Vruchtbaarheidsbehoud bij patiënten met ernstige ovariële disfunctie

Samenvatting

We presenteren details over laboratoriumprocedures voor geneesmiddelvrije in-vitroactivatie (IVA) van ovariële follikels voor patiënten met ernstige ovariële disfunctie. Deze methode zou het aantal opvraagbare oöcyten per ovariële hyperstimulatie kunnen verhogen en het vruchtbaarheidsbehoud voor die patiënten ten goede komen.

Samenvatting

De ovariële functie neemt geleidelijk af tijdens het ouder worden en bij sommige pathofysiologische aandoeningen, waaronder karyotypeafwijkingen, auto-immuunziekten, chemo- en bestralingstherapieën, evenals eierstokoperaties. Bij ongehuwde vrouwen met ernstige ovariële disfunctie is vruchtbaarheidsbehoud belangrijk voor toekomstige zwangerschappen. Hoewel oöcyt cryopreservatie een gevestigde methode is voor vruchtbaarheidsbehoud, konden deze patiënten slechts een beperkt aantal oöcyten behouden, zelfs na ovariële hyperstimulatie, wat leidde tot herhaalde stimulaties om voldoende oöcyten te garanderen om toekomstige zwangerschap te garanderen. Om dit probleem op te lossen, hebben we onlangs een medicijnvrije in vitro activeringsprocedure (IVA) ontwikkeld, die ons in staat stelt om vroege stadia van eierstokfollikels te stimuleren om zich te ontwikkelen tot de preantrale follikelfase. Deze preantrale follikels kunnen reageren op het unieke protocol van gonadotropinestimulatie, wat resulteert in een verhoogd aantal opgehaalde oöcyten per ovariële stimulatie voor cryopreservatie. De geneesmiddelvrije IVA bestond uit de chirurgische aanpak en ovariële stimulatie. We verwijderden een deel van de cortex uit een of beide eierstokken van patiënten onder laparoscopische chirurgie. De ovariële corticale weefsels werden in kleine blokjes gesneden om de Hippo-signaleringsroute te verstoren en de ontwikkeling van follikels in een vroeg stadium te stimuleren. Deze kubussen werden orthotropisch geënt in resterende eierstokken en onder de serosa van beide eileiders. We hebben de chirurgische procedure van de geneesmiddelvrije IVA en het protocol van daaropvolgende eierstokstimulatie al gepubliceerd, maar hierin presenteren we de details van laboratoriummethoden die nodig zijn voor medicijnvrije IVA.

Inleiding

De ovariële functie neemt geleidelijk af tijdens het ouder worden en sommige pathofysiologische aandoeningen, waaronder karyotypeafwijkingen, auto-immuunziekten, chemo- en bestralingstherapieën en eierstokoperaties. Het behoud van de vruchtbaarheid is één van de beste opties voor ongehuwde vrouwen met ernstige ovariële disfunctie om hun potentieel voor toekomstige zwangerschap te bewaren. Voor vruchtbaarheidsbehoud, momenteel zijn twee methodes meestal beschikbaar op het onco-vruchtbaarheidsveld. Oöcyt cryopreservatie is een gevestigde procedure voor vruchtbaarheidsbehoud en vele succesvolle gevallen zijn gemeld^1,2. Aan de andere kant werd cryopreservatie van eierstokweefsel ook vastgesteld voor vruchtbaarheidsbehoud bij kankerpatiënten, maar het is nog steeds een experimentele strategie^3,4. In beide methoden zijn meerdere aantallen volwassen oöcyten nodig om zwangerschap te laten plaatsvinden. Over het algemeen vertoonden patiënten met voortijdige ovariële insufficiëntie (POI), die vóór de leeftijd van 40 jaar amenorroe worden, en vrouwen van middelbare leeftijd met een lage ovariële reserve een slechte ovariële respons (POR) op ovariële stimulatie voor het opleveren van volwassen oöcyten^5,6,7. Bovendien vertoonden jonge patiënten met een laag aantal antrale follikels ook POR aan de ovariële stimulatie⁷. Deze patiënten hebben een zeer beperkt aantal opvraagbare oöcyten, zelfs na de juiste ovariële hyperstimulatie, waardoor meerdere dure procedures nodig zijn om een voldoende aantal oöcyten voor de zwangerschap te garanderen.

Oöcytdonatie gevolgd door in-vitrofertilisatie (IVF) met sperma- en embryotransfer (ET) van de man is de enige optie voor deze POI- en POR-patiënten die moeite hebben met het verkrijgen van hun eigen oöcyten^8,9,10. Oöcytdonatie wordt echter gecompliceerd door ethische kwesties en auto-immuun - en zwangerschapscomplicaties^11,12,13,14. Om deze problemen op te lossen, is de totstandbrenging van onvruchtbaarheidsbehandeling gebruikend de eigen oöcyten van patiënten gewenst. Voor POI-patiënten hebben we de in vitro activatie (IVA) benadering ontwikkeld om succesvolle follikelgroei en de generatie van volwassen oöcyten mogelijk te maken, waardoor een aantal zwangerschappen en bevallingen worden geleid¹⁵. In IVA hebben we eierstokschors gefragmenteerd na verwijdering van eierstokken onder laparoscopische chirurgie en ze twee dagen gekweekt om follikels te activeren door Akt-stimulerende geneesmiddelen en vervolgens heterotopische enting uit te voeren in kunstmatige zakjes gemaakt onder de serosa van eileiders onder tweede laparoscopische chirurgie¹⁵. Deze procedure bevorderde de groei van primordiale, primaire en secundaire follikels na fragmentatie van de eierstokschors om hippo-signaalverstoring¹⁶te bevorderen, gevolgd door twee dagen cultuur met Akt-signaleringstimulatoren¹⁷.

In tegenstelling tot ernstige POI-gevallen hebben POR-patiënten met een verminderde ovariële reserve meerdere secundaire follikels. Omdat Hippo signalering verstoring alleen effectief is in het bevorderen van secundaire follikelgroei¹⁶, hebben we onlangs succesvolle zwangerschappen en bevallingen aangetoond voor POR-patiënten die de medicijnvrije IVA-procedure gebruiken met corticale fragmentatie en orthotopische enting zonder behandeling van de Akt stimulerende geneesmiddelen. Geneesmiddelvrije IVA stimuleert het vroege stadium van eierstokfollikels om zich na slechts één operatie te ontwikkelen tot de preantrale follikelfase en verhoogde het aantal opgehaalde oöcyten voor IVF-embryotransfer^15,18. De geneesmiddelvrije IVA-aanpak heeft verschillende voordelen ten opzichte van onze oorspronkelijke IVA door 1) het vermijden van potentieel follikelverlies tijdens de cultuur, 2) het minimaliseren van invasiviteit en kosten van de tweede operatie, 3) waarbij alleen korte termijn bedrust na de operatie betrokken is en 4) potentieel van spontane zwangerschap als gevolg van orthotopische enting. We hebben onlangs een videoartikel gepubliceerd met de chirurgische procedures van medicijnvrije IVA¹⁹ en gedetailleerde protocollen voor eierstokstimulatie na de operatie²⁰. Hier presenteren we details over laboratoriummethoden die nodig zijn voor medicijnvrije IVA.

Protocol

Schriftelijke geïnformeerde toestemming werd verkregen van elke POR-patiënt met afnemende ovariële reserve die zich inschreef voor de geneesmiddelvrije IVA-behandeling. Deze studie werd goedgekeurd door de Ethische Commissie van de Internationale Universiteit voor Gezondheid en Welzijn (Nr. 17-S-21). Klinische proef werd geregistreerd onder nummer UMIN000034464 en uitgevoerd in overeenstemming met de ethische code van de World Medical Association (Verklaring van Helsinki).

1. Ovariële cortexextractie

1. Verwijder een deel van de ovariële cortex (10 x 10 mm, 2-3 mm dikte) van een of beide eierstokken onder algemene anesthesie door middel van laparoscopische chirurgie zoals eerder beschreven^19,20.
2. Plaats de verzamelde ovariële cortexen in een steriele container met 10 ml gemodificeerde HTF (mHTF) bij 37 °C.

2. Fragmentatie van de eierstokschors

OPMERKING: Warm mHTF op tot 37 °C voordat de eierstokschors wordt ontleed. Houd steriele omstandigheden gedurende de hele procedure. Alle hulpmiddelen voor deze procedure worden vermeld in de tabel met materialen.

1. Plaats de verzamelde ovariële cortexen in een plastic schaal met 5-10 ml mHTF bij 37 °C en plaats ze op de warmteplaat om het weefsel op 37 °C te houden (figuur 2A).
2. Maak een foto van elke cortex met behulp van een digitale camera met de naam van de patiënt voordat u de volgende procedure start om achtergrondgegevens van de patiënt te koppelen.
3. Plaats een individuele cortex op een steriel gaas bevochtigd met mHTF (Figuur 2B).
   OPMERKING: Breng extra mHTF aan met een wegwerppipet op het gaas om te voorkomen dat het oppervlak van de cortex tijdens deze procedure uitdroogt.
4. Verwijder restpapier van medulla waar het er roze uitziet met een microschaar, zodat de dikte van het weefsel 1-2 mm bereikt (figuur 2C en D).
   OPMERKING: Om het verlies van follikels in een vroeg stadium te voorkomen, moet u de corticale strips met een dikte van minder dan 1 mm niet voorbereiden, omdat de follikels in een vroeg stadium zich binnen 1-2 mm van het oppervlak van de ovariële cortex^{bevinden 21}.
5. Ontleed een weefselstuk van 1 mm x 1 mm x 5 mm van elke eierstokschorsstrook met behulp van een fijne scalpel en onderwerp het aan histologische analyse om de aanwezigheid van resterende follikels te bepalen zoals eerder beschreven¹⁸ (Figuur 2E).
   OPMERKING: De ontlede weefsels voor histologie worden ondergedompeld in mHTF en blijven tot de fixatie op 4 °C(figuur 2F,zie stap 4).
6. Snijd de cortex in stroken van 1 mm x 1 mm x 10 mm met behulp van een fijne scalpel (figuur 2G).
   OPMERKING: Het is gemakkelijker te snijden door op de scalpel te drukken dan door eraan te trekken.
7. Snijd deze weefselstrips in kleine blokjes van 1 mm x 1 mm x 1 mm (afbeelding 2H).
   OPMERKING: Om veranderingen van de osmotische druk in het medium te voorkomen, voegt u mHTF met mate toe voordat het weefsel automatisch wordt getransgrafeerd.

3. Auto-enting van eierstok corticale fragmenten

1. Open de verpakking van de IVA canule en leg deze op een steriel doekje.
2. Spoel de binnenkant van de IVA canule af met mHTF door mHTF meerdere keren aan te werken en te ontladen.
3. Aspireer 100-200 μL mHTF om de punt van de IVA-canule te vullen om te voorkomen dat de corticale kubussen uitdrogen tijdens het laden (Figuur 3A).
4. Plaats de corticale blokjes in de punt van de IVA canule met een fijn pincet (Afbeelding 3B-E).
   OPMERKING: Het aantal corticale kubussen voor het laden is afhankelijk van de entplaats. Over het algemeen kunnen 20-30 kubussen worden getransplanteerd in een orthotrope resterende eierstok, terwijl 10-15 kubussen kunnen worden getransplanteerd in een zakje onder de serosa van de eileider.
5. Houd na het laden van de corticale kubussen de punt van de canule met de corticale kubussen bij de vingers totdat u de IVA-canule naar een chirurg brengt. Dit voorkomt dat de kubustemperatuur daalt.
   OPMERKING: De details van autografting procedure onder laparoscopische chirurgie zijn eerder gemeld¹⁹. Voor het enten van eierstok corticale kubussen is een canulevormig apparaat (IVA canule) ontwikkeld door onze medewerker, de Kitazato Corporation.

4. Histologische analyse van de ovariële cortex

OPMERKING: Om het aantal resterende follikels te tellen, voert u een histologische analyse uit zoals eerder beschreven¹⁵.

1. Markeer het oppervlak van de corticale strip met een weefselmarkeringskleurstof vóór monsterfixatie. Dit geeft de kant van de cortex aan in de strip voor histologie.
2. Bevestig de tissuestrips 's nachts bij 4 °C met de oplossing van Bouin.
   OPMERKING: Om atretische follikels te detecteren, raden we niet aan paraformaldehyde te gebruiken voor bevestiging om krimp van oöcytcytcytplasma te voorkomen.
3. Dehydrateer en integreer de weefselstrips in paraffine.
4. Sectie het paraffineblok met het weefselmonster serieel door.
5. Bevlek elke sectie met hematoxyline en eosine om de follikels te visualiseren.
6. Tel de follikels zoals eerder beschreven¹⁷.

Resultaten

In de eerste publicatie van de IVA-benadering¹⁵hebben we de eierstokschorsblokjes één voor één getransplanteerd naar de entplaatsen onder laparoscopische chirurgie (figuur 1A). Omdat 100-150 eierstokblokjes werden gebruikt, duurde het 3-4 uur voor weefseltransplantatie onder laparoscopische chirurgie. Ook gingen sommige eierstokblokjes verloren voordat ze werden geënt. Omdat de IVA canule 20-30 kubussen in één keer naar een entplaats kon overbrengen

Discussie

In dit manuscript toonden we een gedetailleerd laboratoriumprotocol voor drugsvrije IVA. De drug-vrije IVA is een nieuwe benadering van onvruchtbaarheidsbehandeling voor POR-patiënt met afnemende ovariële reserve om secundaire follikelsgroei te bevorderen, resulterend in het opleveren van meer rijpe oöcyten na ovariële stimulatie en toenemend in succesvolle zwangerschap²⁰. Bij 15 POR-patiënten met een afnemende ovariële reserve bereikte deze aanpak één spontane zwangerschap, in vitro bevruchting-e...

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel

Naam	Bedrijf	Catalogusnummer	Opmerkingen
4.5 ons specimen container	FALCON	354013	Andere producten kunnen ook geschikt zijn
60mm schaal	FALCON	351007	Andere producten kunnen ook geschikt zijn
50 x 50 cm steriele dekking	HOGY Medical	SR-823	Elk type steriele producten kunnen ook geschikt zijn
Variabele pijp	FALCON	357575	Andere producten kunnen ook geschikt zijn
Fijne schaar, Gebogen	WPI	#14224-G	Hoewel andere producten ook geschikt kunnen zijn, raden we sterk aan dit product te gebruiken
Heet plaat	TOKAI HIT	TPiE-SP	Gebruik in operatiekamer om de temperatuur van schalen met eierstokweefsel te handhaven voordat ze worden getransplanteerd
Human Serum Albumine Oplossing	Irvine Scientific	9988	Medium voor het hanteren van eierstokweefsel
IVA canule	KITAZATO	446030 IVA-6030E	Specifieke canule voor weefsel autografting
KAI medische Wegwerp scalpel	WPI	#5 10-A	Hoewel andere producten ook geschikt kunnen zijn, raden we sterk aan dit product te gebruiken
Micro schaar, Gebogen	WPI	#503364	Hoewel andere producten ook geschikt kunnen zijn, raden we sterk aan dit product te gebruiken
Gemodificeerd HTF Medium-HEPES	Irvine Scientific	90126	Medium voor het hanteren van eierstokweefsel
Steriele gaas	Osaki Medical	15004	Elk type steriele producten kunnen ook geschikt zijn
Zwitserse pincet, Gebogen Tips	KAI	#504505	Hoewel andere producten ook geschikt kunnen zijn, raden we sterk aan dit product te gebruiken