Efficiënte en schaalbare generatie van menselijke ventrale middenhersenastrocyten uit door de mens geïnduceerde pluripotente stamcellen

Samenvatting

Hier presenteren we een methode voor het reproduceerbaar genereren van astrocyten met ventrale middenhersenen uit hiPSC's en protocollen voor hun karakterisering om het fenotype en de functie te beoordelen.

Samenvatting

Bij de ziekte van Parkinson veroorzaken progressieve disfunctie en degeneratie van dopamine-neuronen in de ventrale middenhersenen levensveranderende symptomen. Neuronale degeneratie heeft verschillende oorzaken bij Parkinson, waaronder niet-celonafhankelijke mechanismen die worden gemedieerd door astrocyten. In het hele CZS zijn astrocyten essentieel voor de overleving en functie van neuronen, omdat ze de metabole homeostase in de neurale omgeving behouden. Astrocyten interageren met de immuuncellen van het CZS, microglia, om neuro-inflammatie te moduleren, die vanaf de vroegste stadia van Parkinson wordt waargenomen en een directe invloed heeft op de progressie van de pathologie ervan. Bij ziekten met een chronisch neuro-inflammatoir element, waaronder Parkinson, krijgen astrocyten een neurotoxisch fenotype en versterken zo neurodegeneratie. Bijgevolg zijn astrocyten een potentieel therapeutisch doelwit om de ziekte te vertragen of te stoppen, maar dit vereist een beter begrip van hun eigenschappen en rol bij Parkinson. Nauwkeurige modellen van menselijke ventrale middenhersenastrocyten voor in vitro onderzoek zijn daarom dringend nodig.

We hebben een protocol ontwikkeld om zeer zuivere culturen van ventrale middenhersenspecifieke astrocyten (vmAstro's) te genereren uit hiPSC's die kunnen worden gebruikt voor onderzoek naar Parkinson. vmAstros kan routinematig worden geproduceerd uit meerdere hiPSC-lijnen en specifieke astrocytaire en ventrale middenhersenmarkers tot expressie brengen. Dit protocol is schaalbaar en dus geschikt voor high-throughput toepassingen, waaronder voor drug screening. Cruciaal is dat de hiPSC afgeleide-vmAstro's immunomodulerende kenmerken vertonen die typisch zijn voor hun in vivo tegenhangers, waardoor mechanistische studies van neuro-inflammatoire signalering bij Parkinson mogelijk zijn.

Inleiding

De ziekte van Parkinson treft 2%-3% van de mensen ouder dan 65 jaar, waardoor het de meest voorkomende neurodegeneratieve bewegingsstoornis is¹. Het wordt veroorzaakt door degeneratie van dopamine-neuronen in de ventrale middenhersenen in de substantia nigra, wat resulteert in slopende motorische symptomen, evenals frequente cognitieve en psychiatrische problemen². De pathologie van Parkinson wordt gekenmerkt door aggregaten van het eiwit α-synucleïne, die giftig zijn voor neuronen en resulteren in hun disfunctie en dood ^1,2,3

Protocol

1. Menselijke hiPSC-lijn ontdooien, onderhouden en cryopreservatie

1. Voor het coaten van hiPSC-kweekplaten verdunt u vitronectine tot 5 μg/ml (1:100) in PBS met 1 ml per 10 cm 2-celkweekplaatoppervlak. Laat 1 uur op kamertemperatuur staan.
2. Verwijder vitronectine en ga onmiddellijk over tot het toevoegen van hiPSC's/media aan de kweekplaat.
   NOTITIE Bij het verwijderen van vitronectine van de plaat is het van cruciaal belang dat het kweekoppervlak niet uitdroogt.
3. Om hiPSC's te ontdooien, verwijdert u cryovials met hiPSC's uit vloeibare stikstof en plaatst u deze in een waterbad van 37 °C totd....

Resultaten

Differentiatiemethodologie en progressie
Hier presenteren we de details van zowel de methoden die worden gebruikt voor het genereren van vmAstro's als de protocollen die worden gebruikt voor hun daaropvolgende fenotypische karakterisering. De methode voor het genereren van vmAstros bestaat uit verschillende verschillende differentiatiestadia, die kunnen worden gevolgd door microscopie en het identificeren van verschillende morfologische kenmerken (

Discussie

Deze methode voor het genereren van vmAstro's uit hiPSC's is zeer efficiënt, genereert zuivere culturen van vmAstro's en is reproduceerbaar voor het genereren van vmAstro's uit verschillende hiPSC-lijnen. Dit protocol is ontwikkeld rond de recapitulatie van de ontwikkelingsgebeurtenissen die in het embryo nodig zijn om de zich ontwikkelende middenhersenen correct te vormen en astrocyten te genereren en omvat drie gedefinieerde fasen: 1) neurale ventrale middenherseninductie om vmNPC's te.......

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel

Naam	Bedrijf	Catalogusnummer	Opmerkingen
Reagenten
0.2M Tris-Cl (pH 8.5)	n/a	n/a	Samengesteld uit Tris-base en plus HCl
0.5M EDTA, PH 8	ThermoFisher	15575-020	1:1000 in D-PBS tot 0,5 mM eindconcentratie
1,4-diazabicylo[2.2.2]octane (DABCO)	Sigma	D27802-	25 mg/mL in Mowiol montageoplossing
13 mm dekvlakken	VWR	631-0149
2-Mercaptoethanol (50 mM)	ThermoFisher	31350010
Accutase	ThermoFisher	13151014
Advanced DMEM/F12	ThermoFisher	12634010	Bevat 1x NEAA maar we voegen toe tot de eindconcentratie van 2x (0,2 mM)
Ascorbic acid	Sigma	A5960	200 mM stock, 1:1000 tot 200 µM eindconcentratie
B27 Supplement	ThermoFisher	17504-044	50x stock
BSA	Sigma	5470
Cell freezing media	Sigma	C2874	Cryostor CS10
Cell freezing vessel	Nalgene	5100-0001
CHIR99021	Axon Medchem	1386	0,8 mM stock, 1:1000 verdunning tot 0,8 µM eindconcentratie
Cryovials	Sigma	CLS430487
DAPI	Sigma	D9542	1 mg/mL, 1:10.000 tot 100ng/mL eindconcentratie (in PBS)
DMEM/F12 + Glutamax	ThermoFisher	10565018
Dulbeccos-PBS (D-PBS zonder Mg of Ca)	ThermoFisher	14190144	pH 7,2
E8 Flex medium kit	ThermoFisher	A2858501
Formaldehyde (36% oplossing)	Sigma	47608
Geltrex	ThermoFisher	A1413302	1:100 of 1:400 in ijskoud DMEM/F12
Glutamax	ThermoFisher	35050038	2 mM stock (1:200 in N2B27, 1:100 in ASTRO media tot 20 µM eindconcentratie)
Glycerol	Sigma	G5516
Human BDNF	Peprotech	450-02	20 µg/mL stock, 1:1000 tot 20 ng/mL eindconcentratie
Human BMP4	Peprotech	120-05	20 µg/mL stock, 1:1000 tot 20 ng/mL eindconcentratie
Human EGF	Peprotech	AF-100-15	20 µg/mL stock, 1:1000 tot 20 ng/mL eindconcentratie
Human GDNF	Peprotech	450-10	20 µg/mL stock, 1:1000 tot 20 ng/mL eindconcentratie
Human insulin solution	Sigma	I9278	10 mg/mL stock, 1:2000 tot 5 µg/mL eindconcentratie
Human LIF	Peprotech	300-05	20 µg/mL stock, 1:1000 tot 20 ng/mL eindconcentratie
IL-6 ELISA kit	Biotechne	DY206
Isopropanol	Sigma	I9516-4L	Voor het vullen van Mr Frosty cryostorage vessel
LDN193189	Sigma	SML0559	100 µM stock, 1:10.000 verdunning tot 10 nM eindconcentratie
Mowiol 40-88	Sigma	324590
N2 Supplement	ThermoFisher	17502048	100x stock
NEAA	ThermoFisher	11140035	10 mM stock, 1:100 tot 0,1 mM eindconcentratie
Neurobasal media	ThermoFisher	21103049
Normal Goat serum	Vector Labs	S-1000-20
Revitacell	ThermoFisher	A2644501	100x stock, 1:100 tot 1x eindconcentratie
SB431542	Tocris	1614	10 mM stock, 1:1000 verdunning tot 10 µM eindconcentratie
SHH-C24ii	Biotechne	1845-SH-025	200 µg/mL stock, 1:1000 tot 200 ng/mL eindconcentratie
Tris-HCl	Sigma	PHG0002
Triton-X	Sigma	X100
Tween-20	Sigma	P7949
Vitronectin	ThermoFisher	A14700	1:50 in D-PBS
Antilichamen voor immunocytochemie	Bedrijf	Catalogusnummer	Gastheersoort
Antilichaam tegen S100b	Sigma	SAB4200671	Muis; 1:200
Antilichaam tegen FOXA2	SCBT	NB600501	Muis; 1:50
Antilichaam tegen LMX1A	ProSci	7087	Konijn; 1:300
Antilichaam tegen LMX1A	Millipore	AB10533	Konijn; 1:2000
Antilichaam tegen LMX1B	Proteintech	18278-1-AP	Konijn; 1:300
Antilichaam tegen GLAST	Proteintech	20785-1