Hier presenteren we een protocol om een nieuw rattenmodel van actieve hiv-infectie met chimerische hiv (EcoHIV) vast te stellen, wat van cruciaal belang is voor het verbeteren van ons begrip van hiv-1 virale reservoirs in de hersenen en het aanbieden van een systeem om hiv-geassocieerde neurocognitieve aandoeningen en bijbehorende comorbiditeiten (d.w.z. drugsmisbruik) te bestuderen.
Een abonnement op JoVE is vereist om deze inhoud te bekijken. Log in of start vandaag met uw gratis proefperiode.
Methodenartikel
Een rattenmodel van EcoHIV-herseninfectie
In dit artikel
Samenvatting
Samenvatting
Het is goed bestudeerd dat het ecoHIV geïnfecteerde muismodel van aanzienlijk nut is bij het onderzoeken van hiv-geassocieerde neurologische complicaties. De vaststelling van het ecoHIV-geïnfecteerde rattenmodel voor studies naar drugsmisbruik en neurocognitieve aandoeningen zou gunstig zijn bij de studie van neuroHIV- en HIV-1-geassocieerde neurocognitieve aandoeningen (HAND). In deze studie tonen we de succesvolle creatie van een rattenmodel van actieve hiv-infectie met chimeric HIV (EcoHIV). Ten eerste werd de lentivirale constructie van EcoHIV gedurende 48 uur verpakt in gekweekte cellen van 293 FT. Vervolgens werd het voorwaardelijke medium geconcentreerd en getiterd. Vervolgens voerden we bilaterale stereotaxic injecties uit van de EcoHIV-EGFP in F344/N rattenhersenweefsel. Een week na infectie werden EGFP-fluorescentiesignalen gedetecteerd in het geïnfecteerde hersenweefsel, wat aangeeft dat EcoHIV met succes een actieve HIV-infectie bij ratten induceert. Bovendien werd immunostaining uitgevoerd voor de microgliale celmarker, Iba1. De resultaten gaven aan dat microglia het overheersende celtype was dat EcoHIV herbergde. Bovendien vertoonden EcoHIV-ratten veranderingen in de temporele verwerking, een potentieel onderliggend neurobehavioral mechanisme van HAND en synaptische disfunctie acht weken na infectie. Gezamenlijk breidt de huidige studie het EcoHIV-model van HIV-1-infectie uit naar de rat die een waardevol biologisch systeem biedt om hiv-1 virale reservoirs in de hersenen te bestuderen, evenals HAND en bijbehorende comorbiditeiten zoals drugsmisbruik.
Inleiding
Biologische systemen hebben ons begrip van hiv-1 geassocieerde neurocognitieve aandoeningen (HAND) en hun onderliggende neurale mechanismen verbeterd2. Het bepalen welk biologisch systeem het meest geschikt is voor een bepaalde studie is vaak afhankelijk van de kwestie van belang2. De beperking van het scala aan modellen van gastdieren daagt studies uit naar de ontwikkeling van hiv-1-ziekten. Om hiv-1 virale replicatie en pathogenese te onderzoeken, creëerden Potash et al.3 een muismodel van actieve HIV-1-infectie, waarbij het coderingsgebied van HIV-oppervlakte-envelopglycoproteïne, gp120, werd vervangen door ecotropische MLV gp80, wat leidde tot succesvolle virale replicatie bij muizen4. Na staartaderinjecties bij chimerische HIV (EcoHIV) muizen werden veel kenmerken waargenomen die lijken op die van HIV-1 seropositieve personen (bijv. geïnfecteerde lymfocyten en macrofagen, gericht op antivirale immuunresponsen, en ontsteking3,5,6).
Hoewel muizen en ratten beide lid zijn van de Muridae, kunnen fundamentele soortenverschillen hun geschiktheid voor specifieke experimentele vragenbeïnvloeden 7. Daarom zou de uitbreiding van het EcoHIV-infectiemodel tot ratten (vaak gebruikt in studies naar drugsmisbruik en neurocognitieve aandoeningen) voordelig zijn in de studie van neuroHIV. Hun grotere formaat maakt bijvoorbeeld de implantatie van de halskatheter voor zelftoedieningsprocedures van geneesmiddelen praktischer8. Zelftoedieningstechnieken voor geneesmiddelen bij ratten zijn gebruiktom de motivatie bij HIV-19 te evalueren . Bovendien werden veel neurocognitieve / gedragstaken aanvankelijk ontworpen voor ratten10. Hier rapporteren we het gebruik van stereotaxic injecties van EcoHIV bij ratten om het EcoHIV-infectiemodel uit te breiden en een belangrijke kans te bieden om nieuwe vragen met betrekking tot neuroHIV en HAND te beantwoorden.
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Protocol
Alle dierprotocollen werden herzien en goedgekeurd door de Animal Care and Use Committee van de Universiteit van South Carolina (federaal betrouwbaarheidsnummer: D16-00028). Zes volwassen mannelijke F344/N rat werd gekoppeld in een gecontroleerde omgeving onder een 12/12 licht: donkere cyclus met ad libitum toegang tot voedsel en water. Alle dieren werden verzorgd aan de hand van richtlijnen die zijn vastgesteld door de National Institutes of Health in de Guide for the Care and Use of Laboratory Animals.
1. Virusverpakking in cellen van 293 FT
- Kweek de 293 FT cellen (5×105/ml) in gelatine gecoate 75 cm2 kolven met DMEM plus 10% FBS11. Kweek cellen bij 37 °C tot 50% samenvloeiing bij transfectie.
- Verdun 22,5 μL transfectiereagens (bijv. Lipofectamine 3000) in 750 μL medium (bijv. Opti-MEM) in een microcentrifugebuis van 1,5 ml en vortex gedurende 3 s.
- Verdun 20 μg EcoHIV plasmide DNA in 750 μL medium in een microcentrifugebuis van 1,5 ml en meng goed.
- Voeg verdund DNA toe aan de buis van verdund transfectiereagens en meng voorzichtig. Incubeer gedurende 15 minuten bij kamertemperatuur.
- Voeg het mengsel toe aan 10 ml voorverwarmd DMEM-medium in een kolf van 75 cm2. Incubeer cellen gedurende 2 dagen bij 37 °C.
- Oogst en combineer 24 ml voorwaardelijk medium uit de twee kolven die het verpakte lentivirus bevatten.
- Centrifugeer alle 24 ml voorwaardelijk medium bij 500 x g gedurende 10 minuten bij 4 °C. Breng het geklaarde supernatant over in een steriele buis van 50 ml.
- Combineer 8 ml Lenti-x concentrator met 24 ml geklaard supernatans (verhouding 1:3). Mix door zachte inversie. Incubeer het mengsel gedurende twee dagen bij 4 °C.
- Centrifugeer het mengsel gedurende 45 minuten bij 4 °C op 1500 x g. Verwijder voorzichtig het supernatant.
- Hang de pellet voorzichtig opnieuw op met 100 μL van 100 mM PBS.
- Titer virusconcentratie met een p24 ELISA kit.
2. EcoHIV-EGFP virus stereotaxic operaties
- Verdoof ratten met 3% sevofluraan. Ga verder met stap 2.2 wanneer de ratten niet reageren op schadelijke stimuli en reflexen afwezig zijn.
- Scheer de haren uit het hersengebied en steriliseer de huid twee keer met 70% ethanol en een scrub op basis van chloorhexidine. Zet de rat in een gevoelige positie in het stereotaxic-apparaat.
- Maak een incisie (5-6 cm) door de huid langs de hoofdhuidmiddenlijn.
- Markeer twee boorposities op 0,8 mm zijdelings, 1,2 mm rostral tot bregma. Boor een gat (diameter 0,4 mm) in elke schedelpositie.
- Vul de ecoHIV lentivirusoplossing (1,04 × 106 TU/ml) in een injectiespuit van 10 μL. Bevestig de spuit aan het stereotaxic-apparaat.
- Beweeg de naald dicht bij het boorgatoppervlak. Meet en beweeg 2,5 mm diep.
- Infuseer 1 μL virusoplossing met een snelheid van 0,2 μL/min. Houd de naald gedurende 5 minuten in het injectiegebied. Beweeg de naald langzaam omhoog tot deze zich buiten de rattenschedel bevindt.
- Hecht de huid met een 4-0 zijden draad.
- Steriliseer de incisie eenmaal met 70% ethanol. Subcutaan injecteren butorfenol (Dorolex, 0,1 mg/kg lichaamsgewicht).
- Breng de rat over naar een herstelkamer met een verwarmingskussen totdat hij wakker wordt.
3. Visualisatie van hersensecties
OPMERKING: Wacht één tot acht weken na de virale infusie van EcoHIV.
- Verdoof de rat met 5% sevofluraan. Ga verder met stap 3.2 wanneer de ratten niet reageren op schadelijke stimuli en reflexen afwezig zijn.
- Bevestig de rat in een liggende positie in een zuurkast.
- Inciseer de huid langs de thoracale middellijn. Snijd het middenrif door en open de borstholte.
- Steek een naald van 20 G × 25 mm in de linkerventrikel.
- Open direct het rechter atrium met een schaar.
- Perfuseer 50 ml voorgeknepen 100 mM PBS met een snelheid van 5 ml/min.
- Perfuseer 100 ml koude 4% paraformaldehyde met een snelheid van 5 ml/min.
- Onthoofd de rat, open de hoofdhuid en verwijder de hersenen.
- Postfix 's nachts met 4% paraformaldehyde.
- Breng de hersenen over naar 40 ml 30% sacharose in 100 mM PBS in een buis van 50 ml totdat de hersenen naar de bodem drijven (ongeveer 3 dagen).
- Snap bevries de hersenen in methylbutanol gedurende 2 minuten bij - 80 °C.
- Bevestig het hersenweefsel op een metalen platform in een cryostaat van -20 °C.
- Snijd 50 μm dikke coronale secties met behulp van de cryostaat.
- Breng de hersenschijfjes met een fijne borstel over op glazen dia's.
- Monteer secties in 0,3 ml antivetmedium en dek af met 22 mm 50 mm afdeklips.
- Houd de glazen glazhouders in het donker bij kamertemperatuur droog.
- Beeld de beoogde neuronen met een confocale microscoop met behulp van Z-stack op basis van hersengebied grenzen en morfologische kenmerken van neuronen.
OPMERKING: De gebruikte confocale microscoopinstellingen waren: vergroting van 60 X (A/1.4, olie) en een Z-vlakinterval van 0,15 μm (pinholegrootte 30 μm; teruggeprojecteerde pinholeradius 167 nm) met een golflengte van 488 nm.
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Resultaten
Het geconditioneerde medium werd verzameld uit lentivirus van EcoHIV-EGFP geïnfecteerde 293FT cellen. Vervolgens werd het geconcentreerd en getiterd, waarna stereotaxisch werd geïnjecteerd in de hersenen (corticale regio) van F344 / N-ratten. Zeven dagen na de injectie werden ratten opgeofferd en werden beelden genomen van coronale hersenschijfjes variërend van bregma 5,64 mm tot bregma -4,68 mm. In figuur 1Azijn er significante EcoHIV-EGFP-signalen in de hersenen, vooral in de cortex en de ...
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Discussie
In dit protocol hebben we een EcoHIV-geïnduceerd HIV-infectiemodel bij ratten vastgesteld. In het bijzonder beschreven we een bilaterale stereotaxic injectie van EcoHIV in de cortex die met succes een actieve HIV-infectie in de rattenhersenen veroorzaakte 7 dagen na de injectie. Bovendien tonen we aan dat EcoHIV-infectie bij ratten een goed biologisch systeem kan zijn om belangrijke aspecten van HAND te bestuderen. Acht weken na de EcoHIV-infectie vertoonden ratten significante neurocognitieve stoornissen, waaronder de v...
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Openbaarmakingen
Geen van de auteurs heeft belangenconflicten te verklaren.
Dankbetuigingen
Dit werk werd gefinancierd door NIH-subsidies HD043680, MH106392, DA013137 en NS100624.
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Materialen
| Naam | Bedrijf | Catalogusnummer | Opmerkingen |
|---|---|---|---|
| 293FT cellen | ThermoFisher Scientific | R70007 | |
| Antibiotic-Antimycotic oplossing | Cellgro | 30004CI | 100X |
| Corning BioCoatGelatin 75cm² Rechthoekige Cell Culture Flask met gekanteld hals en geventileerde dop | Life Technologies | 354488 | |
| Corning DMEM met L-Glutamine, 4,5 g/L Glucose en Sodium Pyruvaat | Life Technologies | 10013CV | |
| Dekglas | VWR | 637-137 | |
| boor | |||
| Dumont #5 Forceps | World Precision Instruments | 14095 | |
| Dumont #7 Forceps | World Precision Instruments | 14097 | |
| Eppendorf Snap-Cap Microcentrifuge Biopur Safe-Lock Tubes | Life Technologies | 22600028 | |
| Ethicon Vicryl Plus Antibacteriële, 4-0 Polyglactin 910 Naald, 27in. FS-2 | Med Vet International | VCP422H | |
| Hamilton spuit | Hamilton | 1701 | |
| Invitrogen Lipofectamine 3000 Transfectie Reagens | Life Technologies | L3000015 | |
| Iris Forceps | World Precision Instruments | 15914 | |
| Iris Schaartjes | World Precision Instruments | 500216 | |
| Lentivirus-Associated p24 ELISA Kit | Cell Biolabs, inc. | VPK-107-5 | |
| Lenti-X Concentrator | Takara | PT4421-2 | |
| Opti-MEM I Reduced Serum Medium | Life Technologies | 11058021 | |
| Paraformaldehyde | Sigma-Aldrich | 158127-500G | |
| Paraformaldehyde | Sigma | P6148 | |
| ProLong Gold | Fisher Scientific | P36930 | |
| Sevofluraan | Merritt Veterinary Supply | 347075 | |
| stereotaxisch apparaat | Kopf Instruments | Model 900 | |
| SuperFrost Plus Dia's | Fisher Scientific | 12-550-154% | |
| Vannas Schaartjes | World Precision Instruments | 500086 |
Referenties
- Illenberger, J. M., et al. HIV Infection and Neurocognitive Disorders in the Context of Chronic Drug Abuse: Evidence for Divergent Findings Dependent upon Prior Drug History. Journal of Neuroimmune Pharmacology. 15 (4), 715-728 (2020).
- Joseph, S. B., Swanstrom, R. The evolution of HIV-1 entry phenotypes as a guide to changing target cells. Journal of Leukocyte Biology. 103 (3), 421-431 (2018).
- Potash, M. J., et al. A mouse model for study of systemic HIV-1 infection, antiviral immune responses, and neuroinvasiveness. Proceedings of the National Academy of Sciences U S A. 102 (10), 3760-3765 (2005).
- Albritton, L. M., Tseng, L., Scadden, D., Cunningham, J. M. A putative murine ecotropic retrovirus receptor gene encodes a multiple membrane-spanning protein and confers susceptibility to virus infection. Cell. 57, 659-666 (1989).
- Geraghty, P., Hadas, E., Kim, B. H., Dabo, A. J., Volsky, D. J., Foronjy, R. HIV infection model of chronic obstructive pulmonary disease in mice. American Journal of Physiology - Lung Cellular and Molecular Physiology. 312 (4), 500-509 (2017).
- Gu, C. J., et al. EcoHIV infection of mice establishes latent viral reservoirs in T cells and active viral reservoirs in macrophages that are sufficient for induction of neurocognitive impairment. PLoS Pathogens. 14 (6), 1007061(2018).
- Ellenbroek, B., Youn, J. Rodent models in neuroscience research: is it a rat race. Disease Models, Mechanisms. 9 (10), 1079-1087 (2016).
- Feduccia, A. A., Duvauchelle, C. L. Novel apparatus and method for drug reinforcement. Journal of Visualized Experiments. (42), e1998(2010).
- Bertrand, S. J., Mactutus, C. F., Harrod, S. B., Moran, L. M., Booze, R. M. HIV-1 proteins dysregulate motivational processes and dopamine circuitry. Scientific Reports. 8 (1), 7869(2018).
- McGaughy, J., Sarter, M. Behavioral vigilance in rats: task validation and effects of age, amphetamine, and benzodiazepine receptor ligands. Psychopharmacology. 117 (3), Berl. 340-357 (1995).
- Li, H., Aksenova, M., Bertrand, S., Mactutus, C. F., Booze, R. M. Quantification of filamentous actin (F-actin) puncta in rat cortical neurons. Journal of Visualized Experiments. (108), (2016).
- McLaurin, K. A., Li, H., Booze, R. M., Mactutus, C. F. Disruption of Timing: NeuroHIV Progression in the Post-cART Era. Scientific Reports. 9 (1), 827(2019).
- McLaurin, K. A., Moran, L. M., Li, H., Booze, R. M., Mactutus, C. F. The Power of Interstimulus Interval for the Assessment of Temporal Processing in Rodents. Journal of Visualized Experiments. (146), e58659(2019).
- Li, H., McLaurin, K. A., Mactutus, C. F., Booze, R. M. Ballistic Labeling of Pyramidal Neurons in Brain Slices and in Primary Cell Culture. Journal of Visualized Experiments. (158), (2020).
- Ko, A., et al. Macrophages but not Astrocytes Harbor HIV DNA in the Brains of HIV-1-Infected Aviremic Individuals on Suppressive Antiretroviral Therapy. Journal of Neuroimmune Pharmacology. 14 (1), 110-119 (2019).
- Sopper, S., et al. The effect of simian immunodeficiency virus infection in vitro and in vivo on the cytokine production of isolated microglia and peripheral macrophages from rhesus monkey. Virology. 220 (2), 320-329 (1996).
- Llewellyn, G. N., Alvarez-Carbonell, D., Chateau, M., Karn, J., Cannon, P. M. HIV-1 infection of microglial cells in a reconstituted humanized mouse model and identification of compounds that selectively reverse HIV latency. Journal of NeuroVirology. 24 (2), 192-203 (2018).
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Herprints en machtigingen
