Methodenartikel

Visualiseren van long cellulaire aanpassingen tijdens gecombineerde ozon en LPS geïnduceerde murine acute longletsel

DOI:

10.3791/62097

⸱

21 maart 2021

 ,  , 
1Small Animal Clinical Sciences, Western College of Veterinary Medicine, University of Saskatchewan

In dit artikel

Samenvatting

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Gecombineerde ozon- en bacteriële endotoxine blootgestelde muizen vertonen wijdverspreide celdood, waaronder die van neutrofielen. We zagen cellulaire aanpassingen zoals verstoring van cytoskelet lamellipodie, verhoogde cellulaire expressie van complexe V ATP synthase subeenheid β en angiostatine in broncho-alveolaire lavage, onderdrukking van de immuunrespons van de longen en vertraagde neutrofiele rekrutering.

Samenvatting

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Longen worden voortdurend geconfronteerd met directe en indirecte beledigingen in de vorm van steriele (deeltjes of reactieve toxines) en infectieuze (bacteriële, virale of schimmel) ontstekingsaandoeningen. Een overweldigende gastheerreactie kan leiden tot gecompromitteerde ademhaling en acuut longletsel, dat wordt gekenmerkt door long neutrofiele rekrutering als gevolg van de patho-logische gastheer immuun,coagulatieve en weefsel remodellering respons. Gevoelige microscopische methoden om muriene long cellulaire aanpassingen te visualiseren en te kwantificeren, als reactie op lage dosis (0,05 ppm) ozon, een krachtige milieuverontreinigende stof in combinatie met bacteriële lipopolysaccharide, een TLR4-agonist, zijn cruciaal om de ontstekings- en reparatiemechanismen van de gastheer te begrijpen. We beschrijven een uitgebreide fluorescerende microscopische analyse van verschillende long- en systemische lichaamscompartimenten, namelijk de broncho-alveolaire lavagevloeistof, long vasculair perfusaat, linkerlong cryosecties en sternaal beenmergperfusaat. We tonen schade van alveolaire macrofagen, neutrofielen, longparenchymweefsel, evenals beenmergcellen in correlatie met een vertraagde (tot 36-72 uur) immuunrespons die wordt gekenmerkt door discrete chemokinegradiënten in de geanalyseerde compartimenten. Daarnaast presenteren we long extracellulaire matrix en cellulaire cytoskelet interacties (actine, tubuline), mitochondriale en reactieve zuurstofsoorten, anti-coagulatie plasminogen, zijn anti-angiogene peptide fragment angiostatine, de mitochondriale ATP synthase complex V subunits, α en β. Deze surrogaatmarkers, aangevuld met adequate in vitro celgebaseerde assays en in vivo dierbeeldvormingstechnieken zoals intravitale microscopie, kunnen essentiële informatie verschaffen om de longrespons op nieuwe immunomodulerende middelen te begrijpen.

Inleiding

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Acuut longletsel (ALI) is een cruciale pathologische reactie van de longen op infectieuze of andere schadelijke stimuli die wordt gekenmerkt door gelijktijdige activering van coagulatieve, fibrinolytische en aangeborenimmuunsysteemen 1. Neutrofielen voelen onmiddellijk microbiële en intracellulaire schadepatronen door de Toll-achtige receptor (TLR) familie2,3,4. Neutrofielen geven voorgevormde cytokinen en cytotoxische korrelinhoud vrij, die vervolgens bijkomende weefselschade kunnen veroorzaken. De daaropvolgende alveolaire schade wordt ontsierd met secundaire celdood die leidt tot het vrijkomen van moleculen zoals adenosinetrifosfaat (ATP)5, waardoor een vicieuze cirkel van immuundysregulatie ontstaat.

Een onopgelost probleem in het begrip van ALI heeft betrekking op de vraag hoe de verwonding wordt geïnitieerd binnen het alveolaire membraan. Het elektronentransportcomplex V, F1F0 ATP synthase, is een mitochondriaal eiwit waarvan bekend is dat het alomtegenwoordig wordt uitgedrukt op het plasmamembraan van cellen (inclusief endotheel, leukocyten, epitheel) tijdens ontsteking. Het celcytoskelet dat bestaat uit actine en tubuline, herbergt veel celvorm en functiemodulerende en mitochondriale eiwitten, respectievelijk. We hebben onlangs aangetoond dat blokkade van de ATP-synthase door een endogene molecule, angiostatine, neutrofiele rekrutering, activering en lipopolysaccharide (LPS) veroorzaakte longontstekingdempt 6. Zo kunnen zowel biochemische (ATP synthase) als immuun (TLR4) mechanismen de alveolaire barrière reguleren tijdens longontsteking.

Blootstelling aan ozon (O3), een milieuverontreinigende stof, tast de longfunctie aan, verhoogt de gevoeligheid voor longinfecties en korte lage niveaus van O 3-blootstellingen verhogen het risico opsterfte bij mensen met onderliggende cardiorespiratoire aandoeningen7,8,9,10,11,12,13,14. Blootstelling aan fysiologisch relevante concentraties van O3 biedt dus een zinvol model van ALI om fundamentele ontstekingsmechanismen te bestuderen7,8. Ons lab heeft onlangs een murien model van lage dosis O3 geïnduceerde ALI15. Na het uitvoeren van een dosis en tijdrespons op lage O3-concentraties, merkten we op dat blootstelling aan 0,05 ppm O3 gedurende 2 uur acute longschade veroorzaakt die wordt gekenmerkt door long-ATP-synthasecomplex V-subeenheid β (ATPβ) en angiostatineexpressie, vergelijkbaar met het LPS-model. Intravitale longbeeldvorming onthulde desorganisatie van alveolaire actinemicrofilamenten die wijzen op longschade, en ablatie van alveolaire septale reactieve zuurstofsoorten (ROS) niveaus (wat wijst op abrogatie van baseline celsignalering) en mitochondriaal membraanpotentieel (wat wijst op acute celdood) na 2 uur blootstelling aan 0,05ppm O315 die correleerde met een heterogene long18FDG-retentie 16 , neutrofiele werving. De boodschap van onze recente studies is dat O3 exponentieel hoge toxiciteit produceert bij blootstelling aan concentraties onder de toegestane limieten van 0,063 ppm gedurende 8 uur (per dag) voor blootstelling bij de mens. Belangrijk is dat er geen duidelijk begrip bestaat over de vraag of deze subklinische O3-blootstellingen TLR4-gemedieerde mechanismen kunnen moduleren, zoals door bacterieel endotoxine17. Zo bestudeerden we een dual-hit O3- en LPS-blootstellingsmodel en observeerden we de immuun- en niet-immuun cellulaire aanpassingen.

We beschrijven een uitgebreide fluorescerende microscopische analyse van verschillende long- en systemische lichaamscompartimenten, namelijk de broncho-alveolaire lavagevloeistof (d.w.z. BAL) die de alveolaire ruimten, het long vasculaire perfusaat (d.w.z. LVP) bemonstert dat de long vasculatuur en het alveolaire septale interstitium bemonstert in het geval van een aangetaste endotheelbarrière, linker long cryosecties, om te kijken naar ingezeten parenchymale , perifeer bloed dat de circulerende leukocyten en het sternale en dijbeenmerg perfuseert dat de proximale en distale plaatsen van hematopoëtische celmobilisatie tijdens ontsteking bemonstert.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Het onderzoeksontwerp werd goedgekeurd door de Animal Research Ethics Board van de Universiteit van Saskatchewan en voldeed aan de richtlijnen van de Canadian Council on Animal Care voor humaan diergebruik. Zes-acht weken oude mannelijke C57BL/6J muizen werden aangeschaft. OPMERKING: Euthanaseer dieren die vóór het geplande eindpunt ernstige lethargie, ademhalingsproblemen of andere tekenen van ernstige nood ontwikkelen.

OPMERKING: Bereid het volgende voor: 27-18 G naald-stomp (hangt af van de diameter van de muis luchtpijp), de juiste grootte PE-buizen voor de stompe naald (maak een PE canule voor elke muis), canule, 2 scherpe scharen, 2 stompe tangen (klein), 1 scherpe tang (klein), 3 1 ml spuiten, gelabelde microfuge buizen (voor BAL, bloed, vasculaire en beenmerg perfusate collectie) en gelabelde Alle chemicaliën die voor de experimenten worden gebruikt, zijn aangegeven in de tabel met materialen.

1. Ozon- en LPS-blootstellingen voor inductie van murien longletsel

  1. Blootstelling aan ozon
    1. Bereid een aangepaste O3 inductiebox voor. Voeg muizenvoer, waterfles, verrijkingsspeelgoed en schoon beddengoed toe om de woonomgeving van de muizen na te bootsen.
      OPMERKING: Deze stappen zorgen ervoor dat de muizen vrije toegang hebben tot voedsel en water wanneer ze in de aangepaste inductiebox worden ondergebracht en helpen onnodige stress te verlichten.
    2. Schakel de O 3-kalibrator/generator "ON" (in de richting van de inlaatpoort) om de UV-lamp voor de hand te stabiliseren (ongeveer 15 minuten voor blootstelling) en sluit aan op de in-line O3-monitor.
      OPMERKING: De O3-monitor moet gemiddeld 0,05 ppm aflezen, zoals bemonsterd uit de uitlaat bij constante kamertemperatuur (72 ±3 °F) en relatieve vochtigheid (50±15%).
    3. Plaats voor O3-belichtingen voorzichtig muizen in de aangepaste inductiebox en stel de muizen continu bloot aan 0,05 ppm O3 gedurende 2 uur.
  2. Anesthesie en intranasale LPS-toediening
    1. Bereid 10 mg/ml voorraden voor ketamine en xylazine afzonderlijk.
    2. Bereid een cocktail door 20 delen ketamine en 1 deel xylazine te mengen. Als de muis X g weegt, injecteert u (X/200) ml ketamine/xylazinecocktail in de buikholte. Bereid voor één muis 1 ml cocktail bestaande uit 1000 μL van de ketaminevoorraad van 10 mg/ml en 50 μL van de xylazinevoorraad. Meng goed door op en neer te pipetten in een microfuge buis.
      OPMERKING: De ketamine- en xylazinevoorraden kunnen een week van tevoren worden bereid.
    3. Verdoof de muizen onder lichte intraperitoneale (IP) ketamine (50 mg/kg)/xylazine (1 mg/kg) mix (bijv. voor een muis van 25 g, injecteer 0,125 ml van de cocktail).
    4. Bereid een 1 mg/ml oplossing lps, in zoutoplossing, en vul 50 μL van de oplossing in een pipet.
    5. Houd de muis rechtop met zijn rug/rugzijde op de handpalm en houd de oren met dezelfde hand vast. Plaats nu 50 μL van de LPS-oplossing18 voorzichtig buiten de neusgaten (d.w.z. 25 μL op elk neusgat of 50 μL in één neusgat; maakt niet uit zolang de procedure snel is) en laat de muizen de LPS-oplossing inademen.
    6. Instill controlemuizen met 50 μL steriele zoutoplossing.
      Let op: Niet meer dan 100 μL overschrijden voor instillatie, wat fataal kan zijn. Te weinig volume (d.w.z. <50 μL) en er bestaat een risico op alleen nasale depositie.
    7. Leg na de toediening van LPS de muizen voorzichtig neer, hetzij op hun buik, hetzij op hun rug op de hoop beddengoed met hun hoofd iets naar beneden gericht.
      OPMERKING: Deze oriëntatie verlengt het vasthouden van de oplossing in de neusholte19.
    8. Verdoof de muizen na de blootstelling met een volledige dosis ketamine (200 mg/kg)/xylazine (4 mg/kg) (d.w.z. X/50 ml van de cocktail, waarbij X het muisgewicht in gram of 0,50 ml is voor een muis van 25 g).
    9. Observeer de muis totdat deze het bewustzijn en de juiste reflex verliest (d.w.z. niet terugdraait wanneer hij in liggende positie wordt gelegd). Controleer nu de muis op diepte van anesthesie, door de ademhaling (ritmische borstexcursies) en hartslag te controleren, die merkbaar zouden moeten vallen, na 1-2 minuten.
    10. Controleer vervolgens op pedaalreflexen, d.w.z. knijp in een van de cijfers van de achterpoten en observeer of het ledemaat is ingetrokken, als een reflex. Als de muis reageert, vul dan indien nodig bij met extra injecties van 0,1 ml of meer.
      OPMERKING: Om diepe anesthesie te bereiken, moet u er rekening mee houden dat bepaalde stammen of zwaarlijvige muizen meestal een groter distributievolume hebben en dus gemakkelijk kunnen worden overgedoseerd, als voldoende tijd niet is toegestaan voor volledige anesthesie (wat ongeveer 10 minuten of meer kan zijn). Dienovereenkomstig kunnen sommige stammen bestand zijn tegen anesthesie en dus meer aanvullingen vereisen. Deze kennis wordt opgedaan na vele praktische observaties en ervaring met muizen van verschillende stammen en leeftijd. Aangezien er ook een paar proefexperimenten werden uitgevoerd direct na blootstellingen met O3 en LPS (d.w.z. op het tijdstip van 2 uur), hebben we ook enkele zeer vroege BAL-celanalyses uit die experimenten opgenomen om de onmiddellijke effecten van de gecombineerde blootstelling aan O3en LPS te benadrukken.

2. Monsterverzameling

  1. Plaats de muis op een operatielade. Smeer nu voorzichtig de oogzalf op beide ogen om vochtverlies te voorkomen en reinig de muis met 70% ethanolspray.
    1. Maak kleine sneetjes door de bovenste en onderste huidmembranen met een schaar, om de luchtpijp en thorax bloot te leggen.
    2. Maak een snee net onder het borstbeen en stel het hart bloot.
  2. Hartpunctie
    1. Plaats een 25G-naald bevestigd aan een geïpariniseerde spuit in de rechterventrikel en neem bloed af door een hartpunctie.
      OPMERKING: Bloed trekt meestal met minimale zuigertrek, als de tijd van het blootstellen van het hart aan een hartpunctie minder dan een minuut is. Na het verzamelen van ongeveer 0,4-0,5 ml, moet men mogelijk een paar seconden pauzeren voordat het resterende bloed wordt verzameld. Dit wordt gedaan om het hart het resterende volume in de rechter ventriculaire kamer te laten pompen. Tegen het einde van de bloedafname stopt het hart om te pompen.
    2. Verzamel het bloed en bewaar het in microfuge buizen voor verdere verwerking.
  3. Tracheostomie
    1. Gebruik voorzichtig een pincet/stompe tang om het luchtpijpgebied vrij te maken van overtolkelijk weefsel. Gebruik gehandschoende handen meer dan de chirurgische instrumenten om bloedingen te voorkomen. Als er veel bloed sijpelt, bestaat het risico dat de BAL-monsters besmet raken. Gebruik indien nodig wattenstaafjes, hoewel dit niet de voorkeur heeft. Kimwipes zijn betere alternatieven.
    2. Snij door de ribbenkast om de longen bloot te leggen. Nogmaals, wees voorzichtig om het borstbeen en de intercostale slagaders of de oplopende aorta niet te snijden; kleinere sneden maken terwijl u door de ribbenkast gaat)
    3. Geef een katoenen ligatuur door onder de luchtpijpsnip en laat deze voorlopig als zodanig staan.
    4. Knip de luchtpijp op een geschikte plaats in het distale 1/3rd gedeelte, wijzend naar de longen, om toegang te krijgen tot een 28 G luchtpijp canule.
    5. Steek een 28 G PE canule (een minimale lengte van 3-5 mm en distaal uiteinde bijgesneden voor het inbrengen) in de luchtpijp. Kijk uit voor het einde van de luchtpijp voor bifurcatie en trek vervolgens ongeveer een mm naar achteren om te voorkomen dat alleen een enkele kwab wordt bemonsterd.
    6. Bind de katoenen ligatuur stevig vast om de canule op zijn plaats te houden. Laat de canule niet instorten.
  4. Broncho-alveolaire lavage (BAL)
    1. Vul 0,5 ml PBS in een spuit van 1 ml.
    2. Injecteer nu geleidelijk 0,5 ml PBS in de canule met behulp van een spuit van 1 ml.
    3. Na het injecteren van PBS, aspireer de spuit zolang deze niet bestand is tegen de zuigkracht.
      OPMERKING: Als er weerstand is tijdens het aspireren van de BAL-vloeistof, duidt dat op instorting van het alveolaire of bronchiale weefsel. Trek in dat geval de canule terug met een minuscuul om de canule los te maken van de wanden van het weefsel.
    4. Verzamel de aangezogen vloeistof in een gelabelde microfugebuis en plaats deze op ijs.
    5. Voer nog twee lavages op vergelijkbare wijze uit en verzamel ze in dezelfde flacon (d.w.z. in totaal 0,5 X 3 = 1,5 ml lavage).
    6. Meet het volume van de verzamelde BAL-vloeistof. Lavage recovery moet bijna 90% zijn.
  5. Long vasculair perfusaat (LVP)
    1. Snijd de dalende thoracale aorta op een plaats tussen de borst- en buikhelften, om een back-up van perfusaat in de longen te voorkomen terwijl u door de rechterventrikel perfusing.
    2. Vlek de holte in de buurt van het gesneden aorta-uiteinde, vrij van bloed.
    3. Doordrenk vervolgens de longen met 0,5 ml gemanoïneerde zoutoplossing in de kamertemperatuur die door de rechterventrikel wordt geïnjecteerd.
    4. Verzamel het vasculaire perfusaat uit de holte aan het snijeinde van de dalende thoracale aorta, in een microfugebuis, geplaatst op ijs en meet het volume.
    5. Ligateer de rechter bronchus proximaal aan zijn vertakking van luchtpijp (met katoendraad).
  6. In situ linker longfixatie
    1. Sluit een spuit van 1 ml aan op de luchtpijp canule, die lang genoeg is om door de vorige luchtpijpincisie te steken.
    2. Trek lucht terug in de spuit tot 0,6 ml markering.
    3. Vul vervolgens de resterende spuit (tot het einde) met 2% paraformaldehyde bij kamertemperatuur. Zorg ervoor dat de zuiger klaar is om eruit te springen zonder lucht uit de canule terug te zuigen.
    4. Bevestig de spuit nu met een plakband op een rechtopstaande container, gemeten tot 20 cm hoogte.
    5. Trek voorzichtig de zuiger eruit om de fixatieve naar de luchtpijp te laten stromen. Als er een paar luchtbellen in de canule zitten, plaats de zuiger dan voorzichtig op de spuit en de vloeistof begint na een paar seconden te stromen.
    6. Laat de linkerlong ter plaatse tot zijn totale capaciteitopblazen, gedurende 5 minuten, vanaf een hoogte van 20 cm en vorm een waterkolom van 20 cm.
    7. Zorg er tijdens deze procedure voor dat de juiste longlobben worden beschermd tegen contact met paraformaldehyde, omdat dit de downstream-assays zal beïnvloeden.
    8. Plaats gevouwen laboratoriumweefsels om paraformaldehyde te absorberen dat in contact kan komen met de juiste longlobben.
      LET OP: Paraformaldehyde is zeer giftig. Adem daarom niet in of plaats geen contact met blootgestelde delen van het lichaam. Wees uiterst voorzichtig tijdens het hanteren.
    9. Reinig tijdens de tijd van paraformaldehyde-instillatie de buik.
    10. Snijd de juiste longlobben van de luchtpijp en verwijder alle draad en plaats de lobben onmiddellijk in een gelabeld cryoviaal en laat deze vallen in vloeibare stikstof voor downstream moleculaire /biochemische cytokine-analyse / RT-PCR / western vlekanalyse van longhomogenaat.
    11. Trim de linkerlong voorzichtig voor bindweefsel of pleurale membranen en dompel deze gedurende 24 uur bij 4 °C in 2% paraformaldehyde.
    12. Sluit de vaste long in paraffine in volgens het standaard inbeddingsprotocol.
      Let op: Verwarm de longmonsters niet te veel.
    13. Snijd het buikgedeelte af en onthuid het van het bekken (heup)bot.
    14. Scheid de linker- en rechter dijbeenderen van het bekkengedeelte, in een met zoutoplossing gevulde petrischaal die op ijs wordt bewaard.
  7. Sternale en femur beenmerg aspirate collectie
    1. Reinig het weefsel en de spieren van de botten met behulp van laboratoriumweefsels.
    2. Verzamel het ventrale ribbenkast en borstbeen in een met zoutoplossing gevulde Petrischaal die op ijs wordt bewaard.
    3. Snijd de distale en proximale uiteinden van de sternale en dijbeenderen.
    4. Doordrenk de botten 4 keer met 0,5 ml zoutoplossing, gebruik goed aangebrachte naalden (24 tot 28 G) op spuiten van 1 ml en verzamel de fracties van elk bot in gelabelde buizen die zijn uitgerust met filters en op ijs zijn geplaatst.
      OPMERKING: De naaldmaat varieert per diergrootte. Na het spoelen moet het dijbeen transparant verschijnen.
    5. Zodra de monsters zijn verzameld, stopt u de muis in een plastic zak en plaatst u deze in een vriezer voor dierkarkassen voor een goede verwijdering, volgens de richtlijnen van de institutionele dierenfaciliteit.

3. Monsterverwerking

  1. Totaal (TLC) en differentieel (DLC) leukocytentellingen
    1. Centrifugeer perifere bloed-, BAL-, long vasculaire perfusaat- en beenmergmonsters (sternaal en dijbeen) gedurende 10 minuten bij 500 g.
    2. Verzamel de supernatanten, flash freeze ze en bewaar ze bij -80 °C tot verdere analyse.
    3. Reconstitueren van de cellen in minimaal 200 μL PBS.
    4. Voer TLC uit door BAL, bloed, long vasculair perfusaat en beenmergcellen te tellen op een hemocytometer.
    5. Beits nog eens 9 μL aliquot BAL met een 1 μL mix van calceïnegroen en rood ethidium homodimeer-1 om levende (groene) cellen te kwantificeren als gevolg van intracellulaire esteraseactiviteit en beschadigde BAL-cellen (in rood) als gevolg van verlies van plasmamembraanintegriteit.
    6. Voeg 2% azijnzuur toe aan lyse RBCs, in een 1:10 verhouding voor bloed TLC en 1:2 verhouding voor long vasculairperfusaat TLC.
      LET OP: Pas de celconcentraties aan door te verdunnen in PBS als de concentratie meer dan 1x106 cellen per ml bedraagt (zeer belangrijk voor de beenmergmonsters).
    7. Centrifugeer de cellen om cytospinen op dia's en vlekken te bereiden, zoals hieronder uitgelegd voor DLC's. Tel minimaal 100 cellen voor differentiële leukocytenceltellingen (DLC's).
      OPMERKING: Meestal kan men twee cytospins op één dia bereiden. En na 10-15 minuten luchtdrogen, ga verder met het kleuren van de stap.
    8. Splits de verzamelde BAL van drie pilotmuizen per groep in twee cytospinen elk en vlek voor actine/tubuline en mitochondriën met actieve oxidatieve fosforylering (verminderde mitotracker). Gebruik de BAL van nog drie muizen om elk in twee cytospinnen te splitsen, voor NK1.1/Gr1/CX3CR1 en ATPβ/Ki-67/CD61/Angiostatine bevlekte dia's. Splits de BAL van nog drie muizen in twee cytospinen om te beitsen voor ATPα/Ly6G en CX3CR1/Siglec-F.
  2. Bronchoalveolaire lavage (BAL) en long vasculair perfusaat (LVP) totale eiwitkwantificering
    1. Om O3- en LPS-geïnduceerde verstoringen van de vasculaire barrière of de relatieve oncotische druk in de twee longcompartimenten (d.w.z. het alveolaire septum (interstitiële) en long vasculaire perfusaat (vasculaire) compartimenten te kwantificeren, meet u het totale eiwitgehalte in de verzamelde vloeistoffen.
    2. Analyseer de ontdooide supernatantfracties voor hun totale eiwitconcentratie met behulp van een standaard wasmiddelbestendige colorimetrische test.
    3. Bronchoalveolaire lavage (BAL) en long vasculair perfusaat (LVP) chemokine analyse
      1. Analyseer vervolgens de chemokinen in BAL en long vasculair perfusaat (LVP) supernatanten met behulp van een 33-plex magnetische kraalgebaseerde immunoassay. Dit zal informatie geven over de directionaliteit van luchtweg/interstitium versus vasculaire chemokinegradiënten die zijn vastgesteld na gecombineerde blootstellingen.
      2. Analyseer het volgende panel van chemokinen : CXCL13 (B-lymfocyt chemoattractant), CCL27 (IL-11 R-alpha-locus chemokine (ILC)), CXCL5 (epitheel-afgeleide neutrofiel-activerende peptide 78 (ENA-78)), CCL-11 (eotaxin-1), eotaxin-2 (CCL-2), CCL-11 (eotaxin-1), eotaxin-2 (CCL-2), CCL-11 (eotaxin-1), eotaxin-2 (CCL-2), CCL-11 (eotaxin-1), eotaxin-2 (CCL-2), CCL-11 (eotaxin-1), eotaxin-2 (CCL-2), CCL-11 (eotaxin-1), eotaxin-2 (CCL-2), CCL-2 (CCL-2), CCL-11 (eotaxin-1), eotaxin-2 (CCL-2), CCL-2 (CCL-2) IFNγ (interferon gamma), IL-10 (interleukine-10), IL-16 (interleukine-16), IL-1β (interleukine-1 bèta), IL-2 (interleukine-2), IL-4 (interleukine-4), IL-6 (interleukine-6), CXCL-10 (interferon gamma-geïnduceerd eiwit 10 (IP-10)), CXCL11 (Interferon-gamma-induceerbaar eiwit 9 (IP-9)), KC (keratinocyt chemoattractant), MCP-1 (monocyt chemoattractant eiwit-1), MCP-3 (monocyt chemoattractant eiwit-3), MCP-5 (monocyt chemoattractant eiwit-5), MDC (macrofaag-afgeleide chemokine (CCL22)), MIP-1α (macrofaag inflammatoire eiwit-1 alfa), MIP-1β (macrofaag inflammatoire eiwit-1 bèta), MIP-2 (macrofaag inflammatoire eiwit-2), MIP-3α (macrofaag inflammatoire eiwit-3 alfa), MIP-3β (macrofaag inflammatoire eiwit-3 bèta), RANTES (gereguleerd op activering, normale T-cel uitgedrukt en afgescheiden (CCL5)), CXCL-16, CXCL-12/SDF-1alpha (stromale cel-afgeleide factor 1), TARC (thymus en activering gereguleerde chemokine (TARC)), TECK (Thymus-Expressed Chemokine (CCL25)) en TNFα (tumor necrosis factor alpha).

4. Cytospinkleuring en long histologie

  1. Cytospin biochemische kleuring
    1. Omring de cytospins met een hydrofobe pen om de chemicaliën te bevatten voor incubatie tijdens de procedure.
    2. Rehydrateer de cytospinen gedurende 5 minuten in PBS.
    3. Bevestig de cytospinmonsters in 2% paraformaldehyde gedurende 10 minuten, was drie keer met PBS gedurende elk 5 minuten.
    4. Permeabiliseer met ijskoud 70% aceton gedurende 7 minuten en was opnieuw drie keer met PBS gedurende elk 5 minuten.
    5. Vlek voor actine en tubuline of gereduceerde Mitotracker (incubeer met een mix van 2 μg/50 μL Alexa 488 geconjugeerde falloïdine in groen, en 2 μg/μL Alexa 555 geconjugeerde muis anti-α tubuline of gereduceerde Mitotracker weergegeven in rood, respectievelijk) gedurende 15 minuten.
      OPMERKING: Gebruik het IgG1-isotypecontroleantilichaam van de muis in een afzonderlijke cytospin om het tubulinekleuringsprotocol te valideren. Voer dezelfde stappen uit als uitgelegd van 4.1.1 tot 4.1.8, maar voor isotyperegelaars.
    6. Verwijder de vlekken door het mengsel voorzichtig van de glijbaan te kantelen. Incubeer de dia's met DAPI (4′,6-diamidino-2-fenylindole) gedurende 5-10 minuten om kernen te bevlekken.
    7. Was de cytospins 3 keer met PBS gedurende elk 5 minuten, dek af met anti-fade montagemedia en bewaar 's nachts in het donker bij kamertemperatuur voordat u het beeldvorming.
    8. Verkrijg beelden onder een rechtopstaande microscoop met breed veld uitgerust met een wetenschappelijke camera. Zorg voor consistente belichtingstijden van de camera die zijn ingesteld voor de verschillende fluorescerende kanalen bij het weergeven van dia's.
  2. Cytospin immuun-fluorescerende kleuring:
    1. Omring de cytospins met een hydrofobe pen om de chemicaliën te bevatten voor incubatie tijdens de procedure. Rehydrateer de cytospinen gedurende 5 minuten in PBS.
    2. Fixeer de cytospinmonsters door 10 minuten in 2% paraformaldehyde te broeden, was drie keer met PBS gedurende elk 5 minuten.
    3. Permeabiliseer met 0,1% koude triton X-100 gedurende 2 minuten, was drie keer met PBS gedurende elk 5 minuten.
    4. Blokkeer vervolgens gedurende 15 minuten door de cytospin te incuberen met 1:50 verdunning van de Fc-blokantilichaamvoorraad (om ervoor te zorgen dat het primaire muisantilichaam niet niet specifiek reageert met de fc-antilichamen van de muis).
    5. Tip de dia's om het Fc-blok te verwijderen en verander in 1% BSA voor en incubeer de cytospin met een mix van 3 primaire antilichamen van belang (zie tabel 1 voor de verschillende combinaties) gedurende 30 minuten.
      OPMERKING: Zorg ervoor dat u isotypecontroleantistoffen uitvoert (incubeer met een mixmuis IgG1 en rat IgG2b kappa primaire antilichamen door stap 4.2.1 tot 4.2.9 uit te voeren en de antilichamen te vervangen door isotypecontroles) parallel met overeenkomstige secundaire antilichamen zoals besproken in onze recente studie20.
    6. Was 3 keer met PBS gedurende elk 5 minuten. Incubeer de cytospinen met een mix van naar behoren ontworpen secundaire antilichamen (zie tabel 1 voor de details).
    7. Verwijder de vlekken door de mix voorzichtig van de glijbaan te kantelen, incubeer met DAPI (4′,6-diamidino-2-fenylindole) gedurende 5-10 minuten om kernen te bevlekken. Was 3 keer met PBS gedurende elk 5 minuten.
    8. Coverslip met anti-fade montagemedia en 's nachts bewaren in het donker bij kamertemperatuur voor beeldvorming.
    9. Verkrijg beelden onder een rechtopstaande microscoop met breed veld uitgerust met een wetenschappelijke camera. Zorg voor consistente belichtingstijden van de camera die zijn ingesteld voor alle fluorofoorkanalen bij het weergeven van dia's.
  3. Hematoxyline en eosine (H&E) histologie
    1. Voer aangepaste H&E-kleuring3 uit op long cryo-secties voor alle groepen.
  4. Beeldanalyse
    1. Verwerk en analyseer afbeeldingsgegevensbestanden (.tiff) in Fiji ImageJ open software (https://imagej.net/Fiji/Downloads).
    2. Controleer de vereiste parameters (Gebied, Omtrek, Geïntegreerde dichtheid, Vormdescriptoren, Feret's diameter, Circulariteit, Display label) die moeten worden geregistreerd onder het tabblad Analyseren en Metingen instellen.
    3. Met behulp van de ROI-manager, handmatig overzicht rond 50-200 cellen in het samengevoegde afbeeldingspaneel met behulp van de "vrije hand selecties" tool. Sla de regio's van belang (ROI) op met de opdracht Ctrl+T en kopieer de opgeslagen ROIs voor elke cel naar alle fluorofoorkanalen.
    4. Druk vervolgens op Ctrl+M om de vooraf ingestelde parameters voor alle fluorescerende kanalen te meten (bijv. 405 nm (DAPI of ATPβ in blauw), 488 nm (actine of NK1.1 of Ki-67 in groen), 568 nm (tubuline of Gr1 of CD61 in rood) en 633 nm (CX3CR1 of angiostatine in magenta)).
    5. Sla de resultaten op als .csv bestand onder een toepasselijke naam die uw analyse vertegenwoordigt. Kopieer de resultaten van het .csv bestand naar een spreadsheet en deel de fluorescentie-intensiteit (FI) (de kolom Raw Integrated Density uit het bestand Results) van het gebeitst molecuul door dat van DAPI of CD61 FI, volgens het kleuringsontwerp. Deze ratio's worden "DAPI of CD61 genormaliseerde FI ratio's" genoemd.
    6. Plot vervolgens deze genormaliseerde verhoudingen, circulariteit, celomtrek en Feret-diameter, om elke verandering in celgrootte na de gecombineerde blootstelling aan O3 en LPS te evalueren.
    7. Gebruik geschikte statistische software om de normaliteit van de verzamelde gegevens te controleren en de nulhypothese te testen (zie de sectie statistische analyse hieronder).
  5. statistische analyse
    1. Express resultaten als gemiddelde ± SEM. Per groep werden minimaal drie muizen gebruikt.
    2. Pas voor chemokine-gegevensanalyse eenrichtings ANOVA-p-waarden aan voor valse detectiesnelheid volgens de Benjamini- en Hoshberg-correctie.
    3. Analyseer beeldparameters, cellulariteit, Feret diameter, perimeter, DAPI of CD61 genormaliseerde fluorescentie intensiteitsverhoudingen door Mann-Whitney U test (voor het vergelijken van twee groepen) of Kruskal Wallis test (voor het vergelijken van meerdere groepen) omdat deze gegevens normaal gesproken niet werden gedistribueerd.
    4. Voor de rest van de beeldvormingsexperimenten analyseert u de resultaten met behulp van een eenrichtingsanalyse van variantie, gevolgd door sidaks meervoudige vergelijkingen. p-waarden <0,05 werden als significant beschouwd.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Resultaten

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Gecombineerde blootstelling aan O3 en LPS leidt tot systemische ontsteking en beenmergmobilisatie na 72 uur: Celtellingen in verschillende compartimenten onthulden significante veranderingen in perifeer bloed en het totale aantal totale cellen van het dijbeenmerg bij gecombineerde blootstellingen aan O3 en LPS. Hoewel gecombineerde blootstellingen aan O3 en LPS geen veranderingen teweegbrengen in het totale aantal CELLEN VAN BA...

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Discussie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

De methoden die in de huidige studie worden gepresenteerd, benadrukken het nut van analyse van meerdere compartimenten om meerdere cellulaire gebeurtenissen tijdens longontsteking te bestuderen. We hebben de bevindingen samengevat in tabel 2. Wij en vele laboratoria hebben uitgebreid de muriene respons op intranasale LPS-instillatie bestudeerd, die wordt gekenmerkt door snelle rekrutering van longneutrofielen, die piekt tussen 6-24 uur waarna de resolutie begint. En onlangs hebben we aangetoond dat subkl...

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Openbaarmakingen

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

De auteurs hebben geen belangenconflicten of openbaarmakingen te maken.

Dankbetuigingen

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Het uitgevoerde onderzoek wordt gefinancierd door de NSERC-subsidie van president en startfondsen van het Sylvia Fedoruk Canadian Center for Nuclear Innovation. Het Sylvia Fedoruk Canadian Center for Nuclear Innovation wordt gefinancierd door Innovation Saskatchewan. Fluorescentie beeldvorming werd uitgevoerd in het WCVM Imaging Centre, dat wordt gefinancierd door NSERC. Jessica Brocos (MSc Student) en Manpreet Kaur (MSc Student) werden gefinancierd door de start-up fondsen van het Sylvia Fedoruk Canadian Center for Nuclear Innovation.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel
NaamBedrijfCatalogusnummerOpmerkingen
33-plex Bioplex chemokine panelBiorad12002231
63X olie (NA 1.4-0.6) MicroscoopobjectievenLeicaHCX PL APO CS (11506188)
Alexa 350 geconjugeerd geit anti-muis IgG (H+L)InvitrogenA11045
Alexa 488 geconjugeerd geit anti-muis IgG (H+L)InvitrogenA11002
Alexa 488 geconjugeerd phalloidinInvitrogenA12370
Alexa 555 geconjugeerd muis anti-α tubulin kloon DM1AMillipore05-829X-555
Alexa 568 geconjugeerd geit anti-hamster IgG (H+L)InvitrogenA21112
Alexa 568 geconjugeerd geit anti-rat IgG (H+L)InvitrogenA11077
Alexa 633 geconjugeerd geit anti-konijn IgG (H+L)InvitrogenA21070
Armeens hamster anti-CD61 (kloon 2C9.G2) IgG1 kappaBD Pharmingen553343
C57BL/6 J MuizenJackson Laboratories64
Confocale laserscanningmicroscoopLeicaLeica TCS SP5
DAPI (4',6-diamidino-2-fenylindole)InvitrogenD1306verdeel in 2 µl voorraadjes en bewaar bij -20°C
Omgekeerde fluorescente brede veldmicroscoopOlympusOlympus IX83
Ketamine (Narketan)Vetoquinol100 mg/mlVerdun 10 keer om een 10 mg/ml voorraad te maken
Live (calcein)/Dead (Ethidium homodimeer-1) cytotoxiciteitskitInvitrogenL3224
Muis anti-ATP5A1 IgG2b (kloon 7H10BD4F9)Invitrogen459240
Muis anti-ATP5Â IgG2b (kloon 3D5AB1)InvitrogenA-21351
Muis anti-NK1.1 IgG2a kappa (kloon PK136)Invitrogen16-5941-82
Pierce 660 nm eiwitanalyseThermoscientific22660
Konijn anti-angiostatin (muis aa 98-116) IgGAbcamab2904
Konijn anti-CX3CR1 IgG (RRID 467880)Invitrogen14-6093-81
Rat anti-Ki-67 (kloon SolA15) IgG2a kappaInvitrogen14-5698-82
Rat anti-Ly6G IgG2a kappa (kloon 1A8)Invitrogen16-9668-82
Rat anti-Ly6G/Ly6C (Gr1) IgG2b kappa (kloon RB6-8C5)Invitrogen53-5931-82
Rat anti-muis CD16/CD32 Fc blok (kloon 2.4G2)BD Pharmingen553142
Gereduceerde mitotracker oranjeInvitrogenM7511
Xylazin (Rompun)Bayer20 mg/mlVerdun 2 keer om een 10 mg/ml voorraad te maken

Referenties

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Bhattacharya, J., Matthay, M. A. Regulation and repair of the alveolar-capillary barrier in acute lung injury. Annual Review of Physiology. 75, 593-615 (2013).
  2. Aulakh, G. K. Neutrophils in the lung: "the first responders". Cell Tissue Research. , (2017).
  3. Aulakh, G. K., Suri, S. S., Singh, B. Angiostatin inhibits acute lung injury in a mouse model. American Journal of Physiology - Lung Cellular and Molecular Physiology. 306 (1), 58-68 (2014).
  4. Schneberger, D., Aulakh, G., Channabasappa, S., Singh, B. Toll-like receptor 9 partially regulates lung inflammation induced following exposure to chicken barn air. Journal of Occupational Medicine and Toxicology. 11 (1), 1-10 (2016).
  5. Shah, D., Romero, F., Stafstrom, W., Duong, M., Summer, R. Extracellular ATP mediates the late phase of neutrophil recruitment to the lung in murine models of acute lung injury. American Journal of Physiology - Lung Cellular and Molecular Physiology. 306 (2), 152-161 (2014).
  6. Aulakh, G. K., Balachandran, Y., Liu, L., Singh, B. Angiostatin inhibits activation and migration of neutrophils. Cell Tissue Research. , (2013).
  7. Cakmak, S., et al. Associations between long-term PM2.5 and ozone exposure and mortality in the Canadian Census Health and Environment Cohort (CANCHEC), by spatial synoptic classification zone. Environment International. 111, 200-211 (2018).
  8. Dauchet, L., et al. Short-term exposure to air pollution: Associations with lung function and inflammatory markers in non-smoking, healthy adults. Environment International. 121, Pt 1 610-619 (2018).
  9. Delfino, R. J., Murphy-Moulton, A. M., Burnett, R. T., Brook, J. R., Becklake, M. R. Effects of air pollution on emergency room visits for respiratory illnesses in Montreal, Quebec. American Journal of Respiratory and Critical Care Medicine. 155 (2), 568-576 (1997).
  10. Peterson, M. L., Harder, S., Rummo, N., House, D. Effect of ozone on leukocyte function in exposed human subjects. Environmental Research. 15 (3), 485-493 (1978).
  11. Rush, B., et al. Association between chronic exposure to air pollution and mortality in the acute respiratory distress syndrome. Environmental Pollution. 224, 352-356 (2017).
  12. Rush, B., Wiskar, K., Fruhstorfer, C., Celi, L. A., Walley, K. R. The Impact of Chronic Ozone and Particulate Air Pollution on Mortality in Patients With Sepsis Across the United States. Journal of Intensive Care Medicine. , (2018).
  13. Stieb, D. M., Burnett, R. T., Beveridge, R. C., Brook, J. R. Association between ozone and asthma emergency department visits in Saint John, New Brunswick, Canada. Environmental Health Perspectives. 104 (12), 1354-1360 (1996).
  14. Thomson, E. M., Pilon, S., Guenette, J., Williams, A., Holloway, A. C. Ozone modifies the metabolic and endocrine response to glucose: Reproduction of effects with the stress hormone corticosterone. Toxicology and Applied Pharmacology. 342, 31-38 (2018).
  15. Aulakh, G. K., Brocos Duda, J. A., Guerrero Soler, C. M., Snead, E., Singh, J. Characterization of low-dose ozone-induced murine acute lung injury. Physiological Reports. 8 (11), 14463(2020).
  16. Aulakh, G. K., et al. Quantification of regional murine ozone-induced lung inflammation using [18F]F-FDG microPET/CT imaging. Scientific Reports. 10 (1), 15699(2020).
  17. Charavaryamath, C., Keet, T., Aulakh, G. K., Townsend, H. G., Singh, B. Lung responses to secondary endotoxin challenge in rats exposed to pig barn air. Journal of Occupational Medicine and Toxicology. 3, London, England. 24(2008).
  18. Szarka, R. J., Wang, N., Gordon, L., Nation, P. N., Smith, R. H. A murine model of pulmonary damage induced by lipopolysaccharide via intranasal instillation. Journal of Immunological Methods. 202 (1), 49-57 (1997).
  19. Southam, D. S., Dolovich, M., O'Byrne, P. M., Inman, M. D. Distribution of intranasal instillations in mice: effects of volume, time, body position, and anesthesia. American Journal of Physiology - Lung Cellular and Molecular Physiology. 282 (4), 833-839 (2002).
  20. Aulakh, G. K. Lack of CD34 produces defects in platelets, microparticles, and lung inflammation. Cell Tissue Research. , (2020).
  21. Gilmour, M. I., Hmieleski, R. R., Stafford, E. A., Jakab, G. J. Suppression and recovery of the alveolar macrophage phagocytic system during continuous exposure to 0.5 ppm ozone. Experimental Lung Research. 17 (3), 547-558 (1991).
  22. Yipp, B. G., et al. The Lung is a Host Defense Niche for Immediate Neutrophil-Mediated Vascular Protection. Science Immunology. 2 (10), (2017).
  23. Lee, T. Y., et al. Angiostatin regulates the expression of antiangiogenic and proapoptotic pathways via targeted inhibition of mitochondrial proteins. Blood. 114 (9), 1987-1998 (2009).
  24. Hawkins, C. L., Davies, M. J. Detection, identification, and quantification of oxidative protein modifications. Journal of Biological Chemistry. 294 (51), 19683-19708 (2019).
  25. Hemming, J. M., et al. Environmental Pollutant Ozone Causes Damage to Lung Surfactant Protein B (SP-B). Biochemistry. 54 (33), 5185-5197 (2015).
  26. Oosting, R. S., et al. Exposure of surfactant protein A to ozone in vitro and in vivo impairs its interactions with alveolar cells. American Journal of Physiology. 262 (1), Pt 1 63-68 (1992).
  27. Roth, S., et al. Secondary necrotic neutrophils release interleukin-16C and macrophage migration inhibitory factor from stores in the cytosol. Cell Death & Discovery. 1, 15056(2015).
  28. Kawaguchi, N., Zhang, T. T., Nakanishi, T. Involvement of CXCR4 in Normal and Abnormal Development. Cells. 8 (2), (2019).
  29. Gupta, A., et al. Extrapulmonary manifestations of COVID-19. Nature Medicine. 26 (7), 1017-1032 (2020).
  30. Aulakh, G. K., Kuebler, W. M., Singh, B., Chapman, D. 2017 IEEE Nuclear Science Symposium and Medical Imaging Conference (NSS/MIC). , 1-2 (2017).
  31. Aulakh, G. K., et al. Multiple image x-radiography for functional lung imaging. Physics in Medicine & Biology. 63 (1), 015009(2018).

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Herprints en machtigingen

Toestemming aanvragen om de tekst of afbeeldingen van dit JoVE-artikel te hergebruiken

Toestemming aanvragen

Trefwoorden

Acute Lung InjuryOzone ExposureLPS Induced InjuryMurine Lung ModelFluorescent MicroscopyBronchoalveolar LavageNeutrophil RecruitmentChemokine GradientsAlveolar MacrophagesIntravital Microscopy

Gerelateerde artikelen