Method Article

Drie- en vierdimensionale visualisatie- en analysebenaderingen om gewervelde axiale rek en segmentatie te bestuderen

DOI:

10.3791/62086

⸱

February 28th, 2021

 ,  ,  , 
1Instituto Gulbenkian de Ciência, 2Faculdade de Ciências da Universidade de Lisboa, 3NOVA School of Science and Technology

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Hier beschrijven we computationele hulpmiddelen en methoden die visualisatie en analyse van drie- en vierdimensionale beeldgegevens van muizenembryo's mogelijk maken in de context van axiale elongatie en segmentatie, verkregen door into optische projectietomografie en door live beeldvorming en whole-mount immunofluorescentiekleuring met behulp van multifotonenmicroscopie.

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Somitogenese is een kenmerk van de embryonale ontwikkeling van gewervelde dieren. Al jaren bestuderen onderzoekers dit proces in een verscheidenheid aan organismen met behulp van een breed scala aan technieken die ex vivo en in vitro benaderingen omvatten. De meeste studies vertrouwen echter nog steeds op de analyse van tweedimensionale (2D) beeldvormingsgegevens, wat een goede evaluatie van een ontwikkelingsproces zoals axiale extensie en somitogenese met zeer dynamische interacties in een complexe 3D-ruimte beperkt. Hier beschrijven we technieken die muis live imaging acquisitie, datasetverwerking, visualisatie en analyse in 3D en 4D mogelijk maken om de cellen (bijv. Neuromesodermale voorlopers) te bestuderen die betrokken zijn bij deze ontwikkelingsprocessen. We bieden ook een stapsgewijs protocol voor optische projectietomografie en whole-mount immunofluorescentiemicroscopie in muizenembryo's (van monstervoorbereiding tot beeldacquisitie) en tonen een pijplijn die we hebben ontwikkeld om 3D-beeldgegevens te verwerken en te visualiseren. We breiden het gebruik van sommige van deze technieken uit en benadrukken specifieke kenmerken van verschillende beschikbare software (bijv. Fiji / ImageJ, Drishti, Amira en Imaris) die kunnen worden gebruikt om ons huidige begrip van axiale extensie en somietvorming (bijv. 3D-reconstructies) te verbeteren. Al met al benadrukken de hier beschreven technieken het belang van 3D-gegevensvisualisatie en -analyse in de ontwikkelingsbiologie en kunnen ze andere onderzoekers helpen om 3D- en 4D-beeldgegevens beter aan te pakken in de context van axiale uitbreiding en segmentatie van gewervelde dieren. Ten slotte maakt het werk ook gebruik van nieuwe hulpmiddelen om het onderwijzen van de embryonale ontwikkeling van gewervelde dieren te vergemakkelijken.

Introduction

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

De vorming van de lichaamsas van gewervelde dieren is een zeer complex en dynamisch proces dat plaatsvindt tijdens de embryonale ontwikkeling. Aan het einde van de gastrulatie [bij de muis, rond embryonale dag (E) 8.0], wordt een groep epiblastvoorlopercellen die bekend staan als neuromesodermale voorlopercellen (NMP's) een belangrijke aanjager van axiale uitbreiding in een kop-staartsequentie, die de neurale buis en paraxiale mesodermale weefsels genereert tijdens nek-, romp- en staartvorming 1,2,3,4 . Interessant is dat de positie die de....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Dierproeven volgden de Portugese (Portaria 1005/92) en Europese (Richtlijn 2010/63/EU) wetgevingen met betrekking tot huisvesting, houderij en welzijn. Het project werd beoordeeld en goedgekeurd door de ethische commissie van het 'Instituto Gulbenkian de Ciência' en door de Portugese nationale entiteit 'Direcção Geral de Alimentação e Veterinária' (licentiereferentie: 014308).

1. Monstervoorbereiding voor 3D- en 4D-beeldvorming

OPMERKING: Hier geven we een gedetailleerde beschrijving van het ontleden en voorbereiden van muis E8.25 tot E10.5 embryo's voor levende beeldvorming (1.1), E7.5 tot E11.5 embryo's voor whol....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Results

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

De representatieve resultaten die in dit artikel worden getoond voor zowel de live als de immunofluorescentiebeeldvorming, werden verkregen met behulp van een twee-fotonensysteem, met een 20 × 1.0 NA waterobjectief, de excitatielaser afgestemd op 960 nm en GaAsP-fotodetectoren (zoals beschreven in Dias et al. (2020)43. Optische projectietomografie werd gedaan met behulp van een op maat gemaakte OPenT-scanner (zoals beschreven in Gualda et al. (2013)28.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Discussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Axiale verlenging en segmentatie zijn twee van de meest complexe en dynamische processen die plaatsvinden tijdens de embryonale ontwikkeling van gewervelde dieren. Het gebruik van 3D- en 4D-beeldvorming met single-cell tracking wordt al enige tijd toegepast om deze processen te bestuderen bij zowel zebravis- als kippenembryo's, waarvoor toegankelijkheid en kweekomstandigheden complexe beeldvormingvergemakkelijken 19,44,45,46,47,48,49 .......

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Disclosures

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

De auteurs verklaren geen belangenconflicten te hebben.

Acknowledgements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

We willen Olivier Pourquié en Alexander Aulehla bedanken voor de LuVeLu reporter-stam, het SunJin-laboratorium voor het RapiClear-testmonster, Hugo Pereira voor de hulp bij het gebruik van BigStitcher, Nuno Granjeiro voor het helpen opzetten van het live beeldvormingsapparaat, de IGC-dierenfaciliteit en voormalige en huidige leden van het Mallo-lab voor nuttige opmerkingen en ondersteuning tijdens dit werk.

We danken de technische ondersteuning van de Advanced Imaging Facility van de IGC, die wordt ondersteund door Portugese financiering ref# PPBI-POCI-01-0145-FEDER-022122 en ref# PTDC/BII-BTI/32375/2017, medegefinancierd door het regionaal....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
Agarose low gelling temperatureSigmaA9414Gebruikt voor het bevestigen van embryo's (bijv. voor OPT)
Amira softwareThermofisher-Commercieel softwaretool
Anti-Brachyury (Geit polyklonaal)R and D SystemsAF2085 RRID:AB_2200235Voor immunofluorescentie
Anti-Sox2 (Konijn monoklonaal)Abcamab92494 RRID:AB_10585428Voor immunofluorescentie
Anti-Tbx6 (Geit polyklonaal)R and D SystemsAF4744 RRID:AB_2200834Voor immunofluorescentie
Anti-Laminin111 (Konijn polyklonaal)SigmaL9393 RRID:AB_477163Voor immunofluorescentie
Anti-geit 488 (Ezel polyklonaal)Molecular ProbesA11055 RRID:AB_2534102Voor immunofluorescentie
Anti-konijn 568 (Ezel polyklonaal)ThermoFisher   ScientificA10042 RRID:AB_2534017Voor immunofluorescentie
Benzyl Alcohol (99+%)(alle)-Gebruikt om embryo's te verhelderen (onderdeel van BABB)
Benzyl Benzoate (99+%)(alle)-Gebruikt om embryo's te verhelderen (onderdeel van BABB)
RunderserumalbumineBiowestP6154Voor immunofluorescentie
Dekglas 20x20 mm #0(alle)-100um dik
Dekglas 20x20 mm #1(alle)-170um dik
Dekglas 20x60 mm #1.5(alle)-Te gebruiken als “glazen plaatjes”
DAPI (4’,6-Diamidino-2- Fenylindooldihydrochloride)Life TechnologiesD3571Voor immunofluorescentie
Drishti software(open source)-Gratis softwaretool
EDTASigmaED2SSVoor demineralisatie
Fiji/ImageJ software(open source)-Gratis softwaretool
GlycineNZYtechMB01401Voor immunofluorescentie
Huygens softwareScientific Volume Imaging-Commercieel softwaretool
HyClone gedefinieerd foetaal runderserumGE Healthcare#HYCLSH30070.03Voor live beeldvorming
Waterstofperoxide oplossing 30 %Milipore1085971000Voor opheldering
Imaris softwareBitplane / Oxford instruments-Commercieel softwaretool
iSpacersSunJin Lab(variabel)Gebruik als afstandhouders voor preparaten
L-glutamineGibco#25030–024Voor live beeldvormingsmedium
DMEM met lage glucoseGibco11054020Voor live beeldvormingsmedium
M2 mediumSigmaM7167Om embryo's te dissekeren
MethanolVWRVWRC20847.307Voor dehydratie- en rehydratiefasen
Methyl salicylateSigmaM6752Gebruikt om embryo's te verhelderen
ParaformaldehydeSigmaP6148Gebruikt in oplossing om embryo's te fixeren
Penicilline-streptomycineSigma#P0781Voor live beeldvormingsmedium
PBS (fosfaatgebufferde zoutoplossing)BiowestL0615-500-
RapiClearSunJin LaboratoryRapiClear 1.52Gebruikt om embryo's te verhelderen
Secure-Sea hybridisatiekamersSigmaC5474Gebruik als afstandhouders voor preparaten
simLab softwareSimLab soft-Commercieel softwaretool
Glijplaatje, concaaf glas - 75x25 mm(alle)-Om dikke embryo's te monteren.
Triton X-100SigmaT8787Voor immunofluorescentie

References

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Wilson, V., Olivera-Martinez, I., Storey, K. G. Stem cells, signals and vertebrate body axis extension. Development. 136 (12), 2133(2009).
  2. Dias, A., Aires, R. Axial Stem Cells and the Formation of the Vertebrate Body. Concepts and Applications of Stem Cell Biolog....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Tags

Vertebrate SomitogenesisAxial Elongation3D Visualization4D ImagingMouse EmbryosOptical Projection TomographyWhole Mount ImmunofluorescenceNeuromesodermal ProgenitorsTissue Clearing3D Reconstruction

Related Articles