Methodenartikel

Efficiënte en schaalbare generatie van menselijke ventrale middenhersenastrocyten uit door de mens geïnduceerde pluripotente stamcellen

DOI:

10.3791/62095

⸱

2 oktober 2021

 ,  ,  ,  ,  , 
1Cell Biology Laboratories, School of Biochemistry, University of Bristol, Bristol, UK, 2Department of Physiology and Trinity College Institute of Neuroscience, Trinity College, Dublin, Ireland, 3Regenerative Medicine Laboratory, School of Clinical Sciences, University of Bristol, Bristol, UK

* These authors contributed equally

In dit artikel

Samenvatting

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Hier presenteren we een methode voor het reproduceerbaar genereren van astrocyten met ventrale middenhersenen uit hiPSC's en protocollen voor hun karakterisering om het fenotype en de functie te beoordelen.

Samenvatting

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Bij de ziekte van Parkinson veroorzaken progressieve disfunctie en degeneratie van dopamine-neuronen in de ventrale middenhersenen levensveranderende symptomen. Neuronale degeneratie heeft verschillende oorzaken bij Parkinson, waaronder niet-celonafhankelijke mechanismen die worden gemedieerd door astrocyten. In het hele CZS zijn astrocyten essentieel voor de overleving en functie van neuronen, omdat ze de metabole homeostase in de neurale omgeving behouden. Astrocyten interageren met de immuuncellen van het CZS, microglia, om neuro-inflammatie te moduleren, die vanaf de vroegste stadia van Parkinson wordt waargenomen en een directe invloed heeft op de progressie van de pathologie ervan. Bij ziekten met een chronisch neuro-inflammatoir element, waaronder Parkinson, krijgen astrocyten een neurotoxisch fenotype en versterken zo neurodegeneratie. Bijgevolg zijn astrocyten een potentieel therapeutisch doelwit om de ziekte te vertragen of te stoppen, maar dit vereist een beter begrip van hun eigenschappen en rol bij Parkinson. Nauwkeurige modellen van menselijke ventrale middenhersenastrocyten voor in vitro onderzoek zijn daarom dringend nodig.

We hebben een protocol ontwikkeld om zeer zuivere culturen van ventrale middenhersenspecifieke astrocyten (vmAstro's) te genereren uit hiPSC's die kunnen worden gebruikt voor onderzoek naar Parkinson. vmAstros kan routinematig worden geproduceerd uit meerdere hiPSC-lijnen en specifieke astrocytaire en ventrale middenhersenmarkers tot expressie brengen. Dit protocol is schaalbaar en dus geschikt voor high-throughput toepassingen, waaronder voor drug screening. Cruciaal is dat de hiPSC afgeleide-vmAstro's immunomodulerende kenmerken vertonen die typisch zijn voor hun in vivo tegenhangers, waardoor mechanistische studies van neuro-inflammatoire signalering bij Parkinson mogelijk zijn.

Inleiding

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

De ziekte van Parkinson treft 2%-3% van de mensen ouder dan 65 jaar, waardoor het de meest voorkomende neurodegeneratieve bewegingsstoornis is1. Het wordt veroorzaakt door degeneratie van dopamine-neuronen in de ventrale middenhersenen in de substantia nigra, wat resulteert in slopende motorische symptomen, evenals frequente cognitieve en psychiatrische problemen2. De pathologie van Parkinson wordt gekenmerkt door aggregaten van het eiwit α-synucleïne, die giftig zijn voor neuronen en resulteren in hun disfunctie en dood 1,2,3. Aangezien de dopaminerge neuronen de degenererende populatie zijn bij Parkinson, waren ze historisch gezien de focus van onderzoek. Het is echter duidelijk dat een ander celtype in de hersenen, de astrocyten, ook afwijkingen vertonen bij de ziekte van Parkinson en wordt verondersteld bij te dragen aan degeneratie in modellen van Parkinson 4,5,6,7.

Astrocyten zijn een heterogene celpopulatie die zowel fysiek als functioneel kan transformeren als dat nodig is. Ze ondersteunen de neuronale functie en gezondheid via een overvloed aan mechanismen, waaronder de modulatie van neuronale signalering, het vormgeven van synaptische architectuur en trofische ondersteuning van neuronale populaties via secretie van specifieke factoren 6,8,9,10. Astrocyten hebben echter ook een substantiële immunomodulerende rol, een integraal onderdeel van de ontwikkeling en verspreiding van neuro-inflammatie10,11. Neuro-inflammatie wordt waargenomen in de hersenen van Parkinson-patiënten en onlangs is significant aangetoond dat het het begin van de symptomen van Parkinson anticipeert 12,13,14,15, waardoor het centraal komt te staan in het onderzoek naar Parkinson.

Op cellulair niveau wordt gezegd dat astrocyten reactief worden als reactie op verwonding, infectie of ziekte, als een poging om neuroprotectie te vergemakkelijken 9,6,10,16. Reactiviteit beschrijft een verschuiving in het fenotype van astrocyten die wordt gekenmerkt door veranderingen in genexpressie, secretoom, morfologie en mechanismen voor het opruimen van celresten en toxische bijproducten 9,10,11,17. Deze reactieve verschuiving treedt op als reactie op inductieve signalen van microglia, de immuuncellen van het CZS en de eerste responders op letsel en ziekte9. Zowel astrocyten als microglia reageren op ontstekingssignalen door hun eigen functie te modereren en kunnen ontstekingssignalen transduceren en zo neuro-inflammatie rechtstreeks beïnvloeden 9,10. De chronische aard van Parkinson resulteert echter in een overgang waarbij reactieve astrocyten giftig worden voor neuronen en zelf degeneratie en ziektepathologie bevorderen 6,9,10,18,19. Het is veelbetekenend dat onlangs is aangetoond dat het blokkeren van de transformatie van astrocyten naar het reactieve neurotoxische fenotype de progressie van Parkinson in diermodellen voorkomt11. De reactiviteit van astrocyten in het paradigma van neuro-inflammatie is daarom een belangrijk aandachtspunt geworden van het onderzoek naar Parkinson en heeft op dezelfde manier betrekking op een breed spectrum van ziekten van het CZS. Samen vormen deze bevindingen een beeld van significante astrocytaire betrokkenheid bij de etiologie van Parkinson, waarbij de nadruk wordt gelegd op de noodzaak van nauwkeurige onderzoeksmodellen die het fenotype van de menselijke astrocytenpopulaties die betrokken zijn bij Parkinson samenvatten.

In de embryonale hersenen verschijnen eerst neuronen, waarbij de astrogliale afstamming, namelijk de astrocyten en oligodendrocyten, later in de ontwikkeling verschijnt6. In vivo en in vitro studies hebben een aantal signaalroutes aan het licht gebracht die de potentie van neurale voorlopercellen lijken te beheersen, van neuronale tot astrogliale derivaten. Met name JAK/STAT-, EGF- en BMP-signalering spelen een rol bij de proliferatie, differentiatie en rijping van astroglia20,21. Deze routes zijn de focus geweest van in vitro protocollen voor het genereren van astrocyten uit pluripotente cellen, waaronder hiPSC 6,22,23. Er zijn veel succesvolle voorbeelden geweest van het genereren van astrocyten uit hiPSC's 6,24,25. Het is echter duidelijk dat in vivo astrocyten in het CZS specifieke regionale identiteiten bezitten, die rechtstreeks verband houden met hun functie, in overeenstemming met de specifieke vereisten van die astrocyten met betrekking tot hun gespecialiseerde neuronale buren 17,24,25,26. Bijvoorbeeld, specifiek met betrekking tot de ventrale middenhersenen, is aangetoond dat astrocyten in dit gebied specifieke sets eiwitten tot expressie brengen, waaronder receptoren voor dopamine die communicatie mogelijk maken met de lokale populatie van dopamine-neuronen in de middenhersenen26. Bovendien vertonen ventrale middenhersenastrocyten unieke signaaleigenschappen26. Om de rol van ventrale middenhersenastrocyten bij Parkinson te bestuderen, hebben we daarom een in vitro model nodig dat hun unieke reeks kenmerken weerspiegelt.

Om dit aan te pakken, hebben we een protocol ontwikkeld om ventrale middenhersenastrocyten (vmAstros) te genereren uit hiPSC's. De resulterende vmAstro's vertonen kenmerken van hun in vivo ventrale tegenhangers in de middenhersenen, zoals expressie van specifieke eiwitten, evenals immunomodulerende functies. De gepresenteerde resultaten zijn afkomstig van de differentiatie van de NAS2 en AST23 hiPSC-lijnen, die zijn afgeleid en aan ons zijn geschonken door Dr. Tilo Kunath27. NAS2 werd gegenereerd door een gezonde controlepersoon, terwijl AST23 is afgeleid van een Parkinson-patiënt met een drievoudige aandoening in de locus die codeert voor α-synucleïne (SNCA). Deze hiPSC-lijnen zijn eerder gekarakteriseerd en gebruikt in een aantal gepubliceerde onderzoekspapers, waaronder voor het genereren van verschillende neurale celtypen 27,28,29,30,31.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. Menselijke hiPSC-lijn ontdooien, onderhouden en cryopreservatie

  1. Voor het coaten van hiPSC-kweekplaten verdunt u vitronectine tot 5 μg/ml (1:100) in PBS met 1 ml per 10 cm 2-celkweekplaatoppervlak. Laat 1 uur op kamertemperatuur staan.
  2. Verwijder vitronectine en ga onmiddellijk over tot het toevoegen van hiPSC's/media aan de kweekplaat.
    NOTITIE Bij het verwijderen van vitronectine van de plaat is het van cruciaal belang dat het kweekoppervlak niet uitdroogt.
  3. Om hiPSC's te ontdooien, verwijdert u cryovials met hiPSC's uit vloeibare stikstof en plaatst u deze in een waterbad van 37 °C totdat de inhoud volledig is ontdooid.
  4. Bereid 9 ml voorverwarmd celkweekmedium (bijv. E8 of E8 Flex) met 1x celsupplement (bijv. Revitacell). Voeg 1 ml druppelsgewijs toe aan de inhoud van de cryovial. Plaats de resterende media van 8 ml in een centrifugebuis van 15 ml en voeg hieraan de verdunde inhoud van de cryovial toe.
    LET OP: Vervalseer de inhoud niet.
  5. Centrifugeer op 150 x g gedurende 3 min. Zuig de vloeistof op zonder de celpellet te verstoren en opnieuw te suspenderen in een geschikt volume celkweekmedium (bijv. E8 of E8 Flex) met 1x celsupplement (bijv. Revitacell). Bijvoorbeeld 2 ml per putje van een plaat met 6 putjes.
  6. Voeg geresuspendeerde hiPSC's toe aan met vitronectine beklede schalen en plaats deze in een incubator van 37 °C/5% CO2 .
    OPMERKING: hiPSC's moeten zich binnen 30 min-2 uur na ontdooien beginnen te hechten aan met vitronectine gecoat plastic.
  7. Behoud hiPSC's in celkweekmedium (bijv. E8 of E8 Flex). Voed cellen dagelijks door media-uitwisseling. Verwarm de kweekmedia altijd 30 minuten voor voordat u ze gaat voeren.
    NOTITIE Als u E8 Flex gebruikt, hoeven hiPSC's niet elke 24 uur van de media te worden gewisseld en kunnen de invoerstappen indien nodig worden verlengd tot 48 uur. E8 Flex- of E8-media leveren hiPSC-culturen van even hoge kwaliteit op. HiPSC's moeten minimaal 14 dagen na het ontdooien worden gekweekt en voordat met de differentiatiestappen wordt begonnen. Kweekperioden van minder dan 14 dagen lijken een negatieve invloed te hebben op de overleving van de hiPSC's tijdens de initiële differentiatieperiode. Passage hiPSC's bij ongeveer 80% samenvloeiing (Figuur 1A: 3-4 dagen passage-interval).
  8. Voeg 1 uur voor aanvang 1x celsupplement (bijv. Revitacell) toe aan de hiPSC-cultuur.
  9. Was hiPSC's eenmaal met PBS (zonder calcium of magnesium) en voeg 0,5 mM EDTA toe (verdund uit voorraad in PBS zonder calcium of magnesium).
  10. Incubeer gedurende 5 minuten bij kamertemperatuur, of totdat de hiPSC's van elkaar beginnen los te komen en een ronder uiterlijk krijgen, waarbij de grenzen van elke iPSC helderder lijken onder een helderveldmicroscoop.
  11. Voeg met een pipet 200 μL EDTA toe aan een gericht gebied van de hiPSC's. Als ze gemakkelijk loskomen en een vrije ruimte in de cellaag maken, zijn ze klaar om te worden geoogst. Als ze niet gemakkelijk loskomen, laat ze dan in EDTA zitten en herhaal na 1 minuut.
  12. Als u klaar bent om verder te gaan, verwijdert u voorzichtig EDTA en wast u de hiPSC's met een pipet voorzichtig twee keer met celkweekmedium (bijv. E8 of E8 Flex).
    NOTITIE: Om dit te bereiken zonder dat de hiPSC's losraken, kantelt u de plaat en voegt u de media druppelsgewijs toe langs de zijkant van de kweekplaat.
  13. Gebruik voor het oogsten van hiPSC's 1 ml celkweekmedium (bijv. E8 of E8 Flex) met 1x celsupplement (bijv. Revitacell). Laat de media direct op de hiPSC-laag los en de cellen zouden moeten loskomen. Herhaal indien nodig met een ander medium van 1 ml.
  14. Bekijk de hiPSC's onder de microscoop. Idealiter zouden hiPSC's in relatief uniforme clusters moeten verschijnen, zoals weergegeven in Figuur 1B. Als hiPSC-clusters veel groter zijn, of zeer variabel in grootte, gebruik dan de pipet om de grotere hiPSC-clusters te breken (Figuur 1B).
    OPMERKING Over-tritureer hiPSC's niet. Hoewel het supplement de algehele celoverleving verhoogt, heeft overtrituratie een negatieve invloed op de overleving van de hiPSC-cultuur. 1-4 passen met een pipet worden aanbevolen.
  15. Breng de hiPSC-suspensie met behulp van een serologische pipet over op een met vitronectine beklede plaat zoals bereid in stap 1.1. Breng de hiPSC-cultuur terug naar de 37 °C/5% CO2 -incubator.
    OPMERKING: Cryopreservatie hiPSC's bij ongeveer 80% confluentie.
  16. Voeg 1 uur voor aanvang 1x celsupplement (bijv. Revitacell) toe aan de hiPSC-cultuur.
  17. Maak hiPSC's los van kweekplaten met behulp van 0,5 mM EDTA zoals beschreven in stap 1.4, waarbij cellen worden verzameld in celkweekmedium (bijv. E8 of E8 Flex) met 1x celsupplement (bijv. Revitacell). Centrifugeer op 150 x g gedurende 3 min.
  18. Resuspendeer gepelleteerde hiPSC's in celvriesmedia (zie materiaaltabel). Gebruik 700 μL per 10 cm2 kweekgebied, wat overeenkomt met 1 cryovial cellen per putje van een plaat met 6 putjes.
  19. Breng cryovials over in een geschikt celvriesvat (voor details zie Materiaaltabel).
  20. Breng het vriesvat gedurende 24 uur over naar een vriezer van -80 °C. Na 24 uur kunnen cryovials worden overgebracht naar vloeibare stikstof (-196 °C) voor langdurige opslag.

2. vmAstro Differentiatie protocol

OPMERKING: Een schematische samenvatting van het vmAstros-differentiatieprotocol wordt weergegeven in Figuur 1A. Een gedetailleerde lijst van reagentia die nodig zijn voor het protocol en hun bereiding is opgenomen in tabel 1.

  1. Inductie van vmNPC's
    OPMERKING: Dit protocol is geoptimaliseerd om te beginnen met minimaal 1x putje van een plaat met 6 putjes (10 cm2) hiPSC's 70%-80% samenvloeiing, wat ongeveer 4-5 x 104 cellen/cm2 is (Figuur 1B)30. Het aantal en de dichtheid van de startcellen moeten voor elke hiPSC-lijn worden geoptimaliseerd, aangezien dit een aanzienlijke invloed heeft op de overleving en differentiatie-efficiëntie.
    1. Verwijder celkweekmedium van hiPSC's en was 3x in DMEM/F12 + glutamax. Vervang media door 2 ml vmNPC-inductiemedia (N2B27 + CHIR99021 + SB431542 + SHH (C24ii) + LDN193189. Zie tabel 1 voor meer informatie over de bereiding van media en reagentia).
    2. Voer om de dag met een halve mediawissel na 24 uur en een volledige mediawissel om 48 uur.
      LET OP: Na 3-4 dagen zal de vmNPC-cultuur gepasseerd moeten worden. Een standaard passaging-verhouding van 1:3 of 1:4 wordt aanbevolen - dit moet worden geoptimaliseerd voor elke gebruikte hiPSC-lijn.
    3. Voeg 1 uur voor het passeren 1x celsupplement (bijv. Revitacell) toe aan vmNPC's en bereid 1x basaalmembraanmatrix (bijv. Geltrex) gecoat weefselkweekplastic voor (sectie 2.2 Voorbereiden van basaalmembraanmatrix en coating rissuecultuurplastic).
    4. Verwijder de media van vmNPC's en was 2x met D-PBS. Voeg 1 ml voorverwarmde celloslatingsoplossing (bijv. Accutase) toe per 10 cm2 kweekoppervlak (1 ml per putje van een plaat met 6 putjes).
    5. Plaats gedurende 1 minuut bij 37 °C en onderzoek vervolgens de vmNPC's met een fasecontrastmicroscoop.
      OPMERKING: De vmNPC's beginnen naar boven af te ronden, hun processen worden ingetrokken en er verschijnen gaten in de cellaag. Dit kan 1-3 minuten duren, afhankelijk van de celdichtheid.
    6. Wanneer vmNPC's dit uiterlijk aannemen, voeg dan 100 μL celloskoppelingsoplossing (bijv. Accutase) toe aan de laag vmNPC's.
      OPMERKING: Als de vmNPC's klaar zijn om los te koppelen, verschijnt er een gat in de cellaag. Als dit niet gebeurt, vereisen de vmNPC's verdere incubatie met een oplossing voor celloslating.
    7. Als vmNPC's gemakkelijk kunnen losraken, verwijder dan voorzichtig de oplossing voor celonthechting en was vmNPC's 2x met N2B27-media. Voeg N2B27-media voorzichtig toe langs de zijkant van de put of het kweekvat en draai voorzichtig om te wassen, zorg ervoor dat vmNPC's niet losraken.
      OPMERKING: Deze stap moet snel worden voltooid om ervoor te zorgen dat vmNPC's zich niet opnieuw hechten aan het celoppervlak. Als vmNPC's tijdens de wasstappen beginnen los te komen, verzamelen ze dan via centrifugatie op 150 x g gedurende 3 minuten. vmNPC's worden niet standaard gecentrifugeerd tijdens het passeren, omdat dit hun overleving kan verminderen.
    8. Verwijder ten slotte vmNPC's met behulp van een pipet door vmNPC-inductiemedia met 1x celsupplement (bijv. Revitacell) krachtig rechtstreeks op de cellaag uit te werpen. Dit zou vmNPC's moeten verwijderen, die vervolgens rechtstreeks in de nieuwe matrix-gecoate gecoate kweekvaten kunnen worden overgebracht.
      OPMERKING: Gebruik geen media die al geresuspendeerde vmNPC's bevatten om verdere cellen te verwijderen, omdat dit zal resulteren in hun overtrituratie, wat hun overleving vermindert.
    9. Vervang in een 37 °C/5% CO2 -incubator. vmNPC's zouden zich na 20-30 minuten moeten beginnen te hechten aan het met matrix beklede oppervlak. Vervang de helft van het medium na 24 uur door verse vmNPC-inductiemedia (zonder celsupplement) en vervolg het voedingsschema zoals eerder.
    10. Ga door met het regime van voeden en passeren gedurende 10 dagen.
  2. Voorbereiden van basaalmembraanmatrix en coating weefselkweekplastic
    OPMERKING: Voor het onderhoud van vmNPC's wordt 1x basaalmembraanmatrix (bijv. Geltrex) gebruikt voor het coaten van plastic. Voor het onderhoud van vmAPC's of vmAstro's kan 0,25x basaalmembraanmatrix worden gebruikt.
    1. Haal de basaalmembraanmatrixbouillon uit een vriezer van -80 °C en plaats deze een nacht in een koelkast van 4 °C om te ontdooien.
    2. Verdun 1:10 met ijskoude DMEM/F12 + glutamax, aliquot en bewaar bij -80 °C als 10x bouillon.
    3. Bij het coaten van plasticware verdun deze 10x de voorraad tot 1x (voor vmNPC's) of 0,25x (voor vmAPC's of vmAstro's) met ijskoude DMEM/F12 + glutamax.
    4. Voeg onmiddellijk toe aan weefselkweekplastic van 1 ml per 10 cm2, bijvoorbeeld 1 ml per putje van een plaat met 6 putjes.
    5. Plaats gedurende 1 uur op 37 °C. De basaalmembraanmatrixoplossing mag pas van plasticgoed worden verwijderd als het klaar is om media/cellen toe te voegen om ervoor te zorgen dat het gecoate plasticgoed niet uitdroogt. Matrix gecoate platen hoeven niet te worden gewassen voordat cellen worden toegevoegd.
  3. Uitbreiding van vmNPC's
    1. Vervang op dag 10 van het protocol de inductiemedia door vmNPC-expansiemedia (N2B27 + GDNF + BDNF + ascorbinezuur. Zie tabel 1 voor meer informatie over de bereiding van media en reagentia).
      OPMERKING: De vmNPC's vereisen geen toevoeging van mitogenen om proliferatie te induceren. BDNF, GDNF en ascorbinezuur ondersteunen de overleving en het onderhoud van vmNPC's30.
    2. Voer om de dag met een halve mediawissel na 24 uur en een volledige mediawissel om 48 uur.
      LET OP: Na 3-4 dagen zal de vmNPC-cultuur gepasseerd moeten worden. Voor passaging wordt een standaard passagingverhouding van 1:3 of 1:4 aanbevolen (dit moet worden geoptimaliseerd voor elke gebruikte hiPSC-lijn. Bepaal de verhouding die de beste overleving, proliferatie en generatie van vmNPC's geeft).
    3. Voeg 1 uur voor het passeren 1x celsupplement (bijv. Revitacell) toe aan vmNPC's en bereid van tevoren 1x matrix gecoate platen/kolven voor (sectie 2.2 Voorbereiden van basaalmembraanmatrix en coating rissue cultuurplastic). Verwarm de celloslatingsoplossing (bijv. Accutase) voor tot 37 °C. Verwarm verse vmNPC-expansiemedia met 1x celsupplement (bijv. Revitacell) voor.
    4. Verwijder media van vmNPC's en was 2x met D-PBS. Voeg 1 ml celloslatingsoplossing (bijv. Accutase) toe per 10 cm2 kweekoppervlak (1 ml per putje van een plaat met 6 putjes). Plaats gedurende 1 minuut bij 37 °C en onderzoek vervolgens de vmNPC's met een fasecontrastmicroscoop.
      OPMERKING: De vmNPC's beginnen naar boven af te ronden, hun processen worden ingetrokken en er verschijnen gaten in de cellaag. Dit kan 1-3 minuten duren, afhankelijk van de celdichtheid.
    5. Wanneer vmNPC's een afgerond uiterlijk krijgen, voeg dan 100 μL celloskoppelingsoplossing (bijv. Accutase) toe aan de laag vmNPC's.
      OPMERKING: Als de vmNPC's klaar zijn om los te koppelen, verschijnt er een gat in de cellaag. Als dit niet gebeurt, vereisen de vmNPC's verdere incubatie met de celloslatingsoplossing.
    6. Als vmNPC's gemakkelijk kunnen loskomen, verwijder dan voorzichtig de celloslatingsoplossing en was vmNPC's 2x met N2B27-media. Voeg N2B27-media voorzichtig toe langs de zijkant van de put of het kweekvat en draai voorzichtig om te wassen, zorg ervoor dat vmNPC's niet losraken.
      OPMERKING: Als vmNPC's in grote aantallen beginnen los te laten in de wasstappen, verzamel dan via centrifugatie op 150 x g gedurende 3 minuten. vmNPC's worden niet standaard gecentrifugeerd tijdens het passeren, omdat dit hun overleving kan verminderen. Deze stap moet snel worden voltooid om ervoor te zorgen dat vmNPC's zich niet opnieuw hechten aan het celoppervlak.
    7. Verwijder vmNPC's met behulp van een pipet en werp vmNPC-expansiemedia met 1x celsupplement (bijv. Revitacell) krachtig rechtstreeks op de cellaag uit. Hierdoor moeten vmNPC's worden verwijderd, die vervolgens rechtstreeks in de voorbereide matrixgecoate platen/kolven kunnen worden overgebracht (zie punt 2.2 "Voorbereiding van de basaalmembraanmatrix en het coaten van weefselkweekplastic").
      OPMERKING: Gebruik geen media die al geresuspendeerde vmNPC's bevatten om verdere cellen te verwijderen, omdat dit zal resulteren in hun overtrituratie, wat hun overleving vermindert.
    8. Vervang in een 37 °C/5% CO2 -incubator. vmNPC's zouden zich na 20-30 minuten aan het met matrix gecoate oppervlak moeten beginnen te hechten. Vervang na 24 uur de helft van de kweekmedia door verse vmNPC-expansiemedia (zonder celsupplement) en ga verder met het vorige voedingsschema.
    9. Ga door met dit regime van voeden en passeren gedurende 10 dagen. vmNPC's kunnen worden uitgebreid tot dag 50.
  4. Differentiatie en uitbreiding van vmAPC's
    OPMERKING: vmNPC's kunnen met succes worden gebruikt voor het genereren van vmAPC's/vmAstro's ergens tussen de 30 en 50 dagen vanaf de eerste hiPSC-fase (Figuur 1A).
    1. Neem een confluente vmNPC-cultuur en was vmNPC's 3x in geavanceerde DMEM/F12 om sporen van de componenten van vmNPC-uitbreidingsmedia te verwijderen. Vervang de media door vmAPC-uitbreidingsmedia (ASTRO-media +EGF +LIF. Zie tabel 1 voor meer informatie over de bereiding van media en reagentia).
    2. Na 72 uur passage is de vmNPC-cultuur op een hoge verhouding (1:7,5). Als u er bijvoorbeeld van uitgaat dat vmNPC's in een enkel putje van een plaat met 6 putjes werden bewaard, moeten ze nu in een 1x matrix gecoate kolf van 75 cm2 worden geplaatst (gecoat zoals beschreven in paragraaf 2.2 'Voorbereiding van de basaalmembraanmatrix en coating van weefselkweekplastic'). Passage met behulp van celloslatingsoplossing, zoals beschreven voor vmNPC's in paragraaf 2.3 'Uitbreiding van vmNPC's'.
    3. Resuspendeer vmNPC's in een geschikt volume vmAPC-uitbreidingsmedia (7,5-15 ml media per 75 cm2 kolf. Voltooi de mediawissel elke 3 dagen, of als de cellen dat nodig hebben.
      OPMERKING: Vanaf dit punt worden vmNPC's vmAPC's genoemd en moeten ze worden doorgegeven als afzonderlijke cellen in plaats van celclusters. vmAPC's moeten elke 3-7 dagen worden gepasseerd of wanneer ze samenvloeien om te voorkomen dat ze overvloeien. Vanaf dit punt moet de gereduceerde concentratie van 0,25x matrix worden gebruikt om plasticgoed te coaten (zoals beschreven in paragraaf 2.2 Voorbereiding van de basaalmembraanmatrix en coating van weefselkweekplastic).
    4. Breid vmAPC's uit totdat ze dag 90 bereiken (vanaf het hiPSC-stadium), waarbij vmAPC's op verschillende punten in hun expansie worden gecryopreserveerd.
  5. Generatie van volwassen vmAstro's uit vmAPC's
    OPMERKING: In dit stadium kunnen vmAPC's worden gekweekt in weefselkweekkolven van 2 cm van 175 cm. Dit kan worden uitgebreid voor het genereren van grote aantallen volwassen vmAstro's.
    1. Wanneer vmAPC's 80% samenvloeiing bereiken, wast u 3x met ASTRO-media en vervangt u deze door vmAstros-rijpingsmedia (ASTRO-media +BMP4 +LIF. Zie tabel 1 voor meer informatie over de bereiding van media en reagentia).
    2. Voer elke 3 dagen een volledige mediawissel uit, of zoals de cellen nodig hebben, gedurende 10 dagen.
      OPMERKING: a) Op dit punt geeft karakterisering aan dat de vmAstro's volwassen zijn, zoals bevestigd door immunocytochemie (Figuur 2G - I) en door genexpressieanalyse (manuscript in voorbereiding). b) vmAstros die onmiddellijk na de rijping worden gebruikt, moeten opnieuw worden geplateerd op een nieuw geprepareerd oppervlak met matrixcoating. Het langer dan 14 dagen op hetzelfde kweekoppervlak houden van vmAPC's of vmAstro's kan leiden tot suboptimale culturen, waarbij cellen in omvang beginnen te krimpen en zelfs loskomen. c) Voor toepassingen die neuro-inflammatoire modulatie onderzoeken, worden BMP en LIF 72 uur voorafgaand aan neuro-inflammatoire stimulatie verwijderd. Dit is om elke mogelijke interactie tussen BMP/LIF-signalering en geïnduceerde neuro-inflammatoire signalering te voorkomen.
    3. vmAstros kunnen nu opnieuw worden geplateerd voor experimentele tests, bijvoorbeeld op dekglaasjes voor immunocytochemie of worden gecryopreserveerd voor toekomstige toepassingen (secties 3, 4).
      OPMERKING: Passeren zou in dit stadium van het protocol niet nodig moeten zijn, aangezien proliferatie slechts in een zeer laag tempo zou moeten plaatsvinden. vmAPC's die in dit stadium te dicht geplateerd zijn, behouden hogere niveaus van proliferatie. Als dit het geval is, passage en splits cellen om een dichtheid te bereiken zoals weergegeven in figuur 1F.

3. Cryopreservatie van vmNPC's, vmAPC's en vmAstro's

OPMERKING: Cryopreserve vmNPC's/vmAPC's/vmAstros op volle samenvloeiing.

  1. Voeg 1 uur voor aanvang 1x celsupplement (bijv. Revitacell) toe aan de kweek. Vul het cryoopslagvat (zie Materiaaltabel) bij kamertemperatuur met isopropanol.
  2. Maak de cellen los van de kweekplaten met behulp van een celloslatingsoplossing zoals eerder beschreven, en verzamel cellen in de juiste media (N2B27 of ASTRO-media) die 1x celsupplement bevatten (bijv. Revitacell). Centrifugeer op 150 x g gedurende 3 min.
  3. Resuspendeer de volumes van gepelleteerde vmNPC's/vmAPC's/vmAstro's in celbevriezingsmedia (zie materiaaltabel) als volgt (stappen 3.3.1. - 3.3.3.)
    1. Voor vmNPC's: gebruik 700 μL per 10 cm2 kweekruimte, in 1 cryovial.
    2. Voor vmAPC's: gebruik 700 μL per 60 cm2 kweekruimte, in 1 cryovial (ongeveer 1/3 van een T175 kweekfles).
    3. Voor vmAstros: suspendeer opnieuw in een media van 2 ml en tel het aantal vmAstros. Centrifugeer opnieuw en suspendeer in celvriesmedia (zie Materiaaltabel) met een aantal per cryovial dat geschikt is voor toekomstige toepassingen. Uitgaande van een geschat celverlies van 15% als gevolg van vries-dooi, worden pas ontdooide vmAstro's geteld en geplateerd met een overtollig celaantal van 15% om celdood in het vries-dooiproces te compenseren. Dit komt dus overeen met 74.750 vmAstros per cm2. Ontdooide vmAstro's worden 72 uur bewaard in ASTRO-media voordat ze worden getest.
  4. Breng de cryovials over in een celvriesvat (zie materiaaltabel voor meer informatie) en breng het vriesvat gedurende 24 uur over naar een vriezer van -80 °C. Na 24 uur kunnen cryovials worden overgebracht naar vloeibare stikstof (-196 °C) voor langdurige opslag.

4. Karakterisering van het vmAstro fenotype

  1. Immunocytochemie
    1. Plaats 100-200 13 mm glazen dekglaasjes in glazen petrischaaltjes op een laag filtreerpapier en steriliseer ze in een droge autoclaaf.
    2. Breng de dekglaasjes met een steriele tang over in putjes met platen met 4 of 24 gaatjes. Voeg 1x matrixoplossing (bijv. Geltrex) toe op de dekglaasjes in de vorm van druppels van 50 μl en incubeer gedurende 1 uur bij 37 °C.
    3. Passage of dooi vmAstros, opnieuw opschorten in ASTRO-media en een telling uitvoeren. Plaat vmAstros op 25-100.000 cellen per dekglaasje in een druppel van 50 μL.
    4. Verwijder de matrix van het dekglaasje en voeg direct vmAstros toe in een druppel media. Plaats gedurende 30 minuten op 37 °C en overspoel de putten vervolgens met nog eens 250 μL ASTRO-media.
      OPMERKING: Als immunocytochemie wordt uitgevoerd om eenvoudig te controleren op expressie van astrocyten en middenhersenmarkers, kan vmAstros 24 uur na het plateren worden gefixeerd.
    5. Bereid 4% formaldehyde-oplossing door 36% formaldehyde-oplossing 1:9 in D-PBS te verdunnen.
    6. Was vmAstros 1x met D-PBS. Voeg onmiddellijk 4% formaldehyde toe aan de putjes en laat 10 minuten op kamertemperatuur staan.
    7. Verwijder formaldehyde en vervang door D-PBS. Bewaren bij 4 °C of overgaan tot immunocytochemie.
    8. Was dekglaasjes 3x in putjes met D-PBS. Permeabiliseren en blokkeren in 10% geitenserum, 1% BSA in 0,1% PBTx (D-PBS + 1:1000 Triton-X) gedurende 1 uur bij kamertemperatuur.
    9. Voeg primaire antilichamen (Tabel van Materialen) toe in 1% geitenserum, 0,1% BSA in 0,1% PBTx (D-PBS + 1:1000 Triton-X) en incubeer een nacht bij 4 °C op een wipstoel.
    10. Verwijder de volgende dag primaire antilichamen en was de dekglaasjes 3x met D-PBS.
    11. Voeg geschikte secundaire antilichamen (Materiaaltabel) toe in 1% geitenserum, 0,1% BSA in 0,1% PBTx en incubeer gedurende 1-2 uur bij kamertemperatuur en bescherm het tegen licht op een wip. Was dekglaasjes 3x met D-PBS.
    12. Voeg DAPI-oplossing toe (0,1 μg/ml DAPI in D-PBS) en incubeer gedurende 10 minuten bij kamertemperatuur. Was dekglaasjes 3x met D-PBS.
    13. Om het dekglaasje te monteren, voegt u een druppel van 5 μL Mowiol/DABCO-montagemedia [12% Mowiol (w/v), 12% glycerol (w/v) opgelost 's nachts al roerend in 0,2 M Tris (pH 8,5) met 25 mg/ml 1,4-diazabicylo [2.2.2]octaan (DABCO)] toe aan een glazen microscoopglaasje. Verwijder met een tang voorzichtig het dekglaasje uit de put; Dep de rand van het dekglaasje op het doekje om de overtollige vloeistof te verwijderen en plaats de vmAstros-kant naar beneden op de Mowiol/DABCO-druppel.
    14. Herhaal dit voor elk dekglaasje en laat 8 uur drogen voordat u microscopisch onderzoek uitvoert.
  2. ELISA-meting van vmAstros-secretie van IL-6 als reactie op cytokinebehandeling
    OPMERKING: Na de rijping van 10 dagen met BMP4 en LIF, moeten vmAstros worden gepasseerd, geteld en geplateerd op 0.25x matrixgecoat weefselkweekplasticwaren (zoals beschreven in Afdeling 2.2Voorbereiden van basaalmembraanmatrix en coating weefselkweekplastic), bij een dichtheid van 65.000 vmAstros per cm2 in ASTRO-media. BMP4 en LIF moeten 72 uur voorafgaand aan de cytokinebehandeling uit de vmAstros worden verwijderd, omdat actieve signalering van deze factoren de werkzaamheid van de cytokinebehandeling kan verstoren. Als alternatief kunnen gecryopreserveerde vmAstros worden ontdooid en gebruikt voor testen.
    1. Was vmAstros op de dag van de test voorzichtig 3x in niet-redoxmedia (DMEM/F-12 + glutamax + N2).
    2. Gebruik ter vergelijking een onbehandelde controle- en cytokine-behandelde put. Voeg het gekozen cytokine toe in een geoptimaliseerde concentratie. De gegevens in Figuur 2J - L werden gegenereerd met behulp van IL-1α bij 3 ng/ml9 in niet-redoxmedia bij 1 ml per 10 cm2 celkweekgebied.
    3. Vervang vmAstros in de incubator 37 °C/5% CO2 gedurende 24 uur. Verzamel na 24 uur kweekmedia in steriele microfugebuisjes.
    4. Als de ELISA niet onmiddellijk wordt uitgevoerd, vries dan de mediamonsters snel in door de microfugebuisjes onder te dompelen in vloeibare stikstof en bewaar ze bij -80 °C voor toekomstige analyse.
      OPMERKING: Het volgende protocol is speciaal geoptimaliseerd voor gebruik met de IL-6 ELISA-kit die wordt beschreven in de materiaaltabel. Antilichamen en standaarden die als gevriesdroogd poeder in een nieuwe ELISA-kit worden geleverd, moeten vóór het eerste gebruik worden gereconstitueerd en worden verdeeld voor toekomstig gebruik. Het gegevensblad dat bij de kit wordt geleverd, geeft een overzicht van de reagentia en volumes die nodig zijn voor reconstitutie. Het afvangantilichaam moet worden gereconstitueerd in PBS (zonder dragereiwit).
    5. Voer de ELISA uit in een 96-wells plaatformaat en bereken de volumes van de reagentia op basis van de gebruikte putjes. Bereid op de dag van ELISA het vangantilichaam voor door de voorraad 1:120 in PBS te verdunnen. Smeer de plaat in door 50 μL afvangantilichaam per putje te laden. Dek de plaat af met een plakstrip en incubeer een nacht bij kamertemperatuur.
    6. Was de plaat de volgende dag 3x met D-PBS-Tween (D-PBS met 0,05% Tween-20), 100 μL per putje. Dep droog.
    7. Blokkeer de plaat door 150 μL D-PBS/1% BSA per putje te laden. Incubeer minimaal 1 uur bij kamertemperatuur. Wasbord zoals beschreven.
    8. Ontdooi monsters op ijs (dit kan 1-2 uur duren). Verdun monsters 1:5 door 10 μL monster en 40 μL D-PBS/1% BSA te laden. Vortex elk monster voorafgaand aan het laden.
      OPMERKING: Het is noodzakelijk om monsters te verdunnen bij het uitvoeren van een IL-6 ELISA, verdunningen moeten worden geoptimaliseerd.
    9. Bereid de hoogste standaard (1.000 ρg/ml) voor door het aandeel 1:180 te verdunnen in D-PBS/1% BSA. Bereid 7 standaarden voor door een seriële verdunning van de topstandaard uit te voeren. Vortex tussen elke verdunning.
    10. Voeg 50 μL standaarden/monsters toe aan putjes. Gebruik D-PBS/1% BSA als de blanco. Incubeer gedurende 2 uur bij kamertemperatuur op een orbitale schudder om de verdunde monsters goed te mengen. Wasbord zoals beschreven.
    11. Bereid detectie-antilichaam voor door de voorraad 1:60 te verdunnen in D-PBS/1% BSA. Laad 50 μL detectie-antilichaam per putje. Dek de plaat af en broed 2 uur bij RT. Wasbord zoals beschreven.
    12. Bereid streptavidin geconjugeerd aan mierikswortelperoxidase (Streptokokken-HRP) door de voorraad 1:40 te verdunnen in D-PBS/1% BSA. Laad 50 μL Strep-HRP per putje en incubeer 20 minuten bij kamertemperatuur in het donker. Wasbord zoals beschreven.
    13. Start de kleurreactie door 50 μL TMB-substraatoplossing per putje te laden. Incubeer 20 minuten bij kamertemperatuur in het donker (of totdat de standaarden en monsters een blauwe kleur hebben ontwikkeld).
      OPMERKING: TMB wordt bewaard bij 4 °C, maar moet bij kamertemperatuur worden gebruikt.
    14. Stop de reactie door 25 μL stopoplossing (1 M H2SO4) per putje toe te voegen en noteer de kleurverandering van blauw naar geel.
    15. Lees de plaat af met een absorptie van 450 nm met behulp van een microplaatlezer. Stel de golflengtecorrectie in op een absorptievermogen van 540 nm om de nauwkeurigheid te maximaliseren. Bereken de eiwitconcentraties in de monsters uit de geproduceerde standaardcurve.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Resultaten

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Differentiatiemethodologie en progressie
Hier presenteren we de details van zowel de methoden die worden gebruikt voor het genereren van vmAstro's als de protocollen die worden gebruikt voor hun daaropvolgende fenotypische karakterisering. De methode voor het genereren van vmAstros bestaat uit verschillende verschillende differentiatiestadia, die kunnen worden gevolgd door microscopie en het identificeren van verschillende morfologische kenmerken (

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Discussie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Deze methode voor het genereren van vmAstro's uit hiPSC's is zeer efficiënt, genereert zuivere culturen van vmAstro's en is reproduceerbaar voor het genereren van vmAstro's uit verschillende hiPSC-lijnen. Dit protocol is ontwikkeld rond de recapitulatie van de ontwikkelingsgebeurtenissen die in het embryo nodig zijn om de zich ontwikkelende middenhersenen correct te vormen en astrocyten te genereren en omvat drie gedefinieerde fasen: 1) neurale ventrale middenherseninductie om vmNPC's te...

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Openbaarmakingen

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

De auteurs hebben niets te onthullen.

Dankbetuigingen

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Dit werk werd gefinancierd door een Parkinson's UK-projectbeurs (G-1402) en studententijd. De auteurs zijn dankbaar voor de Wolfson Bioimaging Facility voor hun steun en hulp bij dit werk.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel
NaamBedrijfCatalogusnummerOpmerkingen
Reagenten
0.2M Tris-Cl (pH 8.5)n/an/aSamengesteld uit Tris-base en plus HCl
0.5M EDTA, PH 8ThermoFisher 15575-0201:1000 in D-PBS tot 0,5 mM eindconcentratie 
1,4-diazabicylo[2.2.2]octane (DABCO)SigmaD27802- 25 mg/mL in Mowiol montageoplossing
13 mm dekvlakkenVWR631-0149
2-Mercaptoethanol (50 mM)ThermoFisher31350010
AccutaseThermoFisher13151014
Advanced DMEM/F12ThermoFisher12634010Bevat 1x NEAA maar we voegen toe tot de eindconcentratie van 2x (0,2 mM)
Ascorbic acidSigmaA5960200 mM stock, 1:1000 tot 200 µM eindconcentratie
B27 SupplementThermoFisher17504-04450x stock
BSASigma5470
Cell freezing mediaSigmaC2874Cryostor CS10
Cell freezing vesselNalgene5100-0001
CHIR99021Axon Medchem13860,8 mM stock, 1:1000 verdunning tot 0,8 µM eindconcentratie
Cryovials SigmaCLS430487
DAPI SigmaD95421 mg/mL, 1:10.000 tot 100ng/mL eindconcentratie (in PBS)
DMEM/F12 + GlutamaxThermoFisher10565018
Dulbeccos-PBS (D-PBS zonder Mg of Ca)ThermoFisher14190144pH 7,2
E8 Flex medium kitThermoFisherA2858501
Formaldehyde (36% oplossing)Sigma47608
GeltrexThermoFisherA14133021:100 of 1:400 in ijskoud DMEM/F12
GlutamaxThermoFisher350500382 mM stock (1:200 in N2B27, 1:100 in ASTRO media tot 20 µM eindconcentratie) 
GlycerolSigmaG5516
Human BDNF Peprotech450-0220 µg/mL stock, 1:1000 tot 20 ng/mL eindconcentratie
Human BMP4Peprotech120-0520 µg/mL stock, 1:1000 tot 20 ng/mL eindconcentratie
Human EGFPeprotechAF-100-1520 µg/mL stock, 1:1000 tot 20 ng/mL eindconcentratie
Human GDNFPeprotech450-1020 µg/mL stock, 1:1000 tot 20 ng/mL eindconcentratie
Human insulin solutionSigma I927810 mg/mL stock, 1:2000 tot 5 µg/mL eindconcentratie
Human LIFPeprotech300-0520 µg/mL stock, 1:1000 tot 20 ng/mL eindconcentratie
IL-6 ELISA kitBiotechneDY206
IsopropanolSigma I9516-4LVoor het vullen van Mr Frosty cryostorage vessel
LDN193189SigmaSML0559100 µM stock, 1:10.000 verdunning tot 10 nM eindconcentratie
Mowiol 40-88Sigma324590
N2 SupplementThermoFisher17502048100x stock
NEAAThermoFisher1114003510 mM stock, 1:100 tot 0,1 mM eindconcentratie 
Neurobasal mediaThermoFisher21103049
Normal Goat serumVector LabsS-1000-20
RevitacellThermoFisherA2644501100x stock, 1:100 tot 1x eindconcentratie
SB431542Tocris161410 mM stock, 1:1000 verdunning tot 10 µM eindconcentratie
SHH-C24iiBiotechne1845-SH-025200 µg/mL stock, 1:1000 tot 200 ng/mL eindconcentratie
Tris-HClSigma PHG0002 
Triton-XSigmaX100
Tween-20Sigma P7949
VitronectinThermoFisherA147001:50 in D-PBS
Antilichamen voor immunocytochemie BedrijfCatalogusnummerGastheersoort
Antilichaam tegen S100bSigmaSAB4200671Muis; 1:200
Antilichaam tegen FOXA2SCBTNB600501Muis; 1:50
Antilichaam tegen LMX1AProSci7087Konijn; 1:300
Antilichaam tegen LMX1AMilliporeAB10533Konijn; 1:2000
Antilichaam tegen LMX1BProteintech18278-1-APKonijn; 1:300
Antilichaam tegen GLASTProteintech20785-1

Referenties

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Poewe, W., et al. Parkinson disease. Nature Reviews Disease Primers. 3, 17013(2017).
  2. Lees, A. J., Hardy, J., Revesz, T. Parkingson's disease. Lancet. 373, 2055-2066 (2009).
  3. Braak, H., et al. Staging of brain pathology related to sporadic Parkinson's disease. Neurobiology of Aging. 24, 197-211 (2003).
  4. Booth, H. D. E., Hirst, W. D., Wade-Martins, R. The role of astrocyte dysfunction in Parkinson's disease pathogenesis. Trends in Neurosciences. 40, 358-370 (2017).
  5. Lindstrom, V., et al. Extensive uptake of alpha-synuclein oligomers in astrocytes results in sustained intracellular deposits and mitochondrial damage. Molecular and Cellular Neuroscience. 82, 143-156 (2017).
  6. Crompton, L. A., Cordero-Llana, O., Caldwell, M. A. Astrocytes in a dish: Using pluripotent stem cells to model neurodegenerative and neurodevelopmental disorders. Brain Pathology. 27, 530-544 (2017).
  7. di Domenico, A., et al. Patient-specific iPSC-derived astrocytes contribute to non-cell-autonomous neurodegeneration in Parkinson's disease. Stem Cell Reports. 12, 213-229 (2019).
  8. Zhang, Y., Barres, B. A. Astrocyte heterogeneity: an underappreciated topic in neurobiology. Current Opinions in Neurobiology. 20, 588-594 (2010).
  9. Liddelow, S. A., et al. Neurotoxic reactive astrocytes are induced by activated microglia. Nature. 541, 481-487 (2017).
  10. Liddelow, S. A., Barres, B. A. Reactive astrocytes: production, function, and therapeutic Potential. Immunity. 46, 957-967 (2017).
  11. Yun, S. P., et al. Block of A1 astrocyte conversion by microglia is neuroprotective in models of Parkinson's disease. Nature Medicine. 24, 931-938 (2018).
  12. Stokholm, M. G., et al. Assessment of neuroinflammation in patients with idiopathic rapid-eye-movement sleep behaviour disorder: a case-control study. The Lancet Neurology. 16, 789-796 (2017).
  13. Williams-Gray, C. H., et al. Serum immune markers and disease progression in an incident Parkinson's disease cohort (ICICLE-PD). Movement Disorders. 31, 995-1003 (2016).
  14. Gelders, G., Baekelandt, V., Vander Perren, A. Linking neuroinflammation and neurodegeneration in Parkinson's disease. Journal of Immunology Research. 2018, 4784268(2018).
  15. Hall, S., et al. Cerebrospinal fluid concentrations of inflammatory markers in Parkinson's disease and atypical parkinsonian disorders. Scientific Reports. 8, 13276(2018).
  16. Zamanian, J. L., et al. Genomic analysis of reactive astrogliosis. Journal of Neuroscience. 32, 6391-6410 (2012).
  17. Clarke, B. E., et al. Human stem cell-derived astrocytes exhibit region-specific heterogeneity in their secretory profiles. Brain. 143 (10), 85(2020).
  18. Sevenich, L. Brain-resident microglia and blood-borne macrophages orchestrate central nervous system inflammation in neurodegenerative disorders and brain cancer. Frontiers in Immunology. 9, 697(2018).
  19. Friedman, B. A., et al. Diverse brain myeloid expression profiles reveal distinct microglial activation states and aspects of Alzheimer's disease not evident in mouse models. Cell Reports. 22, 832-847 (2018).
  20. Viti, J., Feathers, A., Phillips, J., Lillien, L. Epidermal growth factor receptors control competence to interpret leukemia inhibitory factor as an astrocyte inducer in developing cortex. Journal of Neuroscience. 23, 3385-3393 (2003).
  21. Nakashima, K., Yanagisawa, M., Arakawa, H., Taga, T. Astrocyte differentiation mediated by LIF in cooperation with BMP2. FEBS Letters. 457, 43-46 (1999).
  22. Serio, A., et al. Astrocyte pathology and the absence of non-cell autonomy in an induced pluripotent stem cell model of TDP-43 proteinopathy. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 110, 4697-4702 (2013).
  23. Gupta, K., et al. Human embryonic stem cell derived astrocytes mediate non-cell-autonomous neuroprotection through endogenous and drug-induced mechanisms. Cell Death and Differentiation. 19, 779-787 (2012).
  24. Krencik, R., Ullian, E. M. A cellular star atlas: using astrocytes from human pluripotent stem cells for disease studies. Frontiers in Cellular Neuroscience. 7, 25(2013).
  25. Krencik, R., Weick, J. P., Liu, Y., Zhang, Z. -J., Zhang, S. -C. Specification of transplantable astroglial subtypes from human pluripotent stem cells. Nature Biotechnology. 29, 528-534 (2011).
  26. Xin, W., et al. Ventral midbrain astrocytes display unique physiological features and sensitivity to dopamine D2 receptor signaling. Neuropsychopharmacology. 44, 344-355 (2019).
  27. Devine, M. J., et al. Parkinson's disease induced pluripotent stem cells with triplication of the alpha-synuclein locus. Nature Communications. 2, 440(2011).
  28. Chen, Y., et al. Engineering synucleinopathy-resistant human dopaminergic neurons by CRISPR-mediated deletion of the SNCA gene. European Journal of Neuroscience. 49, 510-524 (2019).
  29. Crompton, L. A., et al. non-adherent differentiation of human pluripotent stem cells to generate basal forebrain cholinergic neurons via hedgehog signaling. Stem Cell Research. 11, 1206-1221 (2013).
  30. Stathakos, P., et al. A monolayer hiPSC culture system for autophagy/mitophagy studies in human dopaminergic neurons. Autophagy. , 1-17 (2020).
  31. Stathakos, P., et al. Imaging autophagy in hiPSC-derived midbrain dopaminergic neuronal cultures for Parkinson's disease research. Methods in Molecular Biology. 1880, 257-280 (2019).
  32. Bilican, B., et al. Mutant induced pluripotent stem cell lines recapitulate aspects of TDP-43 proteinopathies and reveal cell-specific vulnerability. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 109, 5803-5808 (2012).
  33. Cordero-Llana, O., et al. Clusterin secreted by astrocytes enhances neuronal differentiation from human neural precursor cells. Cell Death and Differentiation. 18, 907-913 (2011).
  34. Morrow, T., Song, M. R., Ghosh, A. Sequential specification of neurons and glia by developmentally regulated extracellular factors. Development. 128, 3585-3594 (2001).
  35. Namihira, M., et al. Committed neuronal precursors confer astrocytic potential on residual neural precursor cells. Developmental Cell. 16, 245-255 (2009).
  36. Ochiai, W., Yanagisawa, M., Takizawa, T., Nakashima, K., Taga, T. Astrocyte differentiation of fetal neuroepithelial cells involving cardiotrophin-1-induced activation of STAT3. Cytokine. 14, 264-271 (2001).
  37. Nakashima, K., Yanagisawa, M., Arakawa, H. Synergistic signaling in fetal brain by STAT3-Smad1 complex bridged by p300. Science. 284 (5413), 479-482 (1999).
  38. Nakashima, K., et al. Developmental requirement of gp130 signaling in neuronal survival and astrocyte differentiation. Journal of Neuroscience. 19, 5429-5434 (1999).
  39. Barbar, L., et al. CD49f is a novel marker of functional and reactive human iPSC-derived astrocytes. Neuron. 107, 436-453 (2020).
  40. Barbar, L., Rusielewicz, T., Zimmer, M., Kalpana, K., Fossati, V. Isolation of human CD49f(+) astrocytes and in vitro iPSC-based neurotoxicity assays. STAR Protocols. 1, 100-172 (2020).
  41. Gao, H. M., et al. Neuroinflammation and alpha-synuclein dysfunction potentiate each other, driving chronic progression of neurodegeneration in a mouse model of Parkinson's disease. Environmental Health Perspectives. 119, 807-814 (2011).
  42. Gao, H. M., et al. Neuroinflammation and oxidation/nitration of alpha-synuclein linked to dopaminergic neurodegeneration. Journal of Neuroscience. 28, 7687-7698 (2008).
  43. Horvath, I., et al. Co-aggregation of pro-inflammatory S100A9 with alpha-synuclein in Parkinson's disease: ex vivo and in vitro studies. Journal of Neuroinflammation. 15, 172(2018).

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Herprints en machtigingen

Toestemming aanvragen om de tekst of afbeeldingen van dit JoVE-artikel te hergebruiken

Toestemming aanvragen

Trefwoorden

Ventral Midbrain AstrocytesHuman Astrocyte GenerationInduced Pluripotent Stem CellsParkinson s Disease ModelsAstrocyte NeuroinflammationAstrocyte NeurotoxicityAstrocyte Drug ScreeningAstrocyte ImmunomodulationAstrocyte Marker ExpressionHigh Throughput Protocol
Video binnenkort beschikbaar

Gerelateerde artikelen