De gepresenteerde methode maakt visualisatie van fluorescerend gelabelde cellulaire eiwitten met expansiemicroscopie mogelijk, wat leidt tot een resolutie van 70 nm op een conventionele microscoop.
Een abonnement op JoVE is vereist om deze inhoud te bekijken. Log in of start vandaag met uw gratis proefperiode.
Methodenartikel
Beeldvorming van Podocytische eiwitten Nephrin, Actine en Podocine met expansiemicroscopie
* These authors contributed equally
In dit artikel
Samenvatting
Samenvatting
Verstoring van het glomerulaire filter bestaande uit het glomerulaire endotheel, glomerulair keldermembraan en podocyten, resulteert in albuminurie. Podocyte voetprocessen bevatten actinebundels die zich binden aan cytoskeletadaptereiwitten zoals podocine. Deze adaptereiwitten, zoals podocine, verbinden de ruggengraat van het glomerulaire spleetdiafragma, zoals nefhrine, met het actinecytoskelet. Het bestuderen van de lokalisatie en functie van deze en andere podocytische eiwitten is essentieel voor het begrijpen van de rol van het glomerulaire filter bij gezondheid en ziekte. Het gepresenteerde protocol stelt de gebruiker in staat om actine, podocine en nefhrine te visualiseren in cellen met superresolutiebeeldvorming op een conventionele microscoop. Ten eerste worden cellen gekleurd met een conventionele immunofluorescentietechniek. Alle eiwitten in het monster worden vervolgens covalent verankerd aan een zwelbare hydrogel. Door de spijsvertering met proteïnase K worden structurele eiwitten gespleten waardoor isotropische zwelling van de gel in de laatste stap mogelijk is. Dialyse van het monster in water resulteert in een 4-4,5-voudige uitzetting van het monster en het monster kan worden bekeken via een conventionele fluorescentiemicroscoop, waardoor een potentiële resolutie van 70 nm ontstaat.
Inleiding
Albuminurie is een surrogaatparameter van cardiovasculair risico en is het gevolg van verstoring van het glomerulaire filter1. Het glomerulaire filter bestaat uit het fenestrated endotheel, het glomerulaire keldermembraan en het spleetmembraan gevormd door podocyten. Primaire en secundaire voetprocessen van podocyten wikkelen zich rond de capillaire wand van het glomerulum2. De delicate structuur van voetprocessen wordt gehandhaafd door corticale actinebundels die ook dienen als ankers voor meerdere spleetmembraaneiwitten en andere adaptereiwitten2. Het ruggengraateiwit van het spleetmembraan word....
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Protocol
1. Splitsen en zaaien van cellen
- Warm steriel Dulbecco's Modified Eagle's Medium (DMEM) op, inclusief 10% foetale kalfsserum (FCS), steriele Fosfaat gebufferde zoutoplossing (PBS) en steriele trypsine tot 37 °C. Activeer de schone bank.
- Bereid een 6-put plaat voor door één steriele glazen afdekplaat (10 mm) aan elke put toe te voegen met behulp van steriele tang.
- Leg een celkweekschaal van 10 cm met Cos7 cellen onder de schone bank. Zuig onder de schone bank het medium van de cellen aan met behulp van een vacuümapparaat.
- Houd de geanguleerde celkweekschaal in één hand en voeg 10 ml steriel PBS toe aan de zijkant van de celkweek....
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Resultaten
Het concept en de timing van dit proExM-protocol zijn weergegeven in figuur 1. Op dag 5 worden getransfecteerde cellen gefixeerd en gekleurd met fluorescerende antilichamen die gericht zijn op het eiwit van belang (figuur 1A,B). Op dag 6 leidt behandeling met AcX tot vorming van aminegroepen op alle eiwitten (inclusief fluoroforen) (Figuur 1A,B)12
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Discussie
De gepresenteerde methode stelt de onderzoeker in staat om cellulaire eiwitten te visualiseren, bijvoorbeeld podocine, nefhrine en cytoskeletcomponenten, bijvoorbeeld F-actine. Binnen dit protocol worden getransfecteerde cos7-cellen gebruikt als model om de interactie van spleetmembraaneiwitten met F-actine te bestuderen. Helaas drukken vereeuwigde podocytcellijnen onvoldoende endogene hoeveelheden spleetmembraaneiwitten uit19.
Met deze methode kunnen cellulaire eiwitte.......
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Openbaarmakingen
De auteurs hebben niets bekend te maken.
Dankbetuigingen
De auteurs willen Blanka Duvnjak en Nikola Kuhr bedanken voor hun uitstekende technische bijstand.
....Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Materialen
| Naam | Bedrijf | Catalogusnummer | Opmerkingen |
|---|---|---|---|
| Acrylamide >99% | Sigma-Aldrich | A3553-100G | |
| 6-((Acryloyl)amino)hexanoic acid, succinimidyl ester, Acryloyl-X, SE | invitrogen | A-20770 | bewaar maximaal 4 maanden |
| APS | Sigma-Aldrich | A3678-25G | |
| Deckgläser (dekglazen) | Engelbrecht | K12432 | 24x32mm #1.0 |
| Diamantschijf | VWR | 201-0392 | voor het snijden van dekglasjes |
| Guanidine HCl | Sigma-Aldrich | G3272-100G | 8M Stock kan op RT worden bewaard |
| Marten haarborstel | Leon Hardy | 3 (770) | |
| "Menzel" Deckgläser (dekglazen) | Thermo Fischer | 15654786 | 24x24mm #1.5 |
| N,N`-Methylenbisacrylamide | Sigma-Aldrich | M7256-25G | |
| Objektträger UniMark | Marienfeld | 703010 | |
| Proteinase K | New England Biolabs | P8107S | |
| Sodium Acrylaat | Sigma-Aldrich | 408220 | zuiverheid controleren |
| Sodium Bicarbonaat | Sigma-Aldrich | S5761 | |
| Kleurkamer | geproduceerd in de werkplaats van de universiteit | ||
| TEMED | ROTH | 2367.1 | |
| 6-Well glazen bodemplaten | Cellvis | P06-1.5H-N | |
| Antilichamen | |||
| Actin-ExM 546 | chrometra | niet beschikbaar | 1:40 |
| Anti Podocin geproduceerd in konijn | Sigma | P-0372-200UL | 1:200 |
| Donkey anti guinea-pig CF633 | Sigma | SAB4600129-50UL | 1:200 |
| Goat anti konijn 488 | Life Technologies | A11034 | 1:1000 |
| Guinea pig anti nephrine | Origene | BP5030 | 1:100 |
| Software | |||
| FIJI | |||
| Visiview | |||
| microscoop | |||
| AXIO Observer Z1 | Zeiss | niet beschikbaar |
Referenties
- Matsushita, K., et al. Association of estimated glomerular filtration rate and albuminuria with all-cause and cardiovascular mortality in general population cohorts: a collaborative meta-analysis. Lancet. 375 (9731), 2073-2081 (2010).
- Faul, C., Asanuma, K., Yanagida-Asanuma, E., Kim, K., Mundel, P.
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Herprints en machtigingen
