Methodenartikel

De darm in beeld brengen met "CLARITY"

1K weergaven

⸱

DOI:

10.3791/62143

⸱

11 juni 2021

 , 
1Department of Pathology & Laboratory Medicine, Emory University, Atlanta, GA

In dit artikel

Samenvatting

We beschrijven het protocol voor passieve CLARITY (PACT) kleuring van de darm van muizen om visualisatie van subepitheliale weefsels mogelijk te maken, waaronder neuronen, glia en entero-endocriene cellen (EEC) zonder weefselsectie. Het protocol omvat hydrogel-inbedding van formaldehyde-gefixeerd weefsel en daaropvolgende delipidatie met behulp van een anionisch reinigingsmiddel om het weefsel te "zuiveren".

Samenvatting

CLARITY (Clear Lipid-exchanged Acrylamide-hybridized Rigid Imaging compatible Tissue hYdrogel) is onlangs geëvolueerd als een waardevolle techniek waarbij acrylamide wordt ingebed om weefsel te delipideren (zonder secties) en om de 3D-weefselstructuur te behouden voor immunokleuring. De techniek is zeer relevant bij het in beeld brengen van de dynamische darmomgeving waar verschillende celtypen op elkaar inwerken tijdens homeostase en ziektetoestanden. Deze methode die is geoptimaliseerd voor de darm van muizen wordt hier beschreven, die helpt bij het traceren van celtypen zoals epitheel, entero-endocriene, neuronen, glia en de neuronale projecties in de epitheel of entero-endocriene cellen die respectievelijk microbiële detectie of chemodetectie van voedingsstoffen mediëren. Het darmweefsel (1-1,5 cm) wordt op dag 1 's nachts bij 4% paraformaldehyde (PFA) gefixeerd in fosfaatgebufferde zoutoplossing (PBS) bij 4 °C. Op dag 2 wordt PFA weggegooid en wordt het weefsel driemaal gewassen met PBS. Het weefsel wordt ingebed in hydrogel om zijn integriteit te behouden door incubatie in 4% hydrogel (acrylamide) oplossing in PBS (verdund van 30% ProtoGel) 's nachts bij 4 °C. Op dag 3 wordt de weefsel-hydrogeloplossing gedurende 1 uur bij 37 °C geïncubeerd om hydrogelpolymerisatie mogelijk te maken. Weefsel wordt vervolgens driemaal voorzichtig gewassen met PBS om overtollige hydrogel te verwijderen. De volgende stap van delipidatie (klaring) omvat weefselincubatie in natriumdodecylsulfaat (8% SDS in PBS) bij 37 °C gedurende 2 dagen (dag 4 en 5) op een shaker bij kamertemperatuur (RT). Op dag 6 wordt het geklaarde weefsel grondig gewassen met PBS om SDS te verwijderen. Weefsel kan worden immunogekleurd door incubatie in primaire antilichamen (verdund in 0,5% normaal ezelserum in PBS met 0,3% Triton X-100), 's nachts bij 4°C, en daaropvolgende incubatie in geschikte secundaire Alexa Fluor-antilichamen gedurende 1,5 uur bij RT, en nucleaire kleuring met DAPI (1: 10000). Het weefsel wordt overgebracht op een schoon glasplaatje en gemonteerd met behulp van VectaShield voor confocale beeldvorming.

Inleiding

CLARITY (Clear Lipid-exchanged Acrylamide-hybridized Rigid Imaging, compatible Tissue hYdrogel) is onlangs geëvolueerd als een waardevolle techniek waarbij acrylamide (hydrogel) inbedding en weefseldelipidatie betrokken zijn om de 3D-weefselstructuur te behouden voor immunokleuring (zonder sectie)1,2. Het in hydrogel ingebedde weefsel is optisch transparant en macromolecuuldoorlaatbaar, waarbij eiwitten en nucleïnezuren behouden blijven na verwijdering van lipiden door wasmiddel. CLARITY werd in 2013 door Science3 erkend als een van de tien opmerkelijke doorbraken. Hoewel de techniek in eerste instantie werd ontwikkeld om lipidenrijke hersenweefsels in beeld te brengen waar lipiden de lichtverstrooiing en beeldvormingskwaliteit beïnvloeden, wordt de techniek momenteel veel gebruikt voor het afbeelden van andere weefsels zoals darm, lever, nier en hart. De techniek biedt de mogelijkheid om een weefsel te kleuren en af te beelden door de noodzaak van doorsnede te elimineren, wat anders zou kunnen resulteren in een bevooroordeelde evaluatie van cel-celinteracties als gevolg van onregelmatige verdeling van celtypen. De techniek biedt ook de mogelijkheid om confocale z-stacks uit te voeren en een 3-dimensionaal beeld van het weefsel na te bootsen, wat kan helpen bij het realistischer bepalen van de dichtheden, microarchitectuur en cel-celinteractie tussen verschillende celtypen dan van een weefselsectie. Bovendien is de techniek aangepast om immunokleuring van dichte weefsels zoals bot mogelijk te maken, evenals in situ hybridisatiestudies. Het in hydrogel ingebedde 3D-weefsel biedt een aantrekkelijk platform voor het ophelderen van de interacties tussen epitheel-, enteroendocriene, glia- en neuronale cellen, die onlangs zijn aangehaald als cruciaal voor het begrip van de pathofysiologie van ziekten zoals de ziekte van Parkinson, de ziekte van Alzheimer, autismespectrumstoornissen enz.4.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Protocol

Alle beschreven dierproeven zijn goedgekeurd door de Emory University Committee on the Use and Care of Animals. C57BL/6-muizen (zowel mannetjes als vrouwtjes kunnen worden gebruikt) op de leeftijd van 8-12 weken kregen voorafgaand aan euthanasie vrije toegang tot het voedsel en water.

1. Verwijdering van de darm (dag 1)

  1. Euthanaseer de muis door middel van een kooldioxide-verstikkingsmethode, bij een debiet van 1,6 ml kooldioxidegas totdat het stoppen van de ademhaling gedurende 2 minuten wordt waargenomen).
  2. Plaats de muis in rugligging op een snijplank met de ledematen vastgemaakt. Steriliseer de buik met 70% ethanol. Knip met een tang de huid open met een schaar.
  3. Til de lever voorzichtig op en identificeer de maag. Houd vervolgens de maag vast met een tang en snijd de slokdarm net boven de maag af. Houd de maag vast met een tang, knip voorzichtig de mesenteria weg en maak de darm los van de buikholte tot aan het rectum. Snijd de losgeraakte darm bij het rectum af.
  4. Breng de losgeraakte darm over in een ijskoude PBS-oplossing in een petrischaaltje. Knip nu voorzichtig het mesenterium tussen de ileumsegmenten af en trek de darm recht zodat vanaf de maag alle mesenterieën worden afgeknipt, tot aan de dikke darm.
  5. Snijd 1-1,5 cm van het gewenste darmgebied voor CLARITY-kleuring in een nieuw petrischaaltje met ijskoude PBS.
  6. Gebruik een spuit van 5 ml die is bevestigd aan een stomp uiteinde van een naald van 20 G en spoel de fecale inhoud weg met ijskoude PBS.
    OPMERKING: Elk deel van de darm kan met dezelfde techniek worden gebruikt voor CLARITY-kleuring. Het darmsegment kan langs het mesenterium worden opengesneden of intact worden gebruikt voor de volgende stappen.

2. Fixatie van darmweefsel (dag 1)

  1. Fixeer het weefsel in 4% paraformaldehyde (PFA) -oplossing in PBS.
  2. Breng het stuk van 1-1,5 cm van het darmsegment van belang over in een conische buis van 15 ml gevuld met 4% PFA bij 4 °C 's nachts voor fixatie.

3. Hydrogel inbedding (dag 2)

  1. Breng het darmsegment over van 4% PFA-oplossing met een tang in een nieuwe conische buis van 15 ml met PBS-oplossing en was drie keer (elk 5 minuten, op een shaker bij 150-200 tpm) om eventuele resterende PFA te verwijderen.
  2. Bereiding van 4% hydrogel
    1. Gebruik de 30% geloplossing (ProtoGel) om de hydrogel te bereiden. Voor het bereiden van een 4% hydrogeloplossing verdunt u de 30% stockoplossing en verdunt u deze in PBS. Om 12 ml 4% hydrogel te bereiden, neemt u 1,6 ml 30% geloplossing en voegt u 10,4 ml PBS toe.
  3. Breng het gefixeerde weefsel uit stap 3.1 over. op de 4% hydrogeloplossing in PBS in een conische tube van 15 ml en een nacht bij 4 °C geïncubeerd.
    OPMERKING: Het wordt ten zeerste aanbevolen om het weefsel na een nacht incubatie vrij van PFA te wassen met behulp van PBS. Weefsel dat langer in PFA wordt bewaard, geeft geen goede resultaten bij volgende stappen en kleuring. Het gefixeerde weefsel na PBS-wasbeurten kan een week bij 4 °C worden bewaard.

4. Hydrogel polymerisatie en delipidatie (clearing) stap (dag 3)

  1. Haal de conische buis met het weefsel in hydrogeloplossing uit de oven van 4 °C. Breng over naar een waterbad van 37 °C en incubeer gedurende 1 uur. Deze stap maakt hydrogelpolymerisatie mogelijk.
  2. Verwijder na 1 uur de conische buis met het in hydrogel ingebedde weefsel van het waterbad en giet de acrylamideoplossing eraf. Spoel de tissue nu voorzichtig af met een enkele PBS-wasbeurt op kamertemperatuur om de overtollige hydrogel te verwijderen.
  3. Delipidatie stap
    1. Delipideer door het weefsel te incuberen in natriumdodecylsulfaat (8% SDS) in PBS. Breng het in de hydrogel ingebedde weefsel van stap 4.2 over naar een 8% SDS-oplossing in een conische buis van 50 ml. Zorg ervoor dat het weefsel volledig is ondergedompeld in de SDS-oplossing en dat de buis is afgedekt.
    2. Breng de afgetopte buis van 50 ml met het weefsel in SDS over op een shaker van 37 °C (200 tpm) bij kamertemperatuur gedurende 2 dagen (dag 4 en 5) om delipidatie mogelijk te maken.
      OPMERKING: Zorg ervoor dat de SDS-oplossing tot ten minste 20-25 ml in de conische buis van 50 ml is gevuld om eventuele verdamping te compenseren die kan optreden bij 37 °C tijdens de 2 dagen incubatie.
  4. Incubeer het weefsel op dag 4 en 5 in SDS bij een shaker van 37 °C (200 rpm) bij kamertemperatuur.

5. Afwassen van het wasmiddel van het opgeruimde doekje (dag 6)

  1. Neem het weefsel uit de SDS-oplossing. Het weefsel ziet er 'helder' of transparant uit.
  2. Breng het weefsel over in een nieuwe komische tube van 50 ml met PBS-oplossing en was in de loop van de dag op een shaker (150-200 tpm) bij kamertemperatuur met verschillende PBS-verversingen, om ervoor te zorgen dat alle sporen van SDS worden verwijderd. Ten minste 10 keer wisselen van de PBS-oplossing zorgt ervoor dat het weefsel vrij is van het SDS, en een goede vuistregel is om te controleren of de uiteindelijke PBS-wassing geen sporen van schuim/schuim van het SDS bevat. Dit is een cruciale stap, aangezien SDS de volgende kleuringsstappen kan verstoren.
    OPMERKING: Aan het einde van de dag is het geklaarde weefsel na meerdere wasbeurten in PBS nu klaar voor immunokleuring of misschien maximaal 3 weken bewaard bij 4 °C.
  3. Het langer dan een maand bewaren van geklaard darmweefsel in PBS-oplossing heeft invloed op de integriteit van het weefsel en de kwaliteit van de kleuring. Gebruik het geklaarde darmweefsel onmiddellijk of binnen 1-2 weken na het klaren voor het beste resultaat.

6. Immunofluorescerende kleuring voor neuronen, gliacellen en entero-endocriene cellen

  1. Breng het geklaarde weefsel over in een buisje van 1,5 of 2 ml en incubeer 's nachts bij 4 °C in een volume van 500 μl respectievelijke primaire antilichamen verdund in 0,5% normaal ezeltjesserum in PBS met 0,3% Triton X-100). De gebruikte antilichamen (Ab): Tuj1 of β-3-tubuline (Pan neuronale marker, 1: 1000), Glial Fibrillary Acid Protein (GFAP, 1: 500), Chromogranine A (1: 250).
  2. Onderwerp het weefsel na een nacht incubatie aan 3 PBS-wasbeurten (5 minuten elk met 1-1,5 ml PBS) om ongebonden primaire Ab te verwijderen.
  3. Breng het weefsel over naar een nieuwe buis en incubeer vervolgens met 500 μL geschikte secundaire Alexa Fluor Ab (AF) gedurende 1,5 uur bij kamertemperatuur in het donker. De secundaire Ab die wordt gebruikt zijn AF 488 voor Tuj1 (1:1000), AF-555 voor GFAP (1:500) en AF 555 (1:250) voor chromogranine A.
  4. Was het weefsel na de incubatie driemaal met PBS, zoals in stap 6.2.
  5. Voor het kleuren van de kernen incubeert u het weefsel in DAPI (1: 10000 verdunning of 0,2 μl in 2 ml PBS) gedurende 5 minuten bij kamertemperatuur.
  6. Breng ten slotte het bevlekte weefsel over op een schoon glasplaatje, leg er een dekglaasje op het weefsel en monteer het met 100 μL VectaShield voor confocale beeldvorming.
  7. Plaats de objectglaasjes 30 minuten in het donker bij kamertemperatuur in een objectglaasjeshouder om te drogen, waarna ze kunnen worden afgebeeld of bewaard bij -20 °C. De darmwand van de muis is vrij dun en eenmaal geopend langs het mesenterium, kan deze direct met dekglaasje op glazen dia's worden gemonteerd. Als u met grotere weefsels zoals milt, nieren, kamer(holte) dia's of afstandhouders werkt, kunt u deze gebruiken. Voor grotere weefsels kan bijvoorbeeld een caviteitsschuif worden gebruikt voor montage.
    OPMERKING: Opgemerkt moet worden dat als het darmsegment niet in de beginstap is opengesneden (zie Opmerking in stap 1), het raadzaam is om de darmbuis open te knippen met een microschaar die de stappen met het monteren vergemakkelijkt.

7. Confocale beeldvorming

OPMERKING: Het verwijderde, bevlekte en gemonteerde weefsel kan onmiddellijk worden afgebeeld of kan worden opgeslagen in glaasdozen bij -20°C.

  1. Afbeelding met een confocale microscoop (bijv. Olympus FV1000).
  2. Neem z-stacks over een dikte van 50 μm van het darmweefsel om de gebieden van het darmlumen naar de serosale laag te visualiseren.
  3. Sla de z stack-afbeeldingen op als afbeeldingsbestanden, .avi filmbestanden of converteer ze naar 3D-beeld met behulp van de software5.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Resultaten

De beelden van het CLARITY-gewiste darmweefsel van de muis worden weergegeven in figuur 1. Een succesvolle afronding van het protocol levert scherpe beelden van hoge kwaliteit op waarbij alle cellulaire details duidelijk kunnen worden gevisualiseerd. De DAPI-kleuring voor kernen is een zeer goede index om de kwaliteit van het CLARITY-protocol en de daaropvolgende immunokleuring te beoordelen, aangezien het de weefselintegriteit kan weergeven. Verder geeft de...

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Discussie

De CLARITY-methode is zeer nuttig voor het kleuren van de darm van muizen om verschillende celtypen, waaronder epitheel, neuronen en gliacellen, in 3D te visualiseren, met name het netwerk van neuronale projecties die zich uitstrekken over de darmwand naar het lumen5 en hun innervatie naar glia- en EEG-cellen. De hier gepresenteerde methode is aangepast volgens de oorspronkelijke studie van Yang et al. 20141.

De ...

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Openbaarmakingen

De auteurs hebben niets te onthullen.

Dankbetuigingen

De auteurs willen de steun erkennen van de American Gastroenterology Association (AGA) AGA-Rome Functional GI motility Disorders Pilot Research Award (naar BC), de Amerikaanse National Institutes of Health grant AI64462 (ASN) en de Emory University Integrated Cellular Imaging Microscopy Core.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel
NaamBedrijfCatalogusnummerOpmerkingen
4% paraformaldehyde (PFA)  in PBSThermoFischer ScientificJ19943Gebruikt voor weefselfixatie
4',6-Diamidino-2-Phenylindole, Dihydrochloride (DAPI)ThermoFischer ScientificD13061/10.000 verdunning
Alexa Fluor-488ThermoFischer ScientificA-110341/1000 verdunning
Alexa Fluor-555ThermoFischer ScientificA-214281/500 verdunning
Anti- GFAP (Glial Fibrillary Acid Protein)Abcamab72601/500 verdunning
Anti-beta III Tubulin (of Tuj1)Abcamab182071/1000 verdunning
Chromogranin AAbcamab151601/250 verdunning
ProtoGel  30%National DiagnosticsEC-890Toxisch, gevaarlijk, voorzichtig hanteren - maak 4% oplossing in PBS voor gebruik
NatriumdodecylsulfaatThermoFischer Scientific283648% in PBS
Vectashield montagemediumVector LaboratoriesH-1000

Referenties

  1. Yang, B., et al. Single-cell phenotyping within transparent intact tissue through whole-body clearing. Cell. 158, 945-958 (2014).
  2. Chung, K., et al. Structural and molecular interrogation of intact biological systems. Nature. 497, 332-337 (2013).
  3. 2013 Runners-Up. CLARITY makes it perfectly clear. Science. 342, 1434-1435 (2013).
  4. Fung, T. C. The microbiota-immune axis as a central mediator of gut-brain communication. Neurobiology of Disease. 136, 104714(2020).
  5. Chandrasekharan, B., et al. Interactions Between Commensal Bacteria and Enteric Neurons, via FPR1 Induction of ROS, Increase Gastrointestinal Motility in Mice. Gastroenterology. , (2019).
  6. Sylwestrak, E. L., Rajasethupathy, P., Wright, M. A., Jaffe, A., Deisseroth, K. Multiplexed Intact-Tissue Transcriptional Analysis at Cellular Resolution. Cell. 164, 792-804 (2016).
  7. Muntifering, M., et al. Clearing for Deep Tissue Imaging. Current Protocols in Cytometry. 86, 38(2018).
  8. Cronan, M. R., et al. CLARITY and PACT-based imaging of adult zebrafish and mouse for whole-animal analysis of infections. Disease Models & Mechanisms. 8, 1643-1650 (2015).
  9. Erturk, A., et al. Three-dimensional imaging of solvent-cleared organs using 3DISCO. Nature Protocols. 7, 1983-1995 (2012).
  10. Qi, Y., et al. FDISCO: Advanced solvent-based clearing method for imaging whole organs. Science Advances. 5, 8355(2019).
  11. Milgroom, A., Ralston, E. Clearing skeletal muscle with CLARITY for light microscopy imaging. Cell Biology International. 40, 478-483 (2016).
  12. Hu, W., Tamadon, A., Hsueh, A. J. W., Feng, Y. Three-dimensional Reconstruction of the Vascular Architecture of the Passive CLARITY-cleared Mouse Ovary. Journal of Visualized Experiments. , (2017).
  13. Chen, Y., et al. Three-dimensional imaging and quantitative analysis in CLARITY processed breast cancer tissues. Scientific Reports. 9, 5624(2019).

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Herprints en machtigingen

Toestemming aanvragen om de tekst of afbeeldingen van dit JoVE-artikel te hergebruiken

Toestemming aanvragen

Trefwoorden

CLARITY imagingimaging van de darmacrylamide inbeddingdelipidatie van weefsels3D weefselstructuurimmunokleuringmuizendarmconfocale imagingentero endocriene cellenneuronale projecties
Video binnenkort beschikbaar

Gerelateerde artikelen