomeen is te wijten aan de aanwezigheid van een kern in de vogelrode bloedcel die het contrast van bloed in echografie verhoogt 5,31. De toevoeging van de microbubbels verhoogde het contrast en de zichtbaarheid van het embryo, zowel in de B-Mode als ceus beeldvorming. Figuur 9B toont een optisch en een hoogfrequent 3D subharmonisch beeld van een 6 dagen oud embryo en de omliggende vaten. De CAM werd geïnjecteerd met 5 μL ultrasoon contrastmiddel en beeldvorming werd uitgevoerd met een preklinisch dierlijk echoapparaat met MS550s-sonde (zendfrequentie van 40 MHz, pieknegatieve druk ~ 300 kPa). Deze resultaten tonen aan dat de CEUS-beeldvorming in combinatie met een contrastmiddel ook kan worden gebruikt om hoogfrequente 3D-subharmonische beelden te maken en de bloedvaten buiten het embryo in beeld te brengen. Figuur 9C toont een optisch beeld en een ultraharmonisch intravasculair echografie (IVUS) beeld gemaakt met een aangepaste sonde van CAM-microvessels van een 6 dagen oud embryo (26 MHz zend- en 39- en 65 MHz-ontvangstfrequentie). CAM-vaten werden geïnjecteerd met 4 ± 1 μL ultrasoon contrastmiddel. De optische afbeelding en ivus-afbeelding zijn afkomstig uit hetzelfde embryo en hetzelfde interessegebied met overeenkomstige vaatnetwerken.

Het kippenembryo en cam-vaten kunnen ook worden gebruikt om echo-gemedieerde medicijnafgifte te onderzoeken, waarvan we een voorbeeld laten zien. Omdat de dooier het lichtpad tijdens beeldvorming belemmert, is het verwijderen van de dooierzak noodzakelijk om de medicijnafgifte in de embryo- en CAM-vaten optisch te onderzoeken. Voor dit onderzoek werden het embryo en cam voorbereid op microscopische beeldvorming zoals uitgelegd in rubriek 2.2 door het membraan met het embryo en CAM te scheiden van de dooierzak (figuur 4C). Bij deze embryo's is de hartslag stabiel rond de 80 bpm en blijven de embryo's tot 2 uur in leven wanneer ze op 37 °C7 worden gehouden. Figuur 10 toont een echografie en microbubbel gemedieerde drug delivery studie in endotheelcellen van de CAM-vaten. Lipide-gecoate microbubbels, gericht op de vvatwand met behulp van αvβ3-antilichamen en gekleurd met de fluorescerende kleurstof DiI7, werden geïnjecteerd in de CAM-vaten (figuur 10A, C). CAM-vat endotheelcelkernen werden gekleurd met Hoechst 33342 (figuur 10B) en het modelgeneesmiddel Propidiumjodide (PI) werd gebruikt om sonoporatiete visualiseren 7. Beide kleurstoffen werden gelijktijdig met de microbubbels geïnjecteerd. Bij ultrasone behandeling (1 MHz, 200 kPa piek negatieve druk, enkele uitbarsting van 1000 cycli), werd PI-opname waargenomen in de kernen die zich het dichtst bij de beoogde microbubbels bevinden (figuur 10D). Dit toont aan dat de ultrageluid-geïnduceerde oscillaties van de beoogde microbubbels in staat waren om een porie in het endotheelcelmembraan te creëren.

figure-results-1
Figuur 1. Embryovoorbereidingsapparatuur. (A-B) boven- en zijaanzicht van de metalen eierhouder en (C-D) boven- en zijaanzicht van de metalen weegboothouder. (E-F) pincet nodig om het eigehalte uit de schaal te halen. Schaal in cm. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

figure-results-2
Figuur 2. Embryoverwijderingsprocedure. (A) Kleine inkeping bovenop het ei, aangegeven door de zwarte cirkel. (B) Klein streepje 2/3 van het ei, aangegeven door de zwarte cirkel. (C) Het opzuigen van ~2 ml eiwit. (D) Afgedichte opening aan de zijkant met tape. (E) Het vergroten van de kleine opening aan de bovenkant van het ei. (F) Het embryo wordt zichtbaar na het verwijderen van een deel van de schaal. (G-H) Na het 180° draaien van het ei drijft het embryo omhoog en wordt onzichtbaar (pijlen geven de bewegende richting van het embryo aan). Na 1-2 minuten is het embryo onzichtbaar vanaf de bodem. (I) Na het krabben aan het membraan daalt het eigehalte in de weegboot. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

figure-results-3
Figuur 3. Injectie van microbubbels in de CAM-vaten. (A) Glazen capillaire naald. Schaal in cm. (B) Propidiumjodide (PI) oplossing (linker druppel) en microbubbels (rechter druppel) voorafgaand aan aspiratie vóór injectie. Naald (zwart omlijnd) is te zien in de rechterbovenhoek (C) Microbubble-injectie. De capillaire naaldpunt bevindt zich in het lumen van een van de aderen (links). Microbubbels, de witte wolk aangegeven met een pijl, worden geïnjecteerd en verspreiden zich na de bloedbaan (rechts). Schaalbalk staat voor 1 mm. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

figure-results-4
Figuur 4. Embryo en CAM uit dooierzak verwijderen en op houder met akoestisch membraan plaatsen. (A) Houder met akoestisch membraan gevuld met agaroselaag. (B) Kippenembryo en CAM-vat in weegboot voordat ze worden gesneden. Stippellijn geeft de snijlijn rond de CAM aan. (C) Kippenembryo en CAM gescheiden van dooier en vastgepind op akoestisch membraan. (D) Vastgepind kippenembryo met een akoestisch en optisch transparant membraan in een houder (blauw) bovenop de CAM. De houder kan worden gevuld met demi water, zodat een waterdompeldoel kan worden gebruikt. Alle schaalbalken vertegenwoordigen 1 cm. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

figure-results-5
Figuur 5. Verschillende opstellingen voor kippenembryo en CAM-echografie. (A) Installatie voor echografie vanaf de zijkant. Kippenembryo werd in een op maat gemaakte weegboot met één akoestisch transparante wand geplaatst en in een waterbad van 37 °C geplaatst. De ultrasone transducer werd aan de linkerkant (a) naast de akoestisch transparante wand geplaatst en de laser (b) voor fotoakoestische beeldvorming bovenop. (B) Installatie voor echografie vanaf de bovenkant. Embryo en CAM werden ondergedompeld in een beker pbs die in een waterbad van 37 °C werd geplaatst. De stippelvormige omtrek toont het glazen bekerglas van 2 L (a) met het glazen bekerglas van 500 ml (b) erin. (C) Installatie voor ultrasone beeldvorming vanaf de bovenkant met een beweegbare transducer. Een dunne agarose pad (stippellijn) werd bovenop het embryo geplaatst met een dunne laag PBS als koppeling tussen de transducer en het agarose oppervlak. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

figure-results-6
Figuur 6. Eigehalte buiten de schaal. (A) Het eigehalte dat na 5 dagen incubatie uit de schaal wordt gehaald. Het chorioallantoïsche membraan (CAM), het embryolichaam (EB), de voorste en achterste vitelline-aderen (*) en geschikte injectieplaatsen (pijlpunten) zijn aangegeven. (B) Het eigehalte dat na 6 dagen incubatie uit de schaal wordt gehaald. De voorste en achterste vitelline-aderen (*) en geschikte injectieplaatsen (pijlpunten) worden aangegeven. C) Het eigehalte dat na 7 dagen incubatie uit de schaal wordt gehaald. Een stukje agarose wordt bovenop geplaatst om echografie mogelijk te maken. De hoeken van de agarose patch worden aangegeven met zwarte cirkels. (D) Het eigehalte dat na 8 dagen incubatie uit de schaal wordt gehaald. Alle schaalbalken vertegenwoordigen 1 cm. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

figure-results-7
Figuur 7. Complicaties die kunnen optreden tijdens de procedures met het kippenembryo en CAM-model. (A) Luchtbellen die onder de CAM zijn opgesloten bij het verwijderen van het eigehalte uit de schaal met behulp van methode 1.2 (5 dagen oud embryo) of 1.3 (embryo van 6 tot 7 dagen oud). (B) Kleine lekkage van dooier aangegeven met een pijl rechtsboven (6 dagen oud embryo). (C) Lucht gevangen onder de CAM, aangegeven door de zwarte stippelcirkel (7 dagen oud embryo). (D) Bloeding, aangegeven met de zwarte pijlen (5 dagen oud embryo. (E) Uitgedroogd embryo en CAM (5 dagen oud embryo). (F) Massieve capillaire obstructies (5 dagen oud embryo). Alle schaalbalken vertegenwoordigen 1 cm. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

figure-results-8
Figuur 8. Microbubbels in CAM-bloedvat. De vaatwand wordt aangegeven met een stippellijn en enkele microbubbels worden aangegeven met pijlen. De schaalbalk vertegenwoordigt 20 μm. De bijbehorende microscopie-opname is te vinden in Aanvullende video 1. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

figure-results-9
Figuur 9. Contrastverbeterde echografie in kippenembryo's en CAM-vaten. (A) Maximale intensiteitsprojectie van B-Mode (I, III) en real-time subharmonische (II, IV) beelden (preklinisch dierlijk echoapparaat met MS250-sonde, 30 MHz zend- en 15 MHz ontvangstfrequentie, 10% vermogen) van een 6 dagen oud embryo met een pleister agarose erop. Bovenste beelden (I, II) tonen resultaten voor en onder (III, IV) na injectie van 5 μL ultrasoon contrastmiddel. Schaalbalk staat voor 1 mm. Deze afbeelding is aangepast met toestemming van Daeichin et al. 201511 (B) Optische (links) en 3D subharmonische beeldvorming (rechts) van een 6 dagen oud kippenembryo met daarop een stukje agarose. CAM-vaten werden geïnjecteerd met 5 μL echoscopisch contrastmiddel en beeldvorming werd uitgevoerd met een hoogfrequente sonde (preklinisch dierlijk echoapparaat met MS550s-sonde, transmissiefrequentie van 40 MHz, piekonderdruk ~ 300 kPa, weergegeven in preklinische dierlijke echografiemachine 3D-modus). Schaalbalk staat voor 5 mm. Deze afbeelding is aangepast met toestemming van Daeichin et al. 201511. (C) Optisch beeld (links) en gemiddelde intensiteitsprojectie van ultraharmonische intravasculaire echografie (IVUS) (rechts) van de CAM-microvasculatuur van een 6 dagen oud embryo. CAM-vaten werden geïnjecteerd met 4 ± contrastmiddel van 1 μL. Ultraharmonische IVUS-beeldvorming werd uitgevoerd met een aangepaste IVUS-sonde (zendfrequentie 35 MHz, piekonderdruk 600 kPa). Beide beelden zijn gemaakt van hetzelfde embryo en dezelfde regio van belang. Pijlen geven overeenkomstige vaten aan in de twee afbeeldingen. Schaalbalk staat voor 1 mm. Deze afbeelding is aangepast met toestemming van Maresca et al. 201412. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

figure-results-10
Figuur 10. Medicijnafgifte aan CAM-vat endotheelcellen in 6 dagen oud embryo. (A) Brightfield-afbeelding van zes αvβ3-gerichte microbubbels, aangegeven met witte pijlen, die zich vóór de ultrasone behandeling aan de vaatwand hechten. (B) Endotheelcelkernen fluorescerend gekleurd vóór ultrasone behandeling. (C) Fluorescerend beeld van de gekleurde gerichte microbubbels, aangegeven met witte pijlen, vóór ultrasone behandeling. (D) Opname van het modelgeneesmiddel propidiumjodide (PI) in de celkernen onder de beoogde microbubbels na ultrasone behandeling (1 MHz, 200 kPa piek negatieve druk, enkele uitbarsting van 1000 cycli). De schaalbalk vertegenwoordigt 10 μm en is van toepassing op alle afbeeldingen. Deze afbeelding is aangepast met toestemming van Skachkov et al. 20147. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

AANVULLENDE BESTANDEN

Aanvullende video 1. Microbubbels in CAM-bloedvat. Schaalbalk staat voor 20 μm. Klik hier om deze video te downloaden.

Discussie

Dit protocol beschrijft drie methoden voor het verkrijgen en gebruiken van 5 tot 8 dagen oude kippenembryo's en hun CAM als een in vivo model om contrastverbeterde echografie en microbubbel-gemedieerde medicijnafgifte te bestuderen. De meest kritieke stappen voor het nemen van 5 dagen oude (sectie 1.2) en 6 tot 7 dagen oude (sectie 1.3) embryo's uit de schaal zijn: 1) maak het kleine gaatje in de bovenkant van het ei om door de hele eierschaal in de luchtzak te gaan voordat eiwit wordt teruggetrokken; 2) maak gladde randen voor de grote opening in de schaal. Voor de methode om 8 dagen oude embryo's uit de schaal te halen (rubriek 1.4) zijn de meest kritische stappen: 1) Maak voldoende inkepingen om een mooie scheur langs het ei te creëren; 2) Houd het ei ondergedompeld in PBS. Om de levensvatbaarheid van het embryo voor alle methoden te garanderen, is het belangrijk om het ei en de inhoud ervan op 37 °C te houden. Vermijd bovendien injecteren in een CAM-slagader. Het visueel controleren van de hartslag van het embryo tijdens de studies wordt aanbevolen om de vitaliteit van het embryo te garanderen. Om het exacte ontwikkelingsstadium van het embryo te bevestigen, kan de indicatie Hamburger &Hamilton22 worden gebruikt.

Het is belangrijk om schade aan het embryo, CAM en dooierzak te voorkomen. Deze schade kan de levensvatbaarheid, bloedstroom en zichtbaarheid van het embryo en CAM beïnvloeden. Bovendien maakt schade aan de dooierzak en bijgevolg een lage stijfheid van het membraan een injectie in de CAM-vaten onmogelijk. Een 5 dagen oud embryo heeft een relatief klein luchtzakje dus om een voldoende groot gat in de schaal te kunnen maken waardoor het eigehalte kan worden verwijderd, moet 2 ml eiwit worden teruggetrokken. Hierdoor ontstaat er meer ruimte tussen de eierschaal en het embryo. Na het opzuigen van het eiwit moet een stuk tape het gat afsluiten waar de naald in is gegaan. Als er nog steeds eiwit uitlekt, breng dan een ander stuk tape aan. Daarnaast creëert het aanbrengen van tape op het gat aan de zijkant een vacuüm in het ei dat voorkomt dat het eigehalte door zijn eigen gewicht uitvalt wanneer het grote gat in stap 1.2.2.8 wordt gemaakt. Schade aan het embryo of CAM kan ook optreden wanneer de rand van de eierschaal te scherp was of wanneer het eigehalte te rigoureus in de weegboot wordt gedropt, dus de eierschaal moet heel dicht bij de weegboot worden gehouden. Tussen dag 5 en 6 van de ontwikkeling begint de CAM zich te hechten aan het schaalmembraan32. Deze hechting verhoogt het risico op beschadiging van het embryo en CAM bij het verwijderen van het eigehalte uit de eierschaal. Door het ei na injectie van PBS erin te openen voor een bebroed ei van 6 tot 7 dagen of in een met PBS gevulde container zoals beschreven voor een 8-daags bebroed ei, wordt het risico op schade verminderd. Met betrekking tot een injectie in een CAM-ader: als de eerste injectie mislukt, kan een tweede injectie verder stroomopwaarts in dezelfde ader worden gedaan als de schade gering was of in een andere CAM-ader. Scheiding van het embryo en CAM van de dooier maakt de embryo- en CAM-vaten optisch transparant. Als gevolg hiervan verliest het embryo zijn primaire bron van voedingsstoffen33. Dit verlies aan voedingsstoffen zou een verklaring kunnen zijn voor de waargenomen lagere hartslag van 80 bpm in vergelijking met ~190 voor een 6 dagen oud embryo dat nog in contact staat met de dooier30 en de verminderde overlevingstijd van 2 uur na deze scheidingsprocedure. Een andere factor die een rol kan spelen in de verminderde hartslag en overlevingstijd is de uitdaging om de door dooier gescheiden embryo- en CAM-vaten op 37 °C te houden. Een microscoopstadium incubator kan van nut zijn. Daarnaast leidt het losmaken van de CAM van de dooier waarschijnlijk tot mechanische veranderingen in het weefsel, omdat de membraanspanning minder wordt. De lagere membraanspanning kan een verhoogde afschuifsnelheid van het binnenste vat veroorzaken, wat leidt tot een lagere hartslag.

De ex ovo kippenembryo- en CAM-vaten hebben enkele beperkingen als in vivo model, waaronder alleen korte tijdobservaties, voor contrastverbeterde echografie en microbubbel-gemedieerde medicijnafgiftestudies. Door het kleine bloedvolume van 100±23 μL op dag 5 en 171±23 μL op dag 634 kan een maximaal volume van ~5 μL worden geïnjecteerd. In de latere stadia van ontwikkeling (dag 7 en ouder) neemt de stijfheid van het vat toe en neemt de elasticiteit van de dooier af. Dit kan een succesvolle injectie in oudere embryo's bemoeilijken. Zodra de microbubbels zijn geïnjecteerd, circuleren ze urenlang omdat het kippenembryo in dit stadium geen volledig ontwikkeld immuunsysteem heeft35. Daarom worden microbubbels niet binnen ~ 6 minuten gewist, zoals bij mensen36,37, waardoor typische ultrasone moleculaire beeldvormingsstudies met een wachttijd van 5-10 minuten voor niet-gebonden gerichte microbubbels om te worden gewist38 niet haalbaar. Om microbubbels te targeten, moeten geschikte liganden worden gebruikt die kunnen binden aan aviaire endotheelcellen, zoals eerder beschreven voor de angiogenesemarker αvβ37. Andere aspecten om te overwegen voor dit model zijn de verhoogde moeilijkheid om de embryo- en CAM-vaten van de dooier te scheiden in oudere embryo's (> 8 dagen) en een lagere hematocriet van ~ 20% 39 in vergelijking met mensen. Dit laatste kan van invloed zijn op microbubbeloscillaties omdat bekend is dat microbubbeloscillaties worden gedempt in een meer viskeuze omgeving40. CAM-slagaders zijn minder zuurstofrijk dan CAM-aderen41,42. Met dit verschil moet rekening worden gehouden bij bijvoorbeeld het bestuderen van fotoakoestische beeldvorming van bloedoxygenatie.

De hier beschreven methoden maken het mogelijk om het eigehalte uit de eierschaal te halen op de dag van de echografie of het medicijnafgifteonderzoek, meestal op dag 5 tot 8 van de incubatie. Dit is anders dan bij bestaande methoden waarbij het eigehalte na een incubatie van 3 dagen uit de schaal wordt gehaald en verder wordt ontwikkeld als ex ovo-cultuur 18,20,21. De voordelen zijn een hogere overlevingskans van 90% voor 5 dagen, 75% voor 6 dagen, 50% voor 7 dagen en 60% voor 8 dagen oude bebroede eieren in vergelijking met ~ 50% voor 3 dagen oude embryo's die uit de eierschaal worden gehaald en verder worden bebroed ex ovo 1,18 het vermijden van antibiotica tijdens kweek18, 20 en grote steriele incubator voor de ex ovo cultuur. De overleving van de 6 tot 8 dagen oude embryo's is lager omdat de CAM zich begint te hechten aan de schaal21, waardoor het CAM-membraan meer vatbaar is voor scheuren bij extractie. De scheiding van het embryo met de CAM-vorm de dooier wordt ook beschreven waardoor het embryo en CAM optisch transparant zijn.

Door het eigehalte in verschillende opstellingen te plaatsen, kunnen het kippenembryo en CAM worden gebruikt voor een groot aantal ultrasone beeldvormingsstudies, zoals IVUS, fotoakoestisch, zonder of met ultrasone contrastmiddelen in 2D en 3D. De focus kan liggen op het ontwikkelen van nieuwe ultrasone pulserende schema's of het testen van nieuwe transducers. Daarnaast kan het model ook worden gebruikt om nieuwe ultrasone contrastmiddelen en hun gedrag in bloedvaten onder de stroom te onderzoeken. Aangezien het mechanisme van microbubbel-gemedieerde medicijnafgifte nog onbekend is43, kan het gebruik van het in vivo CAM-model helpen bij het ophelderen van het mechanisme door het microbubbelgedrag in relatie tot de cellulaire respons te bestuderen. Ten slotte hebben de CAM-vaten bewezen een geschikt systeem te zijn om xenografttumortransplantatie te onderzoeken44. Dit creëert de mogelijkheid om het CAM-vat te gebruiken als een model om tumorbeeldvorming te onderzoeken met behulp van echografie en om de bloedstroom in de tumor te onderzoeken met behulp van CEUS. De tumoren worden meestal geënt op de CAM-vaten van 8 of 9 dagen oude embryo's 1,14,45, waarvoor het embryo op dag 3 van de incubatie uit de eierschaal wordt gehaald en ex ovo verder wordt ontwikkeld. De methoden die in dit protocol worden beschreven, kunnen worden gebruikt om embryo's in ovo te laten groeien tot de dag van tumortransplantatie.

De auteurs vertrouwen erop dat dit artikel nuttig zal zijn voor onderzoekers die kippenembryo's en hun chorioallantoic membrane (CAM) willen gebruiken als een in vivo model voor toepassingen van contrastmiddelen en stromingsstudies.

Openbaarmakingen

De auteurs hebben niets te onthullen.

Dankbetuigingen

Dit werk werd ondersteund door de Toegepaste en Technische Wetenschappen (TTW) (Vidi-project 17543), onderdeel van NWO. De auteurs willen Robert Beurskens, Luxi Wei en Reza Pakdaman Zangabad van de afdeling Biomedische Technologie en Michiel Manten en Geert Springeling van de afdeling Experimentele Medische Instrumentatie bedanken voor technische assistentie, allen van het Erasmus MC Universitair Medisch Centrum Rotterdam.

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel
NaamBedrijfCatalogusnummerOpmerkingen
AgaroseSigma-AldrichA9539
Clamp (Kocher clamp)
Cling film
Holder with acoustic membrane (CLINIcell 25 cm2)MABIO, Tourcoing, FranceCLINIcell25-50-T FER 00106
Demi water
Disposable plastic Pasteur pipetsVWR612-1747
EggsDrost Pluimveebedrijf Loenen BV, the NetherlandsFreshly fertilized
Fridge 15 °C
Glass capillary needlesDrummond1-000-1000Inside diameter: 0.0413 inch
Heating plate 37 °C
Humidified incubator 37 °C
Insect specimen pins
Metal egg holderCustom made by Experimental Medical Instrumentation at Erasmus MC. See figure 1 A,B
Metal weighing boat holderCustom made by Experimental Medical Instrumentation at Erasmus MC. See figure 1 C,D
Microinjection systemFUJIFILM VisualSonics
Mineral oilSigma-AldrichM8410-100ML
Needle, 19 GVWR (TERUMO)613-5392
Phosphate-bufferes saline (PBS), 1xThermoFisher10010023
Petri dish, 1 LGlass
Petri dish, 90 mm diameterVWR391-0559
Preclinical animal ultrasound machine (Vevo 2100)FUJIFILM VisualSonics
Probe (MS250)FUJIFILM VisualSonics30 MHz transmit and 15 MHz receive frequency
Probe (MS550s)FUJIFILM VisualSonicstransmission frequency of 40 MHz
ScalpelVWR (SWANN-MORTON)233-5363
Scissors, smallFine Science Tools (FST)14558-09
Syringe, 5 mLVWR (TERUMO)613-0973
Table spoon
Tape (Scotch Magic tape)Scotch
Tissue paperTork
Tweezers large VWR (USBECK Laborgeräte)232-0107See figure 1E
Tweezers smallDUMONT Medical, Switzerland0103-5/45See figure 1F
Ultrasound contrast agent (custum made F-type)Produced as described by: Daeichin, V. et al. Microbubble Composition and Preparation for Imaging : In Vitro and In Vivo Evaluation. IEEE TRANSACTIONS ON ULTRASONICS. 64 (3), 555–567 (2017).
Ultrasound contrast agent (MicroMarker)FUJIFILM VisualSonics, Inc.
Ultrasound contrast agent (Definity)Lantheus medical imaging, United States
Ultrasound gelAquasonic
Waxi film (Parafilm)Parafilm
Weighing boats (85 × 85 × 24 mm)VWR611-0094

Referenties

  1. Martowicz, A., Kern, J., Gunsilius, E., Untergasser, G. Establishment of a Human Multiple Myeloma Xenograft Model in the Chicken to Study Tumor Growth, Invasion and Angiogenesis. Journal of Visualized Experiments. (99), e1(2015).
  2. Schmitz, M., Nelemans, B. K. A., Smit, T. H. A Submerged Filter Paper Sandwich for Long-term Ex ovo Time-lapse Imaging of Early Chick Embryos. Journal of Visualized Experiments. (118), e1(2016).
  3. Brauer, R., Chen, P. Influenza Virus Propagation in Embryonated Chicken Eggs. Journal of Visualized Experiments. (97), e1(2015).
  4. Oosterbaan, A. M., Ursem, N. T. C., Struijk, P. C., Bosch, J. G., van der Steen, A. F. W., Steegers, E. A. P. Doppler flow velocity waveforms in the embryonic chicken heart at developmental stages corresponding to 5-8 weeks of human gestation. Ultrasound in Obstetrics and Gynecology. 33 (6), 638-644 (2009).
  5. McQuinn, T. C., Bratoeva, M., DeAlmeida, A., Remond, M., Thompson, R. P., Sedmera, D. High-Frequency Ultrasonographic Imaging of Avian Cardiovascular Development. Developmental Dynamics. 236 (12), 3503-3513 (2007).
  6. Stieger, S. M., Caskey, C. F., Adamson, R. H., Curry, F. E., Wisner, E. R., Ferrara, K. W. Enhancement of Vascular Permeability with Low-Frequency Contrast-enhanced Ultrasound in the Chorioallantoic Membrane Model. Radiology. 243 (1), 112-121 (2007).
  7. Skachkov, I., Luan, Y., van der Steen, A. F. W., De Jong, N., Kooiman, K. Targeted microbubble mediated sonoporation of endothelial cells in vivo. IEEE Transactions on Ultrasonics, Ferroelectrics, and Frequency Control. 61 (10), 1661-1667 (2014).
  8. Vargas, A., Zeisser-Labouèbe, M., Lange, N., Gurny, R., Delie, F. The chick embryo and its chorioallantoic membrane (CAM) for the in vivo evaluation of drug delivery systems. Advanced Drug Delivery Reviews. 59 (11), 1162-1176 (2007).
  9. Rytelewski, M., Buensuceso, A., Leong, H. S., Deroo, B. J., Chambers, A. F., Koropatnick, J. Evaluating the Effectiveness of Cancer Drug Sensitization In Vitro and In vivo. Journal of Visualized Experiments. (96), e1(2015).
  10. Schmitd, L. B., Liu, M., Scanlon, C. S., Banerjee, R., Silva, N. J. D. The Chick Chorioallantoic Membrane In vivo Model to Assess Perineural Invasion in Head and Neck Cancer. Journal of Visualized Experiments. (148), e1(2019).
  11. Daeichin, V., Bosch, J. G., Needles, A., Foster, F. S., van der Steen, A., de Jong, N. Subharmonic, non-linear fundamental and ultraharmonic imaging of microbubble contrast at high frequencies. Ultrasound in Medicine and Biology. 41 (2), 486-497 (2015).
  12. Maresca, D., et al. Imaging microvasculature with contrast-enhanced ultraharmonic ultrasound. Ultrasound in Medicine and Biology. 40 (6), 1318-1328 (2014).
  13. Lindsey, B. D., et al. High Resolution Ultrasound Superharmonic Perfusion Imaging: In vivo Feasibility and Quantification of Dynamic Contrast-Enhanced Acoustic Angiography. Annals of Biomedical Engineering. 45 (4), 939-948 (2017).
  14. Paproski, R. J., Jovel, J., Wong, G. K. S., Lewis, J. D., Zemp, R. J. Enhanced detection of cancer biomarkers in blood-borne extracellular vesicles using nanodroplets and focused ultrasound. Cancer Research. 77 (1), 3-13 (2017).
  15. Huang, C., et al. Short Acquisition Time Super-Resolution Ultrasound Microvessel Imaging via Microbubble Separation. Scientific Reports. 10, 1-13 (2020).
  16. Lowerison, M. R., Huang, C., Kim, Y., Lucien, F., Chen, S., Song, P. In vivo Confocal Imaging of Fluorescently Labeled Microbubbles: Implications for Ultrasound Localization Microscopy. IEEE Transactions on Ultrasonics, Ferroelectrics, and Frequency Control. 67 (9), 1811-1819 (2020).
  17. Faez, T., Skachkov, I., Versluis, M., Kooiman, K., de Jong, N. In vivo Characterization of Ultrasound Contrast Agents: Microbubble Spectroscopy in a Chicken Embryo. Ultrasound in Medicine and Biology. 38 (9), 1608-1617 (2012).
  18. Yalcin, H. C., Shekhar, A., Rane, A. A., Butcher, J. T. An ex-ovo Chicken Embryo Culture System Suitable for Imaging and Microsurgery Applications. Journal of Visualized Experiments. (44), e4(2010).
  19. Kokhuis, T. J. A., et al. Intravital microscopy of localized stem cell delivery using microbubbles and acoustic radiation force. Biotechnology and Bioengineering. 112 (1), 220-227 (2015).
  20. Cloney, K., Franz-Odendaal, T. A. Optimized Ex-ovo Culturing of Chick Embryos to Advanced Stages of Development. Journal of Visualized Experiments. (95), e6(2015).
  21. Dohle, D. S., et al. Chick ex ovo Culture and ex ovo CAM Assay: How it Really Works. Journal of Visualized Experiments. (33), e2(2010).
  22. Hamburger, V., Hamilton, H. A Series Of Normal Stages In The Developent Of The Chick Embryo. Journal of Morphology. 88 (1), 231-272 (1951).
  23. Ribatti, D. A morphometric study of the expansion of the chick vasculosa in shell-less culture. Journal of Anatomy. 186, 639-644 (1995).
  24. Ribatti, D., Nico, B., Vacca, A., Roncali, L., Burri, P. H., Djonov, V. Chorioallantoic Membrane Capillary Bed: A Useful Target for Studying Angiogenesis and Anti-Angiogenesis In vivo. Anatomical Record. 324, 317-324 (2001).
  25. DeFouw, D. O., Rizzo, V. J., Steinfeld, R., Feinberg, R. N. Mapping of the Microcirculation in the Chick Chorioallantoic Membrane during Normal Angiogenesis. Microvascular research. 38, 136-147 (1989).
  26. Beekers, I., van Rooij, T., van der Steen, A. F. W., de Jong, N., Verweij, M. D., Kooiman, K. Acoustic characterization of the CLINIcell for ultrasound contrast agent studies. IEEE Transactions on Ultrasonics, Ferroelectrics, and Frequency Control. 66 (1), 244-246 (2019).
  27. Lang, E. R., Rha, C. Apparent shear viscosity of native egg white. Journal of Food Science and Technology. 17, 595-606 (1982).
  28. Daeichin, V., et al. Microbubble Composition and Preparation for Imaging: In Vitro and In vivo Evaluation. IEEE TRANSACTIONS ON ULTRASONICS. 64 (3), 555-567 (2017).
  29. Mcferrin, H. E., Olson, S. D., Gutschow, M. V., Semon, J. A., Sullivan, D. E., Prockop, D. J. Rapidly Self-Renewing Human Multipotent Marrow Stromal Cells (hMSC) Express Sialyl Lewis X and Actively Adhere to Arterial Endothelium in a Chick Embryo Model System. PLoS ONE. 9 (8), 1-11 (2014).
  30. Akiyama, R., Mitsubayashi, H., Tazawa, H., Burggren, W. W. Heart rate responses to altered ambient oxygen in early (days 3-9) chick embryos in the intact egg. Journal of Comparative Physiology - B Biochemical, Systemic, and Environmental Physiology. 169 (2), 85-92 (1999).
  31. Foster, F. S., Hossack, J., Adamson, S. L. Micro-ultrasound for preclinical imaging. Interface Focus. 1, 576-601 (2011).
  32. Gabrielli, M. G., Accili, D. The Chick Chorioallantoic Membrane: A Model of Molecular, Structural, and Functional Adaptation to Transepithelial Ion Transport and Barrier Function during Embryonic Development. Journal of Biomedicine and Biotechnology. , 1-12 (2010).
  33. van der Wagt, I., de Jong, I. C., Mitchell, M. A., Molenaar, R., van den Brand, H. A review on yolk sac utilization in poultry. Poultry Science. 99, 2162-2175 (2020).
  34. Kind, C. The development of the circulating blood volume of the chick embryo. Anatomy and Embryology. 147, 127-132 (1975).
  35. Ribatti, D. Chick Embryo Chorioallantoic Membrane as a Useful Tool to Study Angiogenesis. International Review of Cell and Molecular Biology. 270, 181-224 (2008).
  36. Schneider, M. Characteristics of SonoVue(TM). Echocardiography. 16 (7), 743-746 (1999).
  37. Kitzman, D. W., Goldman, M. E., Gillam, L. D., Cohen, J. L., Aurigemma, G. P., Gottdiener, J. S. Efficacy and Safety of the Novel Ultrasound Contrast Agent Perflutren (Definity) in Patients With Suboptimal Baseline Left Ventricular Echocardiographic Images. American Journal of Cardiology. 86, 669-674 (2000).
  38. Kosareva, A., Abou-Elkacem, L., Chowdhury, S., Lindner, J. R., Kaufmann, B. A. Seeing the Invisible-Ultrasound Molecular Imaging. Ultrasound in Medicine and Biology. 46 (3), 479-497 (2020).
  39. Al-Roubaie, S., Jahnsen, E. D., Mohammed, M., Henderson-Toth, C., Jones, E. A. V. Rheology of embryonic avian blood. American Journal of Physiology - Heart and Circulatory Physiology. 301 (6), 2473-2481 (2011).
  40. Helfield, B., Chen, X., Qin, B., Villanueva, F. S. Individual lipid encapsulated microbubble radial oscillations: Effects of fluid viscosity. The Journal of the Acoustical Society of America. 139 (1), 204-214 (2016).
  41. Metcalfe, J., Stock, M. K. Oxygen exchange in the chorioallantoic membrane, avian homologue of the mammalian placenta. Placenta. 14, 605-613 (1993).
  42. Tazawa, H. Oxygen and CO2 exchange and acid-base regulation in the avian embryo. American Journal of Zoology. 20, 395-404 (1980).
  43. Kooiman, K., et al. Ultrasound-Responsive Cavitation Nuclei for Therapy and Drug Delivery. Ultrasound in Medicine and Biology. 46 (6), 1296-1325 (2020).
  44. Li, M., Pathak, R. R., Lopez-rivera, E., Friedman, S. L., Aguirre-ghiso, J. A., Sikora, A. G. The In ovo Chick Chorioallantoic Membrane (CAM) Assay as an Efficient Xenograft Model of Hepatocellular Carcinoma. Journal of Visualized Experiments. (104), e1(2015).
  45. Sys, G. M. L., et al. The In ovo CAM-assay as a Xenograft Model for Sarcoma. Journal of Visualized Experiments. (77), e1(2013).

Herprints en machtigingen

Meer artikelen verkennen

Kippenembryomodeldrugdelivery met microbellenCAM-vatenex ovo preparatiecontrastmiddelen voor echografievasculaire beeldvormingembryo-injectie
De voorbereiding van Chicken Ex Ovo Embryo's en Chorioallantoic Membrane Vessels als In Vivo Model voor Contrast-Enhanced Ultrasound Imaging en Microbubble-Gemedieerde Drug Delivery Studies
Neem contact met ons op
Aanbevelen aan de bibliotheek

Privacy

Gebruiksvoorwaarden

Beleidsoverzicht

Copyright © 2026 MyJoVE Corporation. Alle rechten voorbehouden.