Analyse van vertaling in de zich ontwikkelende muishersenen met behulp van polysoomprofilering

Summary

De ontwikkeling van het zoogdierbrein vereist een goede controle van genexpressie op het niveau van vertaling. Hier beschrijven we een polysoomprofileringssysteem met een eenvoudig te assembleren sucrose gradiëntvormings- en fractioneringsplatform om de translationele status van mRNAs in de zich ontwikkelende hersenen te beoordelen.

Abstract

De juiste ontwikkeling van het zoogdierbrein is afhankelijk van een fijne balans van neurale stamcelproliferatie en differentiatie in verschillende neurale celtypen. Deze balans wordt strak gecontroleerd door genexpressie die op meerdere niveaus is verfijnd, waaronder transcriptie, posttranscriptie en vertaling. In dit opzicht benadrukt een groeiende hoeveelheid bewijs een cruciale rol van translationele regulatie bij het coördineren van beslissingen over het lot van neurale stamcellen. Polysoomfractie is een krachtig hulpmiddel voor de beoordeling van de mRNA-translationele status op zowel globaal als individueel genniveau. Hier presenteren we een interne polysomale profileringspijplijn om de translationele efficiëntie in cellen van de zich ontwikkelende hersenschors van muizen te beoordelen. We beschrijven de protocollen voor sucrose gradiëntvoorbereiding, weefsellysis, ultracentrifugatie en fractioneringsgebaseerde analyse van de mRNA-translationele status.

Introduction

Tijdens de ontwikkeling van de hersenen van zoogdieren verspreiden neurale stamcellen zich en differentiëren ze om neuronen en glia^1,2 te genereren. De verstoring van dit proces kan leiden tot veranderingen in de hersenstructuur en -functie, zoals te zien is bij veel neuroontwikkelingsstoornissen^3,4. Het juiste gedrag van neurale stamcellen vereist de georkestreerde expressie van specifieke genen⁵. Hoewel de epigenetische en transcriptiecontrole van deze genen intensief is bestudeerd, suggereren recente bevindingen dat genregulatie op andere niveaus ook bijdraagt aan de coördinatie van neurale stamcelproliferatie en differentiatie^6,7,8,9,10. Het aanpakken van de translationele controleprogramma's zal dus ons begrip van de mechanismen die ten grondslag liggen aan de beslissing over het lot van neurale stamcellen en de ontwikkeling van de hersenen aanzienlijk bevorderen.

Drie hoofdtechnieken met verschillende sterktes zijn op grote schaal toegepast om de translationele status van mRNA te beoordelen, waaronder ribosoomprofilering, het vertalen van ribosoomaffiniteitszuivering (TRAP) en polysoomprofilering. Ribosoomprofilering maakt gebruik van RNA-sequencing om ribosoombeveiligde mRNA-fragmenten te bepalen, waardoor de globale analyse van het aantal en de locatie van het vertalen van ribosomen op elk transcript indirect de vertaalsnelheid kan afleiden door het te vergelijken met transcriptie overvloed¹¹. TRAP maakt gebruik van epitoop-gelabelde ribosomale eiwitten om ribosoomgebonden mRNAs te vangen¹². Aangezien de gelabelde ribosomale eiwitten kunnen worden uitgedrukt in specifieke celtypen met behulp van genetische benaderingen, maakt TRAP de analyse van vertaling op een celtypespecifieke manier mogelijk. Ter vergelijking, polysoomprofilering, waarbij sucrosedichtheidsgradiëntfractie wordt gebruikt om vrije en slecht vertaalde porties (lichtere monosomen) te scheiden van die welke actief worden vertaald door ribosomen (zwaardere polysomen), biedt een directe meting van de ribosoomdichtheid op mRNA¹³. Een voordeel van deze techniek is de veelzijdigheid om de vertaling van specifiek mRNA van belang te bestuderen, evenals genoombrede vertaalanalyse¹⁴.

In dit artikel beschrijven we een gedetailleerd protocol van polysomale profilering om de zich ontwikkelende hersenschors van muizen te analyseren. We gebruiken een zelfgeassembleerd systeem om sucrosedichtheidsgradiënten voor te bereiden en fracties te verzamelen voor downstreamtoepassingen. Het hier gepresenteerde protocol kan eenvoudig worden aangepast om andere soorten weefsels en organismen te analyseren.

Protocol

Al het diergebruik werd gecontroleerd door de Animal Care Committee van de Universiteit van Calgary. CD1-muizen die voor het experiment werden gebruikt, werden gekocht bij de commerciële leverancier.

1. Voorbereiding van oplossingen

OPMERKING Om RNA-afbraak te voorkomen, moet u de werkbank en alle apparatuur met RNase-ontsmettingsoplossing spuiten. Voor het experiment worden RNase-vrije tips gebruikt. Alle oplossingen worden bereid in RNase-vrij water.

1. Bereid cycloheximide voorraadoplossing (100 mg/ml) in DMSO en bewaar bij -20 °C.
2. Bereid 2,2 M sacharosevoorraadoplossing door 75,3 g sacharose toe te voegen aan RNase-vrij water en het volume bij te vullen tot 100 ml (voor ~16 gradiëntvoorbereiding). De oplossing kan op -20 °C worden bewaard voor langdurige opslag.
3. Bereid 10x zoutoplossing (1 M NaCl; 200 mM Tris-HCl, pH 7,5; 50 mM MgCl₂).
4. Bereid 60% (w/v) sucrose chase-oplossing, die 30 g sacharose, 5 ml 10x zoutoplossing bevat en vul het volume aan tot 50 ml met RNase-vrij water.
5. Voeg eventueel een vlekje bromofenolblauw of ongeveer 5 μL 1% bromoffenolblauw in RNase-vrij water toe aan de chase-oplossing. 1.6. Bewaar oplossingen bij 4 °C.

2. Voorbereiding van sacharosegradiënt

OPMERKING: Nauwkeurigheid bij de voorbereiding van sacharosegradiënten is van cruciaal belang voor het verkrijgen van consistente en reproduceerbare resultaten.

1. Om zes 10-50% sacharosegradiënten te bereiden, verdun 2,2 M sacharoseoplossing zoals in tabel 1.

Sucrose-oplossing	10%	20%	30%	40%	50%
2.2 M sucrose	2 ml	4 ml	6 ml	8 ml	10 ml
10X zoutoplossing	1,5 ml	1,5 ml	1,5 ml	1,5 ml	1,5 ml
Cycloheximide	15 μL	15 μL	15 μL	15 μL	15 μL
Water	11,5 ml	9,5 ml	7,5 ml	5,5 ml	3,5 ml
Totaal volume	15 ml	15 ml	15 ml	15 ml	15 ml

Tabel 1: Sacharoseverdunningen voor preparaten van sacharosegradiënten.

OPMERKING: Bereid sucrosegradiënten altijd in veelvouden van twee voor om het gewicht tijdens ultracentrifugatie in evenwicht te brengen.

2. Veeg de metalen stompe eindnaald af met RNase decontaminatieoplossing. Spoel de ultracentrifugebuizen, slangen en de spuit kort af met RNase-vrij water. Droog de buizen aan de lucht zodat er geen waterdruppel in de buizen achterkomt, omdat het resterende water de sacharoseconcentratie zal veranderen.
3. Plaats de metalen naald op de klemhouder en de centrifugebuis op het gemotoriseerde podium. Om gradiënten consistent voor te bereiden, werd een zelfgemonteerd systeem gebruikt dat een gemotoriseerde fase bevat om de ultracentrifugebuis vast te houden en een spuitpomp om sacharoseoplossingen te injecteren(figuur 1,zie stap 9 voor meer informatie).
4. Vul een spuit van 30 ml met ~16 ml 10% sacharose (genoeg voor zes verlopen), plaats deze op de spuitpomp en sluit deze aan op de naald. Zorg ervoor dat er geen luchtbellen in de spuit, slang en naald zitten. Veeg de punt van de naald af om eventuele restoplossing te verwijderen.
5. Beweeg het gemotoriseerde podium zo omhoog dat de punt van de naald het midden van de buis aan de onderkant raakt.
6. Stel de spuitpomp in op een debiet van 2 ml/min voor een volume van 2,3 ml.
7. Na het doseren van 2,3 ml 10% sacharoseoplossing, gaat u de gemotoriseerde fase in en herhaalt u het proces voor alle zes gradiënten.
8. Herhaal stap 2.4-2.7 om 20% sacharoseoplossing aan de onderkant van de buizen toe te voegen, gevolgd door 30%, 40% en 50% sacharoseoplossingen op dezelfde manier.
9. Sluit na de bereiding van de gradiënt de ultracentrifugebuis af met een paraffinefilm.
10. Laat de buizen 's nachts bij 4 °C staan, zodat de verschillende sacharoselagen samen diffuus zijn om een continue gradiënt te geven.

3. Weefseldissectie

OPMERKING: Zwangere muizen werden geëuthanaseerd door cervicale dislocatie voorafgegaan door anesthesie met 5% isofluraan.

1. Verzamel CD1-muisembryo's op embryonale dag 12, of indien nodig andere tijdspunten, en plaats embryo's in een Ø 10 cm plaat met ijskoude Hank's Balanced Salt Solution (HBSS) op ijs om de levensvatbaarheid van de cel te behouden.
2. Breng onder dissectiebereik één embryo over op een plaat van Ø 6 cm met ijskoude HBSS.
3. Gebruik naalden van 21-23 G om de positie van het hoofd te bevestigen door onder een hoek van ongeveer 45° door de ogen te penetreren en kracht uit te brengen om ervoor te zorgen dat de naalden op de plaat zijn bevestigd (afbeelding 2A).
4. Gebruik no.5 tang om huid en schedel te verwijderen, van het midden naar de zijkanten.
5. Gebruik een tang om de olfactorische bollen te snijden en de hersenvliezen te verwijderen om de corticale weefsels bloot te leggen.3.6.Gebruik gebogen tangen om de corticale weefsels in 2-3 ml neurobasaal medium op ijs te snijden (Figuur 2B). Pool corticale weefsels van verschillende embryo's indien nodig. Weefsels van 8-10 embryo's geven meestal ~200 μg totaal RNA.

4. Cellysis

1. Bereid op de dag van weefseldissectie een nieuwe cellysebuffer voor zoals beschreven in tabel 2.

oplossing	Eindconcentratie	volume
Tris-HCl (pH 7,5)	20 mM	100 μL
Kcl	100 mM	250 μL
MgCl2	5 mM	25 μL
Triton X-100	1% (v/v)	500 μL
Natriumdeoxycholaat	0,5% (w/v)	500 μL
Dithiothreitol (DTT)	1 mM	5 μL
Cycloheximide	100 μg/ml	5 μL
RNase vrij water		Opvullen tot 5 ml
totaal	5 ml	5 ml

Tabel 2: Bereiding van polysoomlysebuffer.

OPMERKING: Vul de lysisbuffer aan met protease- en fosfataseremmers.

2. Voeg cycloheximide toe aan het neurobasale medium met ontlede weefsels tot een eindconcentratie van 100 μg/ml en incubeer gedurende 10 minuten bij 37 °C. Cycloheximide blokkeert de verlenging van de vertaling en voorkomt daarom ribosoom afvloeiing ¹⁵.
3. Centrifugeer bij 500 x g gedurende 5 min bij 4 °C en gooi het supernatant weg.
4. Was de weefsels tweemaal met ijskoude fosfaatgebufferde zoutoplossing (PBS) aangevuld met 100 μg/ml cycloheximide.
5. Voeg 500 μL cellysebuffer toe, aangevuld met 4 μL RNase-remmer. Pipetteer op en neer om het weefsel in de lysisbuffer te resuspenderen. Gebruik een insulinenaald om het weefsel voorzichtig te lyseren.
6. Incubeer de weefsels gedurende 10 minuten op ijs met korte vortexing elke 2-3 minuten.
   OPMERKING: Om weefselafbraak te voorkomen, moet u ervoor zorgen dat alle stappen van weefsellyse op ijs worden uitgevoerd.
7. Centrifugeer bij 2.000 x g gedurende 5 min bij 4 °C.
8. Breng het supernatant over in een nieuwe centrifugebuis op ijs.
9. Centrifugeer bij ~13.000 x g gedurende 5 min bij 4 °C.
10. Breng het supernatant over in een nieuwe centrifugebuis op ijs.
11. Meet de RNA-concentratie in het weefsellysaat met behulp van een UV-Vis spectrofotometer.
    OPMERKING: Als er meerdere monsters in het experiment zijn opgenomen, verdun de monsters dan tot dezelfde concentratie met een extra cellysebuffer om variatie te minimaliseren.

5. Monsterbelasting en ultracentrifugatie

1. Koel de ultracentrifugatierotor en zwenkbakken vooraf af op 4 °C en stel de temperatuur van de ultracentrifuge in op 4 °C.
2. Houd 20 μL van het weefsellysaat als totale RNA-input.
3. Bemonsteringsmonsters (50-300 μg RNA met een gelijk volume) op de bovenkant van de sacharosegradiënten door het lysaat langzaam aan de wanden van de ultracentrifugebuizen te doseren.
4. Plaats de ultracentrifugebuizen voorzichtig in de schommelemmer. Zorg ervoor dat alle diametraal tegenover elkaar geplaatste emmers in evenwicht zijn.
5. Laad de zwenkemmers op de rotor. Zet de ultracentrifuge gedurende 90 minuten op 190.000 x g (~39.000 tpm) bij 4 °C.
6. Plaats de hellingen voorzichtig op ijs na centrifugeren.

6. Fractionering en monsterverzameling

OPMERKING: Voor de analyse en het verzamelen van monsters uit de gradiënten wordt een zelfgeassembleerd fractionerings-, opname- en verzamelsysteem gebruikt(figuur 3, zie Apparaatcomponenten).

1. Plaats een lege ultracentrifugebuis op de buispiercing en penetreer voorzichtig de buis met de naald van de bodem.
2. Schakel de UV-monitor in en open de digitale signaalopnamesoftware.
3. Vul een spuit van 30 ml met 25 ml 60% sucrose chase-oplossing. Druk voorzichtig op de spuit zodat de chase-oplossing de lege buis vult en door de 254 nm UV-monitor gaat om de basislijn voor detectie in te stellen.
4. Druk op auto-zero op de UV-monitor om een basislijn voor detectie te registreren. Druk op afspelen op de software om te beginnen met opnemen.
5. Zodra het systeem een basislijn heeft vastgesteld, pauzeert u de opname op de software en trekt u de chase-oplossing in. Zorg ervoor dat er geen restachtervolgingsoplossing in het systeem achter blijft.
   OPMERKING: Spoel het systeem af met RNase-vrij water om resterende sacharoseoplossingen uit de vorige run te verwijderen.
6. Plaats één monsterbuis in de buispiercing. Penetreer voorzichtig de buis met de naald vanaf de onderkant.
7. Begin met opnemen op de software. Start de spuitpomp (debiet van 1 ml/min voor een volume van 25 ml) en de fractiecollector om polysomale fracties te verzamelen. Stel fractionatorinstellingen in op 30 s.
   OPMERKING: Zorg ervoor dat er voor elke run geen luchtbellen in de spuit of de slang zitten door zachtjes op de spuit te drukken om de achtervolgingsoplossing continu door de naald te laten stromen.
8. Verzamel de fracties in buizen van 1,5 ml (elk 500 μL) met behulp van een fractiecollector.
9. De fracties kunnen onmiddellijk worden verwerkt of opgeslagen bij -80 °C.
10. Spoel het systeem na het verzamelen van de fractie af met RNase-vrij water om eventuele resten sacharose te verwijderen.

7. Extractie van RNA

1. Voeg aan elke fractie 10 ng luciferase mRNA spike-in control toe.
2. Voeg drie volumes guanidium hydrocholride gebaseerd commercieel RNA isolatiereagens toe aan elke fractie.
3. Vortex kort gedurende 15 s.
4. Extract RNA met behulp van een RNA-extractiekit die compatibel is met de oplossing die in 7.2 wordt gebruikt.

8. Omgekeerde transcriptie en real-time PCR

1. Meet de concentratie van het RNA met behulp van UV-Vis spectrofotometer.
2. Onderwerp RNA aan omgekeerde transcriptie met behulp van een cDNA-synthesekit, volgens het protocol van de fabrikant.
3. Gebruik kwantitatieve real-time PCR (qPCR) om de polysomale verdeling van gapdh mRNA als voorbeeld te onderzoeken. qPCR werd uitgevoerd met behulp van een qPCR-detectiesysteem en een qPCR mastermix-reagens, met de volgende cyclusomstandigheden: 95 °C gedurende 10 minuten, vervolgens 40 cycli van 95 °C gedurende 15 s, 60 °C voor 30 s, 72 °C gedurende 40 s, gevolgd door 95 °C gedurende 60 s.
4. Verkrijg drempelwaarde (Ct) waarden uit de versterkingspercelen en gebruik deze om vouwverandering te berekenen met behulp van de ΔΔCt-methode.

9. Sucrose gradiënt maken systeemassemblage

OPMERKING: Volg de stappen om elk onderdeel (zoals beschreven in tabel 3) van de sacharosegradiëntmaker (figuur 1) te monteren.

1. Monteer twee verticale beugels (A2) op de plint (A1).
2. Gebruik twee slanke haakse beugels (B2) om de lineaire trapactuator op de plint (A1) te monteren.
3. Gebruik de setcrew op de Ø12,7 mm aluminium paal (C2) om deze op de buishouder plint (C1) te bevestigen als standaard voor de buishouder.
4. Monteer de haakse Ø1/2" tot Ø6 mm paalklem (C3) met de paal (C2) en de optische post uit de miniserie (C4).
5. Gebruik de stelschroef op de optische paal (C4) om een kleine V-klem (C5) als buishouder aan te sluiten.
6. Plaats een centrifugebuis in de buishouder en pas de hoek aan om deze verticaal te maken. Markeer de positie van de buis en monteer de voetstukpenhouder (C6) op de plint (C1) om de buis te ondersteunen.
7. Gebruik aan de andere kant van het breadboard (A1) de stelschroef van de Ø12,7 mm aluminium paal (D1) om deze te bevestigen en sluit een optische paal uit de miniserie (D3) aan met behulp van een haakse Ø1/2" tot Ø6 mm paalklem (D2).
8. Sluit de miniatuur V-klem (D4) met stompe naald (D5) aan op de paal (D3). Pas de hoek van de klem aan om de naald verticaal in te stellen en pas de lengte van de paal aan om ervoor te zorgen dat de naald de centrifugebuis ontmoet.
9. Sluit de actuator (B1) aan op de stappenmotordriver (E1) en gebruik de UNO R3-controllerkaart en de joystickmodule uit de UNO-starterkit (E2) om de actuator te bedienen. Een voedingsadapter (bijv. 9-24 V AC/DC verstelbare voedingsadapter) kan worden gebruikt om de motor afzonderlijk aan te drijven.
10. Plaats de spuitpomp (F) naast het verloopvormingsstation en sluit de spuit aan op de naald.
11. Bedien de buishoudertrap op en neer met behulp van de joystick.

bestanddeel	item
B1	Lineaire stadiumactuator
E1	Stappenmotor bestuurder
E2	UNO project super starter kit
A1	broodplank
A2	Verticale beugel
B2	Slanke haakse beugel
C1	Mini-serie breadboard
C5	Kleine V-klem
D4	Miniatuur V-klem
C2	Ø12,7 mm aluminium paal
C4, D3	Mini-serie optische post
D1	Ø12,7 mm aluminium paal
C3, D2	Haakse Ø1/2" tot Ø6 mm paalklem
C6	Mini-serie voetstuk posthouder basis
D5	Stompe eindnaald
F.	Spuitpomp

Tabel 3: Verloop maken van systeemcomponenten.

10. Fractioneren en detecteren van systeemassemblage (figuur 2).

1. Gebruik een gewone ronde kaak buretklem om de optiekmodule van de UV-monitor op de buispiercing te monteren. Bevestig het ene uiteinde van de slang (1 cm lang en 0,56 mm inwendige diameter) aan de verbindingskabel van de buispiercing en het andere uiteinde aan de fluid in-poort van de optiekmodule. Sluit de Fluid Out-poort aan op de fractionator.
2. Sluit de optiekmodule aan op de besturingseenheid van de UV-monitor volgens de handleiding van de fabrikant.
3. Gebruik een breakout-kabel om de signaaluitgangsaansluiting aan te sluiten op de digitale converter aan de grond- en analoge ingangsaansluitingen, volgens de handleiding van de fabrikant.
4. Sluit de digitale converter aan op een laptop met behulp van een gewone USB-kabel en neem de geconverteerde digitale signalen op met behulp van software voor gegevensverzameling.

Results

Als demonstratie werd het corticale lysaat met 75 μg RNA (gepoold uit 8 embryo's) gescheiden door de sacharosegradiënt in 12 fracties. Pieken van UV-absorptie bij 254 nm geïdentificeerde fracties die de 40S-subeenheid, 60S-subeenheid, 80S-monosomen en polysomen bevatten (figuur 4A). Analyse van breuken door westelijke vlek voor de grote ribosomale subeenheid, Rpl10 toonde zijn aanwezigheid in de 60S subeenheid (breuk 3), monosomen (breuk 4) en polysomen (fracties 5-12) (...

Discussion

Polysomale profilering is een veelgebruikte en krachtige techniek om de translationele status te beoordelen op zowel single gene als genoombrede niveaus¹⁴ . In dit rapport presenteren we een protocol van polysomenprofilering met behulp van een thuisgeassembleerd platform en de toepassing ervan om de zich ontwikkelende muisschors te analyseren. Dit kosteneffectieve platform is eenvoudig te monteren en genereert robuuste, reproduceerbare sacharosegradiënten en polysoomprofilering met hoge gevoelighe...

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
1.5 mL RNA free microtubes	Axygen	MCT-150-C
10 cm dish	Greiner-Bio	664160
1M MgCl2	Invitrogen	AM9530G
21-23G needle	BD	305193
2M KCl	Invitrogen	AM8640G
30 mL syringe	BD	302832
Blunt end needle	VWR	20068-781
Breadboard	Thorlabs	MB2530/M
Bromophenol blue	Sigma	115-39-9
CD1 mouse		Charles River Laboratory
Curved tip forceps	Sigma	#Z168785
Cycloheximide		Sigma	66-81-9
Data acquisition software TracerDAQ	Measurement Computing
Digital converter		Measurement Computing	USB-1208LS
Direct-zol RNA miniprep kit	Zymo	R2070
Dithiothreitol (DTT)	Bio-basic	12-03-3483
DMSO	Bioshop	67-68-5
Dumont No.5 forceps	Sigma	#F6521
Fraction collector	Bio-Rad	Model 2110
HBSS	Wisent	311-513-CL
Linear stage actuator	Rattmmotor	CBX1605-100A
Luciferase control RNA	Promega	L4561
Maxima first strand cDNA synthesis kit	Themo Fisher	M1681
Miniature V-clamp	Thorlabs	VH1/M
Mini-series breadboard	Thorlabs	MSB7515/M
Mini-series optical post	Thorlabs	MS2R/M
Mini-series pedestal post holder base	Thorlabs	MBA1
NaCl	Bio-basic	7647-14-5
Neurobasal media	Gibco	21103-049
Ø12.7 mm aluminum post	Thorlabs	TRA150/M
Parafilm	Bemis	PM992
PerfeCTa SYBR green fastmix	Quanta Bio	CA101414-274
Phosphate buffered saline (PBS)	Wisent	311-010-CL
Puromycin	Bioshop	58-58-2
Right-angle clamp	Thorlabs	RA90/M
Right-angle Ø1/2" to Ø6 mm post clamp	Thorlabs	RA90TR/M
Rnase AWAY	Molecular BioProducts	7002
RNase free tips	Frogga Bio	FT10, FT200, FT1000
RNase free water	Wisent	809-115-CL
RNasin	Promega	N2111
Slim right-angle bracket	Thorlabs	AB90B/M
Small V-clamp	Thorlabs	VC1/M
Sodium deoxycholate	Sigma	302-95-4
Stepper motor driver	SongHe	TB6600
Sucrose	Bioshop	57501
SW 41 Ti rotor	Beckman Coulter	331362
Syringe pump	Harvard Apparatus	70-4500
Syringe pump	Harvard Apparatus	70-4500
Triton-X-100	Bio-basic	9002-93-1
Trizol	Thermofisher Scientific	15596018
Tube piercer	Brandel	BR-184
Ultracentrifuge		Beckman Coulter	L8-70M
Ultracentrifuge tubes	Beckman Coulter	331372
UltraPure 1M Tris-HCl pH 7.5	Invitrogen	15567-027
UNO project super starter kit	Elegoo	EL-KIT-003
UV monitor	Bio-Rad	EM-1 Econo
Vertical bracket	Thorlabs	VB01A/M