Methodenartikel

Systematische scoringsanalyse voor darmontsteking in een muriene dextran natriumsulfaat-geïnduceerde colitismodel

DOI:

10.3791/62135

⸱

14 februari 2021

 ,  ,  ,  ,  , 
1Department of Pathology, University of Michigan, 2Department of Surgery, Klinikum Rechts der Isar, Technische Universität München, 3Wallenberg Centre for Molecular Medicine, Linköping University, 4Department of Biomedical and Clinical Sciences (BKV), Linköping University

In dit artikel

Samenvatting

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Systematische scoring van darmontsteking met behulp van een gratis computerondersteund systeem is een krachtig hulpmiddel om histopathologische veranderingen in colitismodellen kwantitatief te vergelijken, gekenmerkt door de aanwezigheid van zweren en ontstekingsveranderingen. Histologische colitis score evaluatie versterkt klinische observaties en vergemakkelijkt de interpretatie van gegevens.

Samenvatting

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Murine colitis modellen zijn hulpmiddelen die uitgebreid worden gebruikt in studies gericht op het begrijpen van de pathobiologie van inflammatoire darmaandoeningen. Er moeten echter nog robuuste normen worden vastgesteld voor objectieve en reproduceerbare kwantificering van de ernst van de ziekte. De meeste colitis-analysemethoden zijn gebaseerd op beperkte histologische scoring van kleine darmsegmenten, wat leidt tot gedeeltelijke of bevooroordeelde analyses. Hier combineren we beeldverwerving met hoge resolutie en longitudinale analyse van de hele dikke darm om darmletsel en ulceratie te kwantificeren in het door dextrannatriumsulfaat (DSS) geïnduceerde model van muriene colitis. Dit protocol maakt het mogelijk om objectieve en reproduceerbare resultaten te genereren zonder uitgebreide gebruikerstraining. Hier bieden we uitgebreide details over monstervoorbereiding en beeldanalyse aan de hand van voorbeelden van gegevens van DSS-geïnduceerde colitis. Deze methode kan gemakkelijk worden aangepast aan andere modellen muriene colitis die significante ontsteking hebben geassocieerd met mucosale letsel. We tonen aan dat de fractie ontstoken/gewond en geërodeerd/gezwollen slijmvlies ten opzichte van de volledige lengte van de dikke darm nauw parallel loopt met klinische bevindingen zoals gewichtsverlies te midden van DSS-geïnduceerde ziekteprogressie. Dit histologische protocol biedt een betrouwbare tijd en kosteneffectieve hulp om analyses van ziekteactiviteit op een onbevooroordete manier te standaardiseren in DSS-colitis-experimenten.

Inleiding

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

De gastro-intestinale epitheelbarrière speelt een cruciale rol bij het scheiden van luminale antigenen en pathogenen van onderliggende weefselcompartimenten1. Epitheliaal letsel en mucosale wonden gezien in pathologische aandoeningen zoals inflammatoire darmziekte (IBD), ischemie of chirurgisch letsel worden geassocieerd met klinische symptomen zoals diarree, gewichtsverlies, bloed in de ontlasting en buikpijn. Als reactie op letsel migreren en verspreiden epitheelcellen zich om mucosale barrièredefecten opnieuw te epithelialiseren en te herstellen. Oplossing van ontsteking en restitutie van mucosale integriteit zijn cruciaal voor het herstellen van intestinale mucosale homeostase en functie2,3,4.

Verschillende diermodellen zijn gebruikt om de onderliggende moleculaire mechanismen te bestuderen die verband houden met de schade aan de intestinale epitheelbarrière. Gevestigde en gemakkelijk toepasbare modellen van chemisch geïnduceerde colitis worden veel gebruikt, met name in studies met betrekking tot ontstekingsletsel zoals IBD. Een gemeenschappelijk, reproduceerbaar en betrouwbaar murine colitis model maakt gebruik van dextran natriumsulfaat (DSS) gemedieerde darmletsel en ontsteking. De ernst van de ziekte varieert afhankelijk van de muisstam, dosis DSS, de duur van de toediening van DSS en het molecuulgewicht van DSS5,6,7.

Intestinale mucosale schade tijdens DSS-colitis wordt meestal geëvalueerd met behulp van de Disease Activity Index (DAI), een samengestelde score die wordt bepaald door gewichtsverlies, fecaal bloedgehalte en ontlastingsconsistentie. Het fecale bloedgehalte kan microscopisch (gedetecteerd met behulp van een guaiaczuurtest in de ontlasting) of macroscopisch zijn; fecale consistentie wordt geclassificeerd als hard, zacht of vloeibaar (d.w.z. diarree)5,8. Het scoren van deze klinische parameters kan subjectief zijn en kan variëren afhankelijk van de ervaring en bias van de gebruiker, hoewel de gegevens over het algemeen betrouwbare informatie bieden en dus veel worden gebruikt door IBD-onderzoekers. Daarentegen is er geen algemeen aanvaarde methode voor histologische evaluatie van mucosale schade. Meestal worden geselecteerde delen van de dikke darm geïnspecteerd door een getrainde patholoog en gescoord op basis van verschillende parameters, waaronder crypteletsel en leukocyteninfiltratie9,10,11. Omdat het aantal onderzochte parameters en de hoeveelheid geanalyseerd weefsel echter aanzienlijk varieert tussen individuele rapporten, is de vergelijkbaarheid van veel gepubliceerde studies beperkt. Om de bias van waarnemers te verminderen en de concordantie tussen studies te verbeteren, moet een ideaal histologisch scoreprotocol: 1) de volledige lengte van de dikke darm omvatten, omdat darmslijmvliesontsteking meestal variabel is en skip-laesies gebruikelijk zijn, 2) analyse beperken tot specifieke sleutel en gemakkelijk interpreteerbare parameters om subjectiviteit te verminderen, 3) snelle, consistente verwerking van grote aantallen monsters vergemakkelijken en 4) breed beschikbare en betaalbare tools gebruiken voor het verzamelen, analyseren en presenteren van gegevens.

Hier beschrijven we een techniek om de hele dikke darm of lange segmenten van de dunne darm te verwerken in een "Swiss roll" -configuratie, samen met het gebruik van een gratis computerondersteund scoresysteem om darmslijmvliesontsteking en schade als gevolg van DSS-geïnduceerde colitis te analyseren.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Alle beschreven dierproeven werden goedgekeurd door het Committee on the Use and Care of Animals van de Universiteit van Michigan.

1. Weefseloogst

  1. Euthanaseer muizen op humane wijze met behulp van isofluraan anesthesie gevolgd door cervicale dislocatie, in overeenstemming met goedgekeurde protocollen. Voor alle dierproeven is goedkeuring verkregen door een gecertificeerde beoordelingscommissie in overeenstemming met de nationale en institutionele richtlijnen voor de behandeling van dieren.
  2. Plaats de muis op een ontleedkussen in een liggende positie. Immobiliseer de uiteinden van de muis met naalden van 20 G x 1 1/2 inch G.
  3. Maak met een tang en schaar een kleine incisie op de buikhuid en trek deze naar de zijkant om het buikvlies bloot te leggen.
  4. Open de buikholte met een middellijnincisie in het buikvlies van het schaambeen naar de zijkanten van de buik.
  5. Verwijder voorzichtig weefsels en organen totdat de dikke darm wordt gevisualiseerd. Snijd het bekkenbeen aan beide zijden van de dikke darm om het orgaan volledig te visualiseren, dat zich uitstrekt van de anus naar het cecum.
  6. Verwijder voorzichtig vet, kleine aderen en slagaders die aan de dikke darm zijn bevestigd, terwijl u het orgaan voorzichtig ontleedt, snijd gewoon proximaal naar de anus en gewoon distaal naar het cecum.
    OPMERKING: De ontlede dikke darm moet op kamertemperatuur blijven tijdens het voltooien van de Zwitserse rolprocedure.
  7. Spoel de dikke darm voorzichtig door met 1x PBS, met behulp van een flexibele plastic galnaald die door de anus wordt ingebracht om fecale inhoud te verwijderen.
  8. Plaats de dikke darm in een rechte lijn en open in de lengterichting langs de mesenterische slagader. Bisect de dikke darm in de lengterichting van het distale naar het proximale uiteinde (figuur 1A). De ene helft van het weefsel kan worden gebruikt voor histologische analyse, terwijl de andere kan worden verwerkt voor westerse vlek, PCR of gerold in een tweede Zwitserse rol voor verse bevroren immunofluorescentiemicroscopie12.

2. Bereiding van Zwitserse broodjes

  1. Knip extra weefsel uit de proximale dikke darm met behulp van een scheermesje totdat ongeveer dezelfde breedte over de lengte van de hele dikke darm is verkregen.
  2. Lijn de dikke darm uit om het lumen naar boven te laten zien en maak het weefsel volledig plat met behulp van een flexibele galnaald. Voeg indien nodig meer PBS toe om het weefsel vochtig te houden tijdens de procedure.
  3. Verwijder het teveel aan PBS met een papieren doekje. Voeg met een spuit en gavage naald 10% neutrale gebufferde formalineoplossing toe over het weefsel gedurende 2-3 minuten om het weefsel te fixeren en af te vlakken.
  4. Gebruik rechte tangen om het uiteinde van de distale dikke darm te grijpen en draai de dikke darm in concentrische cirkels van het distale naar proximale uiteinde (Figuur 1B).
    OPMERKING: Het is mogelijk om de binnenkant van de Zwitserse rol terug te duwen tijdens het rollen met behulp van de wesvinger om ervoor te zorgen dat het weefsel zich in de rol bevindt.
  5. Steek een naald van 27 G om de dikke darm in het midden vast te pinnen om de Zwitserse rolvorm vast te houden (figuur 1C).
  6. Plaats de Zwitserse rol met de naald in een insluitcassette in een histologische monstercontainer.
    OPMERKING: Weefsel moet vóór de fixatie parallel ten opzichte van de cassette worden georiënteerd (figuur 1D).
  7. Bevestig het weefsel in 10% neutrale gebufferde formalineoplossing 's nachts bij 4 °C13.
  8. Was het weefsel na een nachtfixatie 3x met PBS.
  9. Voeg 70% ethanol toe aan het weefsel voorafgaand aan het inbeddingsproces van paraffine. Verwijder de naald van de Zwitserse rol voordat u verder gaat. Weefsel kan bij kamertemperatuur in ethanol worden bewaard tot inbedding van paraffine13.
  10. Plaats monsters in de weefselprocessor, sluit in paraffine in en bereid 4 secties van μm voor, gemonteerd op positief geladen microscopieglaasjes (figuur 1E). Dit kan een optioneel stoppunt zijn.
    OPMERKING: Een goede weefseloriëntatie is van cruciaal belang om secties te bereiken die geschikt zijn voor beeldanalyse. Parallelle Zwitserse rolinsluiting in de paraffinecassette zal resulteren in volledige secties die geschikt zijn voor beeldanalyse (Figuur 1F-1H). Schuine secties moeten worden vermeden om onvolledige secties te voorkomen (figuur 1I-1K). Zie de sectie Discussie voor meer informatie.
  11. Vleksecties met hematoxyline en eosine (H&E)13.

3. Digitaal scannen en analyseren

OPMERKING: Selecteer voor een nauwkeurige evaluatie van mucosale veranderingen alleen secties die ten minste 90% van de totale lengte van de dikke darm bevatten.

  1. Bevlekte secties scannen met behulp van een diascanner of imager (zie Tabel met materialen). Geproduceerde beelden hebben een resolutie van 0,25 micron per pixel nodig met 40x objectief en 40x vergroting.
  2. Installeer en download een geschikte software voor digitale analyse van gescande dia's (zie Tabel met materialen).
  3. Scanafbeeldingen openen in de beeldverwerkingssoftware (afbeelding 2A). Controleer of de hele dubbele punt zichtbaar is en of er geen ontbrekende gebieden van het monster zijn.
  4. Activeer de gereedschappen labelafbeelding en schaalbalk om gescande dia's correct te identificeren door op Afbeelding labelen (afbeelding 2A)te klikken.
  5. Open het gereedschap Annotaties door op Annotaties(Figuur 2A) te klikken en maak 3 verschillende lagen door op Nieuwe laag (figuur 2B) te klikken om de totale lengte van de Zwitserse rol, ontsteking / letsel en erosie / ulceratie te kwantificeren. Kies een andere kleur voor elke laag door op Laagkleur (afbeelding 2B)te klikken.
  6. Meet de lengte van elke laag/categorie door op het gereedschap Pen (figuur 2A) te klikken, met behulp van het muscularis-slijmvlies als referentie:
    1. Bekijk de afbeelding met een zoom van 400 μm (of meer) om een adequate visualisatie van het muscularis-slijmvlies te vergemakkelijken.
      OPMERKING: De vergroting kan eenvoudig worden geregeld met behulp van het scrollwiel van de muis en moet zo nodig worden aangepast terwijl u over de sectie beweegt om alle lijnen te tekenen.
    2. Klik op het gereedschap Pen om een lijn te tekenen na het muscularis-slijmvlies (figuur 2A). Verplaats de aanwijzer indien nodig om het aangrenzende gebied te visualiseren voor analyse.
      OPMERKING: Telkens wanneer de pen wordt gestopt, wordt een klein nieuw laaggebied gegenereerd. Het kan worden gevisualiseerd en bewerkt met het tabblad Laaggebieden (selecteer het gewenste segment en klik op Laag verwijderen in geval van fouten of correcties, figuur 2B).
  7. Zodra alle lagen (figuur 2C) zijn gedefinieerd, exporteert u de gegevens met behulp van de knop Raster exporteren naar tekstbestand in de opties voor laaggebieden ( figuur2B).
    OPMERKING: Sla bestanden vaak op tijdens het maken van de lagen om ervoor te zorgen dat gegevens correct worden opgeslagen.
  8. Open de tekstbestanden en kopieer de gegevens met een spreadsheetsoftware. Totaal alle segmenten uit elke regio en bereken het percentage letsel en ulceratie met betrekking tot de totale lengte.
  9. Om de Histologische Colitis Score (HCS) te berekenen en de ernst van de ziekte te evalueren, moet u drie hoofdkenmerken overwegen zoals hieronder beschreven.
    1. Controleer op gezond darmslijmvlies dat wordt gekenmerkt door georganiseerde epitheelcellen in de crypt-luminale as, lamina propria met weinig immuuncellen en subjacent muscularis mucosa dat het slijmvlies en submucosa met elkaar in contact brengt (Figuur 3A).
    2. Controleer op ontsteking/letsel dat wordt gekenmerkt door epitheliale crypten die verzwakt zijn of gedeeltelijk ontbrekende epitheelcellen en mucosale ontsteking met neutrofiele infiltratie in crypten (Figuur 3B).
    3. Controleer op de aanwezigheid van erosie/ulceratie die wordt gekenmerkt door gebieden zonder oppervlakte-epitheel of gebieden die volledig ontbreken aan epitheliale crypten met of zonder geassocieerde leukocyten (Figuur 3C).
  10. Bereken HCS van gewonde en gezwollen gebieden uitgedrukt als een percentage van de totale lengte in de volgende formule:
    figure-protocol-1
    OPMERKING: HCS combineert het percentage ontsteking/letsel en erosie/ulceratie en voegt een factor twee toe aan de laatste, op basis van een redelijke veronderstelling dat volledig verlies van het epitheel resulteert in maximaal verlies van barrière-integriteit en dus ergere ziekte. HCS vertegenwoordigt consequent de morfologische veranderingen veroorzaakt door DSS geïnduceerde experimentele colitis. Interessant is dat we geen duidelijke correlatie hebben gezien tussen het aantal colonische lymfoïde aggregaten of follikels en de ernst van de klinische ziekte bij DSS-colitis en daarom hebben we de kwantificering niet in deze analyse opgenomen.
  11. Maak een momentopname van de representatieve afbeeldingen (klik op Momentopname, Figuur 2A) en sla op. Voeg indien nodig schaalbalken toe door te klikken op Schaalbalk weergeven/verbergen (afbeelding 2A).

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Resultaten

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Om de betrouwbaarheid van deze Histologische Colitis Score Analyse te illustreren in de context van mucosale schade na DSS uitdaging en daaropvolgend herstel van colitis, hebben we 2,5% DSS toegediend in het drinkwater van acht 10 weken oude mannelijke C57BL6 wilde type muizen gedurende 5 dagen gevolgd door een herstelperiode met regelmatig water gedurende 5 dagen. Er was geen verandering in lichaamsgewicht tijdens de acute toediening van DSS, van dag 0 tot 5 (figuur ...

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Discussie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Ons Histologisch Colitis Score systeem is een betrouwbaar hulpmiddel om weefselontsteking en schade in de darm te kwantificeren. Deze benadering biedt een beter begrip van de histopathologische toestand van het hele orgaan zonder de bias van het selecteren van kleine gebieden of onvolledige secties. Een van de kritieke stappen om dit protocol met succes uit te voeren, is een goede voorbereiding van Zwitserse rollen die analyse van ten minste 90% van de lengte van de dikke darm mogelijk maken; parallelle oriëntatie tijden...

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Openbaarmakingen

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

De auteurs hebben niets bekend te maken.

Dankbetuigingen

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

De auteurs willen steun van NIH-financiering DK055679, DK089763, DK079392, DK061739, DK072564 en de University of Michigan Pathology Slide Scanning Services erkennen.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel
NaamBedrijfCatalogusnummerOpmerkingen
Aperio AT2 – High Volume, Digital Whole Slide ScanningLeica BiosystemsAperio AT2
Absorbent Underpads with waterproof moisture barrierVWR International56616-032
American Line 66-0089 Single Edge Blade, 100 per pkgGT MidwestTL5837
BD Luer-Lok Disposable Syringes without NeedlesFisher scientific14-823-2A
Bonn Strabismus Scissors - ToughCutFine Science tools11103-09
Bonn Strabismus Scissors - ToughCutFine Science tools14084-09
Dumont #5 ForcepsFine Science tools11251-20
Formalin solution, neutral buffered, 10%SigmaHT501640-19L
HistoPrep 70% EaFisherbran70% denatured ethyl alcohol
ImageScopeAperioVersion 12.3.3.5039http://www.leicabiosystems.com/pathology-imaging/aperio-epathology/integrate/imagescope/
LeakBuster Specimen Containers: SterileStarplex ScientificB120210
Phosphate-Buffered Saline, without calcium & magnesiumCorning21-040-CV
Plastic Feeding tubes, 20 GA x 30 mmInstechFTP2030
PrecisionGlide Needle, Size: 20 G x 1 1/2 inBD (Becton, Dickinson and Company)305176
PrecisionGlide Needle, Size: 27 G x 1/2 inBD (Becton, Dickinson and Company)305109
Syringe, 10 mlBD (Becton, Dickinson and Company)302995
Unisette Tissue CassettesSimportM505-2

Referenties

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Kagnoff, M. F. The intestinal epithelium is an integral component of a communications network. Journal of Clinical Investigation. 124 (7), 2841-2843 (2014).
  2. Laukoetter, M. G., Nava, P., Nusrat, A. Role of the intestinal barrier in inflammatory bowel disease. World Journal of Gastroenterology. 14 (3), 401-407 (2008).
  3. Baumgart, D. C., Sandborn, W. J. Crohn's disease. Lancet. 380 (9853), 1590-1605 (2012).
  4. Ordas, I., Eckmann, L., Talamini, M., Baumgart, D. C., Sandborn, W. J. Ulcerative colitis. Lancet. 380 (9853), 1606-1619 (2012).
  5. Vowinkel, T., Kalogeris, T. J., Mori, M., Krieglstein, C. F., Granger, D. N. Impact of dextran sulfate sodium load on the severity of inflammation in experimental colitis. Digestive Diseases and Sciences. 49 (4), 556-564 (2004).
  6. Kitajima, S., Takuma, S., Morimoto, M. Histological analysis of murine colitis induced by dextran sulfate sodium of different molecular weights. Experimental Animals. 49 (1), 9-15 (2000).
  7. Mahler, M., et al. Differential susceptibility of inbred mouse strains to dextran sulfate sodium-induced colitis. American Journal of Physiology. 274 (3), 544-551 (1998).
  8. Wirtz, S., Neufert, C., Weigmann, B., Neurath, M. F. Chemically induced mouse models of intestinal inflammation. Nature Protocols. 2 (3), 541-546 (2007).
  9. Kozlowski, C., et al. An entirely automated method to score DSS-induced colitis in mice by digital image analysis of pathology slides. Disease Models & Mechanisms. 6 (3), 855-865 (2013).
  10. Perse, M., Cerar, A. Dextran sodium sulphate colitis mouse model: traps and tricks. Journal of Biomedicine and Biotechnology. 2012, 718617(2012).
  11. Mizoguchi, A. Animal models of inflammatory bowel disease. Progress in Molecular Biology and Translational Science. 105, 263-320 (2012).
  12. Flemming, S., et al. Desmocollin-2 promotes intestinal mucosal repair by controlling integrin-dependent cell adhesion and migration. Molecular Biology of the Cell. 31 (6), 407-418 (2020).
  13. Luna, L. G. Armed Forces Institute of Pathology (U.S) & Armed Forces Institute of Pathology (U.S.). Manual of Histologic Staining Methods of the Armed Forces Institute of Pathology. 3d edn. , Blakiston Division. (1968).
  14. Kelm, M., et al. Targeting epithelium-expressed sialyl Lewis glycans improves colonic mucosal wound healing and protects against colitis. The Journal of Clinical Investigation Insight. 5 (12), (2020).
  15. Reed, M., et al. Epithelial CD47 is critical for mucosal repair in the murine intestine in vivo. Nature Communications. 10 (1), 5004(2019).
  16. Laukoetter, M. G., et al. JAM-A regulates permeability and inflammation in the intestine in vivo. Journal of Experimental Medicine. 204 (13), 3067-3076 (2007).
  17. Khounlotham, M., et al. Compromised intestinal epithelial barrier induces adaptive immune compensation that protects from colitis. Immunity. 37 (3), 563-573 (2012).

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Herprints en machtigingen

Toestemming aanvragen om de tekst of afbeeldingen van dit JoVE-artikel te hergebruiken

Toestemming aanvragen

Trefwoorden

Muismodel voor colitishistologische scoringSwiss Roll techniekpreparatie van colonweefselmucosale beschadigingbeeldanalysekwantificering van ziekte ernstepitheliale ulceratie

Gerelateerde artikelen