Method Article

Analyse van vertaling in de zich ontwikkelende muishersenen met behulp van polysoomprofilering

DOI:

10.3791/62088

⸱

May 22nd, 2021

 ,  , 
1Department of Biochemistry and Molecular Biology; Cumming School of Medicine, University of Calgary, 2Department of Medical Genetics, Cumming School of Medicine, University of Calgary, 3Alberta Children's Hospital Research Institute, University of Calgary

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

De ontwikkeling van het zoogdierbrein vereist een goede controle van genexpressie op het niveau van vertaling. Hier beschrijven we een polysoomprofileringssysteem met een eenvoudig te assembleren sucrose gradiëntvormings- en fractioneringsplatform om de translationele status van mRNAs in de zich ontwikkelende hersenen te beoordelen.

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

De juiste ontwikkeling van het zoogdierbrein is afhankelijk van een fijne balans van neurale stamcelproliferatie en differentiatie in verschillende neurale celtypen. Deze balans wordt strak gecontroleerd door genexpressie die op meerdere niveaus is verfijnd, waaronder transcriptie, posttranscriptie en vertaling. In dit opzicht benadrukt een groeiende hoeveelheid bewijs een cruciale rol van translationele regulatie bij het coördineren van beslissingen over het lot van neurale stamcellen. Polysoomfractie is een krachtig hulpmiddel voor de beoordeling van de mRNA-translationele status op zowel globaal als individueel genniveau. Hier presenteren we een interne polysomale profileringspijplijn om de translationele efficiëntie in cellen van de zich ontwikkelende hersenschors van muizen te beoordelen. We beschrijven de protocollen voor sucrose gradiëntvoorbereiding, weefsellysis, ultracentrifugatie en fractioneringsgebaseerde analyse van de mRNA-translationele status.

Introduction

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Tijdens de ontwikkeling van de hersenen van zoogdieren verspreiden neurale stamcellen zich en differentiëren ze om neuronen en glia1,2 te genereren. De verstoring van dit proces kan leiden tot veranderingen in de hersenstructuur en -functie, zoals te zien is bij veel neuroontwikkelingsstoornissen3,4. Het juiste gedrag van neurale stamcellen vereist de georkestreerde expressie van specifieke genen5. Hoewel de epigenetische en transcriptiecontrole van deze genen intensief is bestudeerd, suggereren recente bevindingen dat genregula....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Al het diergebruik werd gecontroleerd door de Animal Care Committee van de Universiteit van Calgary. CD1-muizen die voor het experiment werden gebruikt, werden gekocht bij de commerciële leverancier.

1. Voorbereiding van oplossingen

OPMERKING Om RNA-afbraak te voorkomen, moet u de werkbank en alle apparatuur met RNase-ontsmettingsoplossing spuiten. Voor het experiment worden RNase-vrije tips gebruikt. Alle oplossingen worden bereid in RNase-vrij water.

  1. Bereid cycloheximide voorraadoplossing (100 mg/ml) in DMSO en bewaar bij -20 °C.
  2. Bereid 2,2 M sacharosevoorraadoplossing door 75,3 g sacharose ....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Results

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Als demonstratie werd het corticale lysaat met 75 μg RNA (gepoold uit 8 embryo's) gescheiden door de sacharosegradiënt in 12 fracties. Pieken van UV-absorptie bij 254 nm geïdentificeerde fracties die de 40S-subeenheid, 60S-subeenheid, 80S-monosomen en polysomen bevatten (figuur 4A). Analyse van breuken door westelijke vlek voor de grote ribosomale subeenheid, Rpl10 toonde zijn aanwezigheid in de 60S subeenheid (breuk 3), monosomen (breuk 4) en polysomen (fracties 5-12) (.......

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Discussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Polysomale profilering is een veelgebruikte en krachtige techniek om de translationele status te beoordelen op zowel single gene als genoombrede niveaus14 . In dit rapport presenteren we een protocol van polysomenprofilering met behulp van een thuisgeassembleerd platform en de toepassing ervan om de zich ontwikkelende muisschors te analyseren. Dit kosteneffectieve platform is eenvoudig te monteren en genereert robuuste, reproduceerbare sacharosegradiënten en polysoomprofilering met hoge gevoelighe.......

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Disclosures

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

De auteurs verklaren geen concurrerende belangen.

Acknowledgements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Dit werk werd gefinancierd door een NSERC Discovery Grant (RGPIN/04246-2018 to G.Y.). G.Y. is een Canada Research Chair. S.K. werd gefinancierd door Mitacs Globalink Graduate Fellowship en ACHRI Graduate Student Scholarship.

....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
1.5 mL RNA free microtubesAxygenMCT-150-C
10 cm dishGreiner-Bio664160
1M MgCl2InvitrogenAM9530G
21-23G needleBD305193
2M KClInvitrogenAM8640G
30 mL syringeBD302832
Blunt end needleVWR20068-781
BreadboardThorlabsMB2530/M
Bromophenol blueSigma115-39-9
CD1 mouseCharles River Laboratory
Curved tip forcepsSigma#Z168785
CycloheximideSigma66-81-9
Data acquisition software TracerDAQMeasurement Computing
Digital converterMeasurement ComputingUSB-1208LS
Direct-zol RNA miniprep kitZymoR2070
Dithiothreitol (DTT)Bio-basic12-03-3483
DMSOBioshop67-68-5
Dumont No.5 forcepsSigma#F6521
Fraction collectorBio-RadModel 2110
HBSSWisent311-513-CL
Linear stage actuatorRattmmotorCBX1605-100A
Luciferase control RNAPromegaL4561
Maxima first strand cDNA synthesis kitThemo FisherM1681
Miniature V-clampThorlabsVH1/M
Mini-series breadboardThorlabsMSB7515/M
Mini-series optical postThorlabsMS2R/M
Mini-series pedestal post holder baseThorlabsMBA1
NaClBio-basic7647-14-5
Neurobasal mediaGibco21103-049
Ø12.7 mm aluminum postThorlabsTRA150/M
ParafilmBemisPM992
PerfeCTa SYBR green fastmixQuanta BioCA101414-274
Phosphate buffered saline (PBS)Wisent311-010-CL
PuromycinBioshop58-58-2
Right-angle clampThorlabsRA90/M
Right-angle Ø1/2" to Ø6 mm post clampThorlabsRA90TR/M
Rnase AWAYMolecular BioProducts7002
RNase free tipsFrogga BioFT10, FT200, FT1000
RNase free waterWisent809-115-CL
RNasinPromegaN2111
Slim right-angle bracketThorlabsAB90B/M
Small V-clampThorlabsVC1/M
Sodium deoxycholateSigma302-95-4
Stepper motor driverSongHeTB6600
SucroseBioshop57501
SW 41 Ti rotorBeckman Coulter331362
Syringe pumpHarvard Apparatus70-4500
Syringe pumpHarvard Apparatus70-4500
Triton-X-100Bio-basic9002-93-1
TrizolThermofisher Scientific15596018
Tube piercerBrandelBR-184
UltracentrifugeBeckman CoulterL8-70M
Ultracentrifuge tubesBeckman Coulter331372
UltraPure 1M Tris-HCl pH 7.5Invitrogen15567-027
UNO project super starter kitElegooEL-KIT-003
UV monitorBio-RadEM-1 Econo
Vertical bracketThorlabsVB01A/M

References

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Götz, M., Huttner, W. B. The cell biology of neurogenesis. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 6, 777-788 (2005).
  2. Guillemot, F. Spatial and temporal specification of neural fates by transcription factor codes. Development. 134, 3771-3780 (2007).

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Tags

Polysome ProfilingTranslational RegulationMouse Brain DevelopmentSucrose GradientNeural Stem CellsmRNA TranslationUltracentrifugationFraction CollectionRibosomal SubunitsWestern Blot

Related Articles