Intraspinale holte-injectie van menselijke mesenchymale stamcellen en het volgen van hun migratie naar de hersenen van ratten

Samenvatting

Er kunnen verschillende toedieningsroutes worden gebruikt om mesenchymale stamcellen (MSC's) aan de hersenen af te leveren. In de huidige studie werden MSC's toegediend in de neuraxis en de hersenen via injectie in de spinale holte. MSC's werden geïnjecteerd in de ruggengraatholten van ratten en de migratie van stamcellen werd gevolgd en gekwantificeerd.

Samenvatting

Mesenchymale stamcellen (MSC's) zijn bestudeerd voor de behandeling van verschillende ziekten. Bij neurodegeneratieve ziekten met defecten in zowel de hersenen als het ruggenmerg is de toedieningsweg erg belangrijk, omdat MSC's zowel naar de hersenen als naar het ruggenmerg moeten migreren. Dit artikel beschrijft een methode voor het toedienen van MSC's in het wervelkanaal (injectie in de intraspinale holte) die zich kan richten op de hersenen en het ruggenmerg in een rattenmodel. Een miljoen MSC's werden geïnjecteerd in de wervelkanalen van ratten ter hoogte van lendenwervels 2-3. Na toediening werden de ratten 0, 6 en 12 uur na de injectie geëuthanaseerd. Optische beeldvorming en kwantitatieve real-time polymerasekettingreactie (qPCR) werden gebruikt om de geïnjecteerde MSC's te volgen. De resultaten van de huidige studie toonden aan dat MSC's die via de ruggenmergholte werden toegediend, vervolgens om 12 uur in zowel de hersenen als het ruggenmerg konden worden gedetecteerd. Intraspinale holte-injectie heeft het voordeel dat er geen algehele anesthesie nodig is en heeft weinig bijwerkingen. Het nadeel van de lage migratiesnelheid van MSC's naar de hersenen moet echter worden overwonnen.

Inleiding

Mesenchymale stamcellen
Onder ziekteomstandigheden scheiden MSC's ziektespecifieke therapeutische stoffen af via paracriene acties¹ waarvan is gemeld dat ze de immuunrespons reguleren, beschadigde weefsels herstellen en giftige stoffen verwijderen². Daarom wordt MSC-therapie als effectiever beschouwd dan single-target therapie bij de behandeling van multifactoriële ziekten zoals de ziekte van Alzheimer en sarcopenie 3,4,5,6. Bovendien hebben MSC's, in tegenstelling tot farmaceutische producten, een homing-effect, waarbij ze zich verplaatsen naar het gebied van het beschadigde weefsel door inflammatoire cytokines of chemokines in het lichaam te herkennen ^7,8. Helaas bereikt slechts een subset van de cellen het beschadigde gebied en neemt de levensvatbaarheid van MSC's af tijdens de migratie ^9,10,11,12. Om de therapeutische werkzaamheid van MSC's te maximaliseren, is het dus noodzakelijk om levensvatbare cellen op de doelplaats af te leveren. Daarom is het bij het toedienen van MSC's belangrijk om de juiste toedieningsweg te kiezen, op basis van de aard van de doelziekte.

Injectie route
Er zijn tal van routes waarlangs therapeutische middelen aan patiënten worden toegediend. De meest gebruikelijke methoden zijn intraveneuze injectie in de systemische circulatie, orale toediening en subcutane of intramusculaire injectie. Bij neurodegeneratieve ziekten is het belangrijkste obstakel bij het afleveren van therapeutische middelen aan de hersenen de bloed-hersenbarrière (BBB). De BBB beschermt de hersenen tegen ziekteverwekkers van buitenaf door middel van nauwe verbindingen tussen bloedvaten en het hersenparenchym^13,14. De BBB voorkomt echter paradoxaal genoeg ook dat therapeutische middelen het hersenparenchym binnendringen. Daarom is de doorgang door de BBB de belangrijkste hindernis bij de ontwikkeling van therapieën voor hersenziekten^15,16. Intracerebrale injectie wordt uitgevoerd om dit nadeel te ondervangen door doelstoffen rechtstreeks in de hersenen te injecteren door middel van een chirurgische ingreep 17,18,19. Er moet echter rekening worden gehouden met de bijwerkingen van chirurgische ingrepen, vooral omdat de naald neuronale cellen tijdens de procedure beschadigt.

Toediening van de intraspinale holte
Intrathecale toediening - de toediening van geneesmiddelen in het wervelkanaal of de subarachnoïdale ruimte - levert geneesmiddelen af aan de hersenen of neuraxis via de cerebrospinale vloeistof (CSF) en is een levensvatbaar alternatief voor intracerebrale injectie. Intrathecale injecties kunnen worden onderverdeeld op basis van de injectieplaats: laterale ventrikel, cisterna magna en ruggengraatholte. Alle drie de routes zorgen ervoor dat medicijnen of cellen zich door het hersenvocht kunnen verspreiden in de hersenen en het ruggenmerg. De toediening van geneesmiddelen aan de hersenen kan efficiënter zijn in het geval van intracerebroventriculaire en intra-cisterna magna-injecties, omdat het middel dicht bij de hersenen wordt geïnjecteerd. Injectie in de intraspinale holte heeft echter het voordeel dat er geen algemene anesthesie of operatie nodig is voor het inbrengen van een intraventriculair reservoir, omdat het over het algemeen veilig is²⁰, en kan indien nodig herhaaldelijk worden uitgevoerd.

Het doel van deze studie was het valideren van toediening van de intraspinale holte als een middel om MSC's toe te dienen aan zowel de hersenen als het ruggenmerg. Eerst werd de intraspinale holte vastgesteld in een rattenmodel. Vervolgens werden MSC's gelabeld met een lipofiele tracer, DiD (DiIC18(5); 1,1-dioctadecyl-3,3,3-tetramethylindodicarbocyanine, 4-chloorbenzeensulfonaatzout), om de efficiëntie van stamcelmigratie naar het ruggenmerg en de hersenen te evalueren. Ex vivo optische beeldvorming werd uitgevoerd om de celdispersie te beoordelen. Dit eenvoudige protocol kan zonder chirurgische ingreep worden uitgevoerd en kan niet alleen worden gebruikt voor het toedienen van stamcellen, maar ook voor geneesmiddelen, antilichamen, contrastmiddelen en andere stoffen die bedoeld zijn om in het ruggenmerg of de hersenen te worden afgeleverd.

Protocol

OPMERKING: Deze studie is goedgekeurd door de Institutional Animal Care and Use Committee (goedkeuringsnummer: 20170125001, datum: 25 januari 2017) van het Samsung Biomedical Research Institute (SBRI) in het Samsung Medical Center. Als geaccrediteerde faciliteit van de Association for Assessment and Accreditation of Laboratory Animal Care International handelt de SBRI in overeenstemming met de richtlijnen van het Institute of Laboratory Animal Resources.

1. Bereiding van van menselijke Wharton's gelei afgeleide MSC's

1. Teelt van menselijke van Wharton's gelei afgeleide mesenchymale stamcellen (WJ-MSC's)
   1. Ontdooi snel een flesje menselijke WJ-MSC's in een waterbad van 37 °C. Breng de WJ-MSC's over in een conische buis van 50 ml en voeg een groeimedium toe met een volume van ten minste 10 x dat van de cellen (v/v). Pipetteer op en neer om de cellen op te schorten.
   2. Centrifugeer bij 300 × g gedurende 5 min. Gooi de supernatant voorzichtig weg en breng de cellen opnieuw in suspensie.
      OPMERKING: Zorg ervoor dat u de celpellet niet weggooit.
   3. Zaad WJ-MSC's in T175-kolven met een dichtheid van 5.000-6.000 cellen/cm². Incubeer WJ-MSC's in een CO₂ -incubator van 37 °C. Vervang het groeimedium elke 72 uur totdat WJ-MSC's 80-90% samenvloeiing bereiken.
      OPMERKING: Over het algemeen duurt het 3-4 dagen voordat de MSC's een samenvloeiing van 80-90% hebben bereikt.
2. Onderkweek van menselijke WJ-MSC's
   1. Gooi het groeimedium weg en spoel de cellen met 10 ml fosfaatgebufferde zoutoplossing (PBS). Verwijder de PBS en voeg 5 ml 0,25% trypsine-dinatriumethyleendiaminetetra-azijnzuur (EDTA) toe (zie de materiaaltabel). Incubeer de cellen bij 37 °C in een CO₂ -incubator gedurende 3 minuten totdat de WJ-MSC's loskomen van de kweekkolf.
   2. Voeg 5 ml groeimedium met 10% foetaal runderserum toe om de 0,25% trypsine-EDTA te neutraliseren. Verzamel het celmengsel en breng het over in een conische buis van 50 ml. Was de celkweekkolf met 10 ml groeimedium en verzamel de cellen in een buis van 50 ml met behulp van een steriel serologisch pipet.
   3. Centrifugeer het celmengsel bij 300 × g gedurende 5 min. Gooi de supernatant weg, suspendeer de cellen in 10 ml groeimedia en tel het aantal WJ-MSC's.
      LET OP: Pas op dat u de celpellet niet weggooit.
   4. Zaad WJ-MSC's met een dichtheid van 4.000-6.000 cellen/cm², afhankelijk van het experiment.
3. Labelen van WJ-MSC's met DiD-kleurstof en de voorbereiding van WJ-MSC's voor injectie in de intraspinale holte
   OPMERKING: De DiD-kleurstofetiketteringsprocedure is uitgevoerd volgens de instructies van de fabrikant.
   1. Maak WJ-MSC's los wanneer ze een samenvloeiing van 80% bereiken, met behulp van de hierboven genoemde procedure. Suspendeer WJ-MSC's met een dichtheid van 1 × 10⁶/ml in fenolroodvrije minimale essentiële medium (MEM) α zonder serum.
   2. Voeg 5 μL DiD-etiketteringsoplossing toe per 1 ml celsuspensie; Meng voorzichtig met pipetteren.
   3. Incubeer gedurende 15 minuten bij 37 °C; Centrifugeer de celsuspensie bij 300 × g gedurende 5 min.
   4. Verwijder de supernatant en suspendeer de WJ-MSC's opnieuw in fenolroodvrije MEM α met een dichtheid van 1 × 10⁶/0,2 ml.

2. Intraspinale holte-injectie van WJ-MSC's

1. Voorbereiding op injectie in de intraspinale holte
   1. Verdoof 6 weken oude Sprague-Dawley-ratten met 5% isofluraan; Handhaaf vervolgens de anesthesie met 2% isofluraan tijdens de chirurgische ingreep.
      OPMERKING: Optimaliseer de anesthesieomstandigheden voordat u met het experiment begint.
   2. Scheer het operatiegebied met een elektrisch scheerapparaat voor kleine dieren.
      OPMERKING: Het elektrische scheerapparaat kan worden vervangen door een handmatig scheerapparaat en scheergel.
   3. Desinfecteer het operatiegebied met povidon-jodium. Maak een incisie van 3 cm in de huid met een chirurgisch mesje. Snijd het resterende huid- en spierweefsel weg met een chirurgisch mes en een schaar. Onthul de doornuitsteeksels in lumbale 2-3 (L2-3).
2. Injectie van DiD-gelabelde WJ-MSC's via de intraspinale holte
   1. Plaats de rat in buikligging. Buig de ruggengraat van de rat op de juiste manier om de afstand tussen de aangrenzende processus spinosus te vergroten, met behulp van voldoende hoeveelheden papier, tissues of andere materialen die kunnen helpen bij het behouden van de juiste positie.
   2. Vul een spuit van 1 ml met 0,2 ml DiD-gelabelde WJ-MSC's. Plaats een spuit-naaldcombinatie van 23 G verticaal tussen de processus spinosus L2 en L3 en breng de naald in totdat deze het wervellichaam raakt.
   3. Wanneer de naald het wervellichaam raakt, trekt u deze ongeveer 0,5 cm in en plaatst u de punt van de naald in het wervelkanaal. Kantel de spuit en plaats de punt van de naald zo dat deze in de rostrale richting wijst. Injecteer WJ-MSC's in de wervelholte gedurende een periode van 1 minuut.
      OPMERKING: De injectiesnelheid moet van tevoren worden geoptimaliseerd.
   4. Verwijder na de injectie de spuit volledig uit het wervelkanaal. Hecht de incisie en desinfecteer vervolgens de operatieplaats met povidon-jodium.
3. Behandeling na de procedure
   1. Stabiliseer en houd de rat in bedwang om elke beweging te voorkomen, en plaats hem ondersteboven in een hoek van 45° gedurende 15 minuten, terwijl hij nog onder narcose is. Stop na 15 minuten met de anesthesie en wacht tot de rat wakker wordt.

3. Evaluatie van injectie in de intraspinale holte

1. Euthanasie van de ratten en isolatie van de hersenen en het ruggenmerg 0, 6 en 12 uur na injectie
   1. Verdoof de proefdieren met 5% isofluraan; handhaaf de anesthesie met 2% isofluraan tijdens PBS-perfusie.
   2. Maak een incisie onder het middenrif met een chirurgische schaar. Open de incisie met een tang en snijd de ribbenkast rostraal door om het hart bloot te leggen.
   3. Maak een klein gaatje in het rechter atrium en steek een vlindernaald in de linker hartkamer. Prik 100 ml koude PBS in de linker hartkamer gedurende 4-5 minuten, totdat de lever vrij is van bloed.
   4. Maak na perfusie een lange incisie aan de achterkant van het hoofd tot de staart met behulp van een chirurgisch mesje langs het lengtevlak. Isoleer de resterende hersenen en de hele wervelkolom met behulp van een chirurgische schaar, een tang en een bottensnijder. Verwijder de resterende ribben, verbonden botten en vruchtvlees.
2. Ex vivo DiD fluorescerende optische beeldvorming
   1. Plaats de geïsoleerde weefsels in de kamer van het optische beeldvormingsapparaat.
   2. Stel de parameters als volgt in: emissie, 700 nm; excitatie, 605 nm; en belichtingstijd, 2 seconden, als fotonen per seconde per centimeter in het kwadraat per steradiaal (p/s/cm²/sr). Leg de optische beelden vast.
      OPMERKING: Alle afbeeldingen moeten worden verkregen met identieke verlichtingsinstellingen (lampspanning, filters, f/stop, gezichtsveld en binning).
   3. Teken drie rechthoekige interessegebieden (ROI's) van gelijke grootte voor het ruggenmerg en één cirkel-ROI voor de hersenen met behulp van het tekengereedschap. Meet de fluorescerende intensiteiten van de ROI's.
3. Extractie van genomisch DNA (gDNA) uit het ruggenmerg en hersenweefsel
   1. Verwijder de schedel en wervelkolom voorzichtig met een chirurgische tang, een schaar en een rongeur.
   2. Oogst de hersenen en het ruggenmerg van de schedel en de wervelkolom. Snijd het ruggenmerg in drie stukken (cervicaal, thoracaal en lumbaal).
      OPMERKING: De geoogste weefsels moeten worden bewaard bij -80 °C als ze niet onmiddellijk worden geanalyseerd.
   3. Maal de tissues met een voorgekoelde vijzel, stamper en vloeibare stikstof. Extraheer gDNA met behulp van commerciële producten, volgens de instructies van de fabrikant.
4. Kwantitatieve real-time polymerasekettingreactie (qPCR)
   1. Kwantificeer de hoeveelheid gDNA in elk monster met behulp van een spectrofotometer.
   2. Voer qPCR uit met 10 ng gDNA per monster en humane Arthrobacter luteus (ALU) primers^12,21.
   3. Bereken het exacte aantal WJ-MSC's in de monsters met behulp van de ΔΔC_T-methode ²².

Resultaten

Om de werkzaamheid van intraspinale holte-injectie van MSC's te evalueren, werden in de huidige studie DiD-gelabelde MSC's gebruikt. Alvorens MSC's in de ruggenmergholte te injecteren, werd de werkzaamheid van de etikettering in vitro beoordeeld met behulp van optische beeldvorming en fluorescentiemicroscopie (Figuur 1). Na het kleuren van de MSC's met het DiD-labelingreagens met behulp van de procedure beschreven in protocolsectie 3.1, werden optische beeld...

Discussie

De optimale toedieningsweg voor behandeling met MSC's moet worden gekozen afhankelijk van de doelziekte, de toestand van de patiënt en het type geneesmiddel dat moet worden toegediend. Bij celtherapieën, waaronder MSC-therapie, moet directe injectie van stamcellen in de hersenen of intrathecaal via de CSF worden overwogen, aangezien de cellen de BBB¹⁹ niet kunnen passeren. Intraspinale holte-injectie is relatief niet-invasief en veroorzaakt geen neuronale schade i...

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel

Naam	Bedrijf	Catalogusnummer	Opmerkingen
0.25% Trypsin-EDTA	Gibco-invitrogen	25200114	Celcultuur
Fetal bovien serum	biowest	S1520	Cultuurmediumsupplement
gentamicin	Gibco-invitrogen	15710-072	Cultuurmediumsupplement
Gentra Puregene Tissue Kit	QIAGEN	158689	gDNA-isolatie
MEM, geen glutamine, geen fenol rood	Gibco	51200038	WJ-MSC formulering voor injectie
Miminum Essential Medium alpha	Gibco-invitrogen	12571063	WJ-MSC-kweekmedium
Power SYBR Green PCR Master Mix	Applied Biosystems	4368577	Reagens voor kwantitatieve real-time PCR
QuantStudio 6 Flex Real-Time PCR System	Thermo fisher	4485694	Kwantitatieve real-time PCR
trypan blauw	Gibco	15250061	Injectie
Vybrant DiD Cell-Labeling Solution	invitrogen	V22887	Stamcellenlabelingoplossing
Xenogen IVIS Spectrum system	Perkin Elmer	124262	Optisch beeldvormingsapparaat