Een abonnement op JoVE is vereist om deze inhoud te bekijken. Log in of start vandaag met uw gratis proefperiode.

Methodenartikel

Onderzoek naar geactiveerde olfactorische sensorische neuronen van muizen via gecombineerde immunokleuring en in situ hybridisatie

989 weergaven

⸱

DOI:

10.3791/62150

⸱

11 april 2021

 ,  , 
1Department of Genetics, Evolution, Microbiology and Immunology, Institute of Biology, University of Campinas, 2Graduate Program in Genetics and Molecular Biology, Institute of Biology, University of Campinas

In dit artikel

Samenvatting

Dit protocol combineert in situ hybridisatie met immunofluorescentie om olfactorische en vomeronasale receptorgenen te identificeren die tot expressie komen in olfactorische sensorische neuronen na activering door chemische stimuli in de muis.

Samenvatting

Dieren vertrouwen op chemische communicatie om relevante milieu-informatie over te brengen en waar te nemen, variërend van beoordeling van de voedselkwaliteit tot het detecteren van beschikbare paringspartners of bedreigingen. Bij muizen wordt deze taak voornamelijk uitgevoerd door het olfactorische systeem en de onderliggende subsystemen, inclusief de hoofd- en accessoire olfactorische systemen. Beide hebben perifere organen die worden bevolkt door sensorische neuronen die G-proteïne-gekoppelde receptoren tot expressie brengen die in staat zijn om chemische signalen te binden die de neusholte bereiken. Hoewel de moleculaire kenmerken van deze receptoren goed worden begrepen, is er weinig bekend over hun verwante specifieke liganden. De hier beschreven methode combineert in situ hybridisatiedetectie van olfactorische of vomeronasale receptoren met immunodetectie van gefosforyleerd ribosomaal eiwit S6 (pS6) - een marker van neuronale activering. Dit protocol is opgesteld om neuronen te identificeren die worden geactiveerd na een enkele gebeurtenis van blootstelling aan gezuiverde of complexe chemische stimuli die door de reukorganen worden gedetecteerd. Belangrijk is dat deze techniek het mogelijk maakt om neuronen te onderzoeken die worden geactiveerd in biologisch relevante contexten. Idealiter zou deze methode moeten worden gebruikt om de moleculaire biologie van het reuksysteem te onderzoeken en om olfactorisch gedrag te bestuderen.

Inleiding

Chemosignalering is de meest voorkomende vorm van communicatie bij dieren. Bij zoogdieren wordt de detectie van chemische signalen voornamelijk gemedieerd door reukzin en is van het grootste belang voor het vinden van voedsel, het lokaliseren van mogelijke paringspartners en het vermijden van potentiële roofdieren 1,2,3. Het reuksysteem van de muis is verder onderverdeeld in verschillende subsystemen, elk met hun eigen anatomische, fysiologische en moleculaire eigenschappen4. Hiervan zijn het belangrijkste olfactorische systeem (MOS) en het accessoire olfactorische systeem (AOS) het meest bestudeerd en beter gekarakteriseerd.

De MOS is grotendeels verantwoordelijk voor de detectie van vluchtige chemische moleculen die de neusholte bereiken. Dit wordt bereikt door olfactorische sensorische neuronen (OSN's), die de sensorische interface van het systeem bevolken - het belangrijkste olfactorische epitheel (MOE). Elke OSN brengt één op de duizenden olfactorische receptoren (OR's) op een monogene en monoallelische manier tot expressie5. Bovendien hebben OR's de neiging om breed afgestemd te zijn6, en een enkele geurstof kan zich binden aan meer dan één OR, waardoor een combinatorische code voor geuren wordt gegenereerd7.

De AOS is op zijn beurt voornamelijk verantwoordelijk voor de detectie van feromoon en kairomonen. Deze liganden activeren vomeronasale sensorische neuro's (VSN's) in het vomeronasale orgaan (VNO). VSN's in de apicale zone van de VNO brengen receptoren van de vomeronasale receptor 1-familie (V1Rs)8 tot expressie, terwijl neuronen in de basale zone de vomeronasale receptor 2-familie (V2Rs)9 tot expressie brengen. Belangrijk is dat is aangetoond dat sommige VSN's meer dan één vomeronasale receptor tot co-expressie brengen 10,11,12.

Ondanks alle beschikbare informatie over de moleculaire eigenschappen van OR's en VR's, is de kennis over hun verwante liganden nog steeds zeer beperkt. De identificatie van specifieke olfactorische neuronen die verantwoordelijk zijn voor de detectie van een molecuul of complexe stimulus is een belangrijke taak voor diegenen die reukzin, olfactorisch gedrag en fysiologische reacties onderzoeken. Er zijn verschillende strategieën geprobeerd om olfactorische receptoren te deorfaniseren, waaronder calciumbeeldvorming7, eencellige RNA-sequencing13,14, heterologe receptorexpressie15 en strategieën op basis van onmiddellijke vroege genen (IEG's)16. Meer recentelijk zijn enkele technieken gebruikt om de modulerende effecten van geurstoffen in sensorische neuronen te beoordelen, met behulp van in vivo calciumbeeldvorming17,18 en fluorescerend-eiwit gelabelde single-cell RNA-sequencingstrategieën19. De meeste van deze technieken vereisen een kunstmatige opstelling of worden uitgevoerd op gedissocieerde neuronen, waardoor het onmogelijk is om tegelijkertijd het gedrag te beoordelen dat wordt veroorzaakt door de gebruikte geuren.

Het hier beschreven protocol maakt de identificatie mogelijk van sensorische neuronen die worden geactiveerd na een enkele gebeurtenis van blootstelling aan geur, door riboprobes die specifieke OR's of VR's detecteren te combineren met de immunodetectie van gefosforyleerd S6-ribosomaal eiwit (pS6), een proxy voor neuronale activering. Deze methode is een betrouwbare manier om de identiteit te onderzoeken van sensorische neuronen die worden geactiveerd door verschillende chemosignalen in een biologisch relevante context.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Protocol

Dierproeven werden uitgevoerd in overeenstemming met Animal Protocol #1883-1, goedgekeurd door de Universiteit van Campinas (Institute of Biology's Institutional Animal Care and Use Committee - Committee for Ethics in Animal Use in Research), dat de richtlijnen volgt die zijn opgesteld door de federale Nationale Raad voor de Controle op Dierproeven (CONCEA).

1. Materiële voorbereiding

  1. Bereid 1 L 3% H2O2 (v/v) in 1x PBS. Verdun 100 ml 10× PBS en 100 ml 30% H2O2 in 500 ml ultrapuur water. Vul het volume aan met ultrapuur water. Bereid deze oplossing direct voor gebruik.
  2. Bereid een bevochtigde kamer voor met stukjes pluisvrije laboratoriumdoekjes die nat zijn gemaakt met 5× SSC-oplossing.
  3. Bereid hybridisatie-wasoplossingen: 5× SSC (bij 55 °C), 2× SSC (55 °C), 0,2× SSC (55 °C) en 0,1× SSC (55 °C en kamertemperatuur). Los de juiste hoeveelheden 20× SSC-stockoplossing op in RNasevrij ultrapuur water. Bereid de verdunde oplossingen vers voor het begin van elk experiment.
  4. Bereid immunohistochemie blokkerende oplossing voor: 1× PBS/1% BSA/0,1% Triton X-100. Verdun voor 100 ml 10 ml 10× PBS, 10 ml 10% BSA en 3,33 ml 3% Triton X-100 in 70 ml ultrapuur water. Vul het volume aan met ultrapuur water. Bereid de verdunde oplossingen vers voor het begin van elk experiment.
  5. Bereid PTw-oplossing voor: 1× PBS/0.1% Tween-20. Verdun voor 100 ml 1 ml 10% Tween-20 en 10 ml 10× PBS in 70 ml ultrapuur water. Vul het volume aan met ultrapuur water. Bereid deze oplossing vers voor het begin van elk experiment.
  6. Bereid RNase-vrije 0,1 M triethanolamine-oplossing. Verdun voor 250 ml 3,33 ml triethanolamine van reagenskwaliteit in 200 ml RNasevrij ultrapuur water onder roeren (gebruik RNasevrij glaswerk en magnetische roerder bij het bereiden van deze oplossing). Stel de pH in op 8,0 met HCl. Vul het volume aan met RNase-vrij ultrapuur water en bewaar beschermd tegen licht tot gebruik. Bereid deze oplossing vers voor het begin van elk experiment.
  7. Bereid RNase-vrije 0,1% H2O2 (v/v) in 1× PBS. Verdun voor 1 l 100 ml 10× PBS en 3,3 ml 30% H2O2 in 500 ml RNasevrij ultrapuur water. Vul het volume aan met RNase-vrij ultrapuur water. Bereid deze oplossing direct voor gebruik.
  8. Bereid RNasevrije oplossingen van het volgende: 0,2 M HCl; 1 m Tris-HCl pH 8,0; 10 mg/ml gist tRNA; 10% SDS; 10× PBS; 100× de oplossing van Denhardt; 20× SSC; 50% dextraansulfaat; 6 M HCl
  9. Bereid RNase-vrije 4% paraformaldehyde fixerende oplossing. Los voor 100 ml 4 g paraformaldehyde op in 80 ml 1× PBS. Stel de pH in op 7,4 met 10 M NaOH. Voltooi het volume met 1× PBS. Deze oplossing moet vers worden bereid vóór het begin van elk experiment.
    Voorzichtigheid: Paraformaldehyde is een gevaarlijke stof die bij inademing schadelijk kan zijn. Bereid de oplossing onder een zuurkast en draag beschermende handschoenen, een masker en een veiligheidsbril.
  10. Bereid RNase-vrije dissectieoplossing: 30% sucrose/0,45 M EDTA pH 8,0/1× PBS. Los voor 100 ml 30 g sucrose op in 60 ml RNasevrije 0,5 M EDTA pH 8,0. Voeg 10 ml 10× PBS toe. Vul het volume aan met RNase-vrije 0,5 M EDTA pH 8,0.
  11. Bereid RNasevrije glazen of plastic maatcilinders en bekers voor.
  12. Bereid RNase-vrije pre-hybridisatie- en hybridisatieoplossingen: 50% gedeïoniseerde formamide (v/v)/600 mM NaCl/200 μg/ml gist tRNA/0,25% SDS (w/v)/10 mM Tris-HCl pH 8,0/1× Denhardt's oplossing/1 mM EDTA pH 8,0/10% dextraansulfaat (w/v). Voeg voor 10 ml in een gegradueerde cilinder 5 ml gedeïoniseerde formamide, 1,2 ml 5 M NaCl, 200 μl 10 mg/ml gisttRNA, 250 μl 10% SDS, 100 μl 1 M Tris-HCl pH 8,0, 200 μl 50× Denhardt's oplossing, 20 μl 500 mM EDTA pH 8,0 en 2 ml 50% dextraansulfaat (M.W. 500.000) toe. Vul het volume aan met RNase-vrij ultrapuur water. Bereid deze oplossing vers voor het begin van elk experiment.
    OPMERKING: Dextraansulfaat is zeer stroperig. Het is raadzaam om 20% van het totale volume aan hybridisatie-/prehybridisatieoplossingen extra voor te bereiden om rekening te houden met pipetteerfouten. Gist-tRNA kan desgewenst worden weggelaten uit de pre-hybridisatieoplossing.
  13. Bereid thermoplastische dekglaasjes van laboratoriumfolie voor. Snijd rechthoekige stukjes thermoplastische laboratoriumfilm die 1-2 mm korter zijn dan de lengte en breedte van een microscoopglaasje.
  14. Bereid TN-buffer voor: 100 mM Tris-HCl/150 mM NaCl. Verdun voor 100 ml 10 ml 1 M Tris-HCl pH 7,5 en 3 ml 5 M NaCl in 70 ml ultrapuur water. Vul het volume aan met ultrapuur water. Bereid deze oplossing vers voor het begin van elk experiment.
  15. Bereid de TNB-blokkeerbuffer voor: 0,5% blokkerend reagens A (w/v) in TN-buffer. Los voor 200 ml 1 g blokkerend reagens A op in 200 ml TN-buffer (zie materiaaltabel voor de commerciële bron van blokkerend reagens A).
  16. Bereid TNT-buffer voor: 0,05% Tween-20 in TN-buffer. Verdun voor 1 L 5 ml 10% Tween-20 in 950 ml TN-buffer. Vul het volume langzaam aan met TN-buffer om schuimvorming te voorkomen. Bereid deze oplossing vers voor het begin van elk experiment.
  17. Bereid Tyramide-Alexa 488 werkoplossing voor: 1× versterkingsbuffer A/0.0015% H2O2/1:100 tyramide-Alexa 488. Verdun voor 100 μl 1 μl 0,15% H2O2 en 1 μl tyramide-Alexa 488 in 98 μl amplificatiebuffer A (zie materiaaltabel voor commerciële bronnen van tyramide-Alexa 488 en versterkingsbuffer A). Bereid deze oplossing direct voor gebruik.
  18. Bereid Tyramide-Alexa 555 werkoplossing voor: 1× versterkingsbuffer A/0,0015% H2O2/1:100 tyramide-Alexa 555. Verdun voor 100 μl 1 μl 0,15% H2O2 en 1 μl tyramide-Alexa 555 in 98 μl amplificatiebuffer A (zie materiaaltabel voor commerciële bronnen van tyramide-Alexa 555 en amplificatiebuffer A). Bereid deze oplossing direct voor gebruik.
  19. Bereid Tyramide-biotine werkoplossing: 1× amplificatiebuffer B/0,0015% H2O2/1:50 tyramide-biotine. Verdun voor 100 μl 1 μl 0,15% H2O2 en 2 μl tyramide-biotine in 97 μl amplificatiebuffer B (zie Tabel met materialen voor commerciële bronnen van tyramide-biotine en amplificatiebuffer B). Bereid deze oplossing direct voor gebruik.
  20. Bak het glaswerk minstens 4 uur op 200 °C. Behandel niet-wegwerpbaar plastic vaatwerk (inclusief glaasrekken, Coplin-potten en spuiten) met 3% H2O2 gedurende 15-30 minuten, gevolgd door grondig wassen onder RNase-vrij water. Behandel roestvrijstalen metalen instrumenten, zoals dissectiegereedschappen, pincetten en cryostaathouders, met 3% H2O2 gedurende 15 minuten, gevolgd door grondig wassen onder RNasevrij water. Reinig de werkbankoppervlakken, de verwarmde plaat en de droge blokken met RNase-reinigingsoplossing.

2. Synthese van riboprobe

OPMERKING: De volgende procedure voor het synthetiseren van 1 kb digoxigenine-gelabelde cRNA-sondes voor in situ hybridisatie via in vitro transcriptie is gebaseerd op eerder gepubliceerde protocollen 20,21,22,23.

  1. Gebruik geschikte oligonucleotide-primerparen om een DNA-fragment van 1 kb van het betreffende gen (bijv. olfactorischorisch) te amplificeren Selecteer primerparen die een gebied versterken dat aanwezig is in het volwassen mRNA dat moet worden gedetecteerd (bijvoorbeeld de coderende sequentie van het gen). Een selectie van primers voor verschillende olfactorische receptoren wordt gegeven in de Materiaaltabel. Voor meer informatie over sondes om andere vomeronasale olfactorische receptoren te detecteren, zie eerdere publicaties16,21.
  2. Laat de PCR-producten draaien op een 0,8% agarosegel en verwijder de gewenste band van 1 kb.
  3. Zuiver het DNA-fragment met behulp van een geschikte gelzuiveringskit op basis van minikolommen volgens het protocol van de fabrikant.
  4. Kwantificeer het gezuiverde DNA-fragment en kloon het tot een geschikte PCR-kloonvector volgens het protocol van de fabrikant. Het is raadzaam om kloonvectoren te gebruiken die T7- en SP6-RNA-polymerasepromotors bevatten die het gekloonde amplicon flankeren.
  5. Transformeer het recombinante plasmide in competente recombinatievrije bacteriën via chemische transformatie of elektroporatie volgens het protocol van de fabrikant.
  6. Zaad geïsoleerde transformerende bacteriekolonies in een rijk medium en isoleer het plasmide via DNA-minipreparaat volgens het protocol van de fabrikant.
  7. Voer een restrictiedigestieanalyse uit met geschikte restrictie-enzymen en/of Sanger-sequencing om de identiteit en oriëntatie van het ingebrachte DNA-fragment te controleren volgens het protocol van de fabrikant.
  8. Voer restrictiedigestie uit om 10 μg van het plasmide te lineariseren met behulp van een geschikt restrictie-enzym. Om een anti-sense riboprobe te produceren na in vitro transcriptie, gebruikt u een restrictie-enzym dat het plasmide-DNA verteert aan het uiteinde van de insert, tegenover de RNA-polymerasepromotor die zich stroomafwaarts van de coderende sequentie van het gen bevindt. Om sense-riboprobes te produceren na in vitro transcriptie, gebruikt u een restrictie-enzym dat het plasmide-DNA verteert aan het uiteinde van de insert, tegenover de RNA-polymerasepromotor die zich stroomopwaarts van de coderende sequentie van het gen bevindt.
  9. Voer een aliquoot van het plasmide-linearisatiereactieproduct uit op een 0,8% agarosegel om de volledigheid van de spijsvertering te bevestigen. Zodra de volledige linearisatie is bevestigd, zuivert u de rest van de reactie met behulp van een op kolommen gebaseerde PCR-opruimkit volgens het protocol van de fabrikant.
  10. Synthese van digoxigenine-gelabelde cRNA-sondes door in vitro transcriptie met behulp van 1-2 μg van het gelineariseerde plasmide als sjabloon, het juiste enzym (bijv. T7 of SP6 RNA-polymerase) en een geschikte digoxigenine (DIG) labelkit.
  11. Verwijder het DNA-sjabloon uit de reactie door gedurende 30 minuten te verteren met DNase I bij 37 °C.
  12. Zuiver de cRNA-sondes met behulp van een RNA-zuiveringskit op basis van een minikolom of een zuiveringskit op basis van gelfiltratie. Elueer de resulterende sonde in 50 μL RNase-vrij water.
  13. Kwantificeer de resulterende ribosonde, bij voorkeur met behulp van fluorometrische methoden. Meestal ligt de verwachte opbrengst boven de 100 ng/μL.
  14. Laat de riboprobe draaien op een geautomatiseerd elektroforesesysteem of op een RNase-vrije 0,8% agarosegel om de kwaliteit en degradatie van de sonde te controleren.
  15. Bewaar de gesynthetiseerde sonde bij -80 °C totdat u deze nodig heeft.

3. Blootstelling van muizen aan olfactorische stimuli

  1. Huisvesting van elk dier afzonderlijk in een schone kooi gedurende ten minste 24 uur voorafgaand aan blootstelling. Verwijder het voedselrooster minstens 2 uur voor blootstelling. Alle dieren die in dit onderzoek werden gebruikt, waren 8-12 weken oude mannelijke C57BL/6-muizen (gemiddeld gewicht: 20 g).
  2. Bereid de juiste olfactorische stimulus voor. Verschillende stimuli kunnen worden gebruikt om reukneuronen in het MOE (belangrijkste reukepitheel) of VNO (vomeronasale orgaan) te activeren. Voor een uitgebreide lijst van olfactorische stimuli, zie andere publicaties3, 16, 22,23,24. Vloeibare stimuli, zoals chemische oplossingen, urine of recombinante eiwitoplossing, kunnen op een medisch gaasje of watje worden afgezet.
  3. Breng de reukprikkel in de kooi en laat het dier 1 uur ongemoeid.
  4. Euthanaseer de proefpersoon van de muis en ontleed snel de MOE of VNO met behulp van RNase-vrije ontleedhulpmiddelen.

4. Weefseldissectie en bevriezing

  1. Ontleed de MOE of VNO onder een stereomicroscoop met behulp van dissectieoplossing.
    1. Verwijder voor het VNO de dikke septumbeenderen, zodat de zachtere kraakbeenschelpen rond het orgaan overblijven.
  2. Bereid het monster voor op cryo-sectie.
    1. Dep het monster droog op een stuk vloeipapier en plaats het in een histologische plastic mal met inbeddingsmedium.
    2. Voor VNO plaatst u elk orgaan verticaal en trekt u het met behulp van een spuit van 1 ml naar de bodem van de plastic mal (Figuur 1A).
    3. Voor MOE plaatst u deze op de bodem van de plastic mal met de cribriforme plaat naar beneden gericht.
    4. Verwijder het teveel aan luchtbellen rond het preparaat, omdat deze de doorsnede kunnen verstoren.
    5. Vries exemplaren in op droogijs.
    6. Bewaar het preparaatblok bij -80 °C.
      OPMERKING: Bevroren exemplaren kunnen enkele maanden worden bewaard voordat ze worden doorgesneden.
  3. Voer cryo-secties uit.
    1. Zet de cryostaat aan en stel de temperatuur minimaal 4 uur voor gebruik in op -23 °C.
    2. Haal het bevroren blok uit de histologische plastic mal en snijd het bij met een scheermesje.
    3. Laat 5 mm rond het sample, omdat dit het hanteren van secties vergemakkelijkt (Figuur 1B).
    4. Gebruik inbeddingsmedium om het blok aan de monsterhouder van de cryostaat te bevestigen.
    5. Verzamel 16 μm secties op positief geladen microscoopglaasjes.
    6. Bewaar de glaasjes bij -80 °C.
      OPMERKING: Dia's kunnen enkele maanden bij -80 °C worden bewaard voordat ze in situ worden gehybridiseerd.

5. Stapsgewijs in situ hybridisatieprotocol

  1. Droog de dia's 10 minuten met een föhn. Gebruik de warme straal om de glaasjes te ontdooien en schakel vervolgens over op een straal op kamertemperatuur totdat het inbeddingsmedium ondoorzichtig is.
  2. Voeg 500 μL RNasevrije 4% paraformaldehydefixeeroplossing per objectglaasje toe en incubeer gedurende 15 minuten bij 23-26 °C om de histologische coupes te fixeren.
  3. Was de objectglaasjes twee keer in RNase-vrije 1× PBS gedurende 5 minuten elk.
  4. Voeg 500 μL RNase-vrije 0,2 M HCl per objectglaasje toe en incubeer bij 23-26 °C gedurende 10 min.
  5. Was de objectglaasjes twee keer in RNase-vrije 1× PBS gedurende 5 minuten elk.
  6. Voeg 500 μL RNase-vrije 0,1% H2O2/1× PBS per objectglaasje toe en incubeer gedurende 30 minuten bij 23-26 °C. Voer deze stap in het donker uit om door licht veroorzaakte afbraak van waterstofperoxide te voorkomen.
  7. Was de dia's twee keer in RNase-vrije 1× PBS gedurende 5 minuten elk.
  8. Voer acetylering uit door objectglaasjes over te brengen naar een pot met 250 ml RNase-vrije triethanolamine 0,1 M pH 8,0 en een magnetische roerstaaf, in een zuurkast. Voeg onder voortdurend roeren 625 μL azijnzuuranhydride toe. Verlaag de roersnelheid, voeg druppel voor druppel nog eens 625 μL toe aan de glaasjes, schakel het roeren uit en incubeer gedurende 10 minuten.
  9. Was de dia's twee keer in RNase-vrije 1× PBS gedurende 5 minuten elk.
  10. Was de dia's eenmaal in RNase-vrije 1× PBS bij 60 °C gedurende 5 min.
  11. Voer pre-hybridisatie uit door de objectglaasjes één voor één van 1× PBS te verwijderen en ze allemaal droog te deppen met pluisvrij laboratoriumtissuepapier. Pipetteer 400 μL pre-hybridisatieoplossing op elk objectglaasje en plaats het in een bevochtigde kamer die is voorverwarmd tot 60 °C in een waterbad of verwarmde oven. Incubeer gedurende 1 uur bij 60 °C.
  12. Verwarm voldoende hybridisatieoplossing tot 60 °C, aliquoot 200 μL per glaasje in microfugebuisjes en verwarm ze tot 85 °C gedurende 10 minuten.
  13. Voeg de juiste cRNA-sonde(s) toe aan de buisjes van de hybridisatieoplossing (1 μg/ml per sonde) en denatureer gedurende 5 minuten bij 85 °C.
  14. Voor hybridisatie neemt u één dia per keer uit de bevochtigde kamer, dept u deze droog en plaatst u deze op een verwarmde plaat van 60 °C. Voeg 200 μL ribosonbe-bevattende hybridisatieoplossing toe en bedek het glaasje met een glazen dekglaasje. Incubeer gedurende 12-16 uur in de bevochtigde kamer bij 60 °C.
    OPMERKING: Laat dia's niet afkoelen na pre-hybridisatie. De hybridisatietemperatuur moet voor elke sonde empirisch worden bepaald. Zestig graden Celsius wordt als uitgangspunt voorgesteld, omdat het over het algemeen goed werkt voor sondes van 1 kb.
  15. Verwarm SSC-wasoplossingen tot 55 °C in aparte potten en plaats ze in een waterbad op de juiste temperatuur.
  16. Nadat de hybridisatie is voltooid, verwijdert u het dekglaasje van elk glaasje met een bad met 5× SSC-oplossing bij 55 °C. Houd elke dia horizontaal in de warme SSC-oplossing. Wanneer het dekglaasje is losgeraakt, kantelt u de schuif en laat u het dekglaasje naar de bodem vallen.
  17. Wassen met 2× SSC op 55 °C gedurende 30 minuten in een schuifpot.
  18. Was met 0,2× SSC op 55 °C gedurende 20 minuten in een glacanzo.
  19. Wassen met 0,1× SSC op 55 °C gedurende 20 minuten in een glaasje.
  20. Breng over naar 0,1× SSC bij 23-26 °C en incubeer gedurende 3 minuten in een glaaspot.
  21. Was in PTw gedurende 10 minuten in een glaaspot.
  22. Was twee keer in TN Buffer, elk gedurende 5 minuten, in een glaaspot.
  23. Pipetteer 600 μL TNB-blokkeerbuffer op elk objectglaasje en incubeer gedurende 3 uur bij 23-26 °C.
  24. Piket 500 μl primaire antilichaamoplossing (peroxidase-geconjugeerd anti-DIG-antilichaam verdund 1:400 in TNB-oplossing) op elk objectglaasje. Leg voorzichtig een stuk thermoplastische laboratoriumfilm op elk objectglaasje en incubeer gedurende 12-16 uur bij 4 °C.
  25. Was de dia's 6 keer met TNT Buffer gedurende 5 minuten elk, onder mild roeren in een glaasje.
  26. Pineer 100 μL tyramide-biotine werkoplossing op elk objectglaasje. Dek af met dekglaasjes van thermoplastische laboratoriumfolie en incubeer gedurende 12 minuten bij 23-26 °C.
    OPMERKING: Voer deze incubatiestap gespreid uit, met 2 of 3 dia's per batch, om een goede controle over de incubatietijden mogelijk te maken. De duur van de tyramide-incubatie moet mogelijk worden geoptimaliseerd, afhankelijk van de gevoeligheid en concentratie van de cRNA-sonde.
  27. Was de dia's 6 keer met TNT Buffer gedurende 5 minuten elk, onder mild roeren in een glaasje.
  28. Pipetteer 200 μl oplossing met peroxidase-geconjugeerd streptavidine (SA-HRP, verdund 1:100 in TNB-buffer) op elk objectglaasje en dek af met een dekglaasje van thermoplastische laboratoriumfolie. Incubeer gedurende 1 uur bij 23-26 °C.
  29. Was de dia's 6 keer met TNT Buffer gedurende 5 minuten elk, onder mild roeren in een glaasje.
  30. Pipetteer 100 μL tyramide-Alexa 488 werkoplossing op elk objectglaasje, dek af met een dekglaasje van thermoplastische laboratoriumfolie en incubeer bij 23-26 °C gedurende 12 minuten in het donker.
  31. Was de dia's 6 keer met TNT Buffer gedurende 5 minuten elk, onder mild roeren in een glaasje.
  32. Incubeer in 3% H2O2/1× PBS in een glaaspot gedurende 1 uur om peroxidasen uit de vorige stappen te inactiveren.
  33. Was de dia's 6 keer met TNT Buffer gedurende 5 minuten elk, onder mild roeren in een glaasje.

6. pS6 immunokleuring

  1. Pipetteer 500 μl 4% paraformaldehyde/1× PBS-oplossing op elk objectglaasje en incubeer gedurende 15 minuten bij 23-26 °C om secties te fixeren.
  2. Pipetteer 500 μL 1× PBS/0,1% Triton X-100 op elk objectglaasje en incubeer gedurende 5 minuten om secties te permeeren.
  3. Was twee keer met 1× PBS in een glaasje.
  4. Pipetteer 2-3 druppels per sectie in de handel verkrijgbare tyramidesignaalversterking die oplossing B blokkeert (materiaaltabel) en incubeer gedurende 1 uur bij 23-26 °C.
  5. Pipetteer 400 μl immunohistochemische blokkeringsoplossing op elk objectglaasje en incubeer bij 23-26 °C gedurende 30 minuten om secties te blokkeren.
  6. Pipetteer 200 μl konijn anti-pS6 primaire antilichaamoplossing (verdund 1:200 in immunohistochemie blokkerende oplossing; eindconcentratie: 1 μg/ml) op elk objectglaasje, dek af met thermoplastisch laboratoriumfolie en incubeer bij 4 °C gedurende 12-16 uur.
  7. Was 3 keer met 1× PBS/0,1% Triton X-100, elk 5 minuten in een glaasje.
  8. Pineer 2-3 druppels per glaasje in de handel verkrijgbare peroxidase-geconjugeerde anti-konijn secundaire antilichaamoplossing (Materiaaltabel) en incubeer bij 23-26 °C gedurende 1,5 uur.
  9. Was 3 keer met 1× PBS/0,1% Triton X-100, elk 5 minuten in een glaasje.
  10. Dep de glaasjes droog en pipetteer 100 tot 200 μL tyramide-Alexa 555 werkoplossing op elk glaasje, bedek met een stuk thermoplastische laboratoriumfilm en incubeer gedurende 7 minuten in het donker.
  11. Was twee keer met 1× PBS gedurende 5 minuten elk in een glacanzoal.
  12. Pipetteer 500 μl verdunde nucleaire kleurstof (in 1× PBS) op elk objectglaasje en incubeer gedurende 30 minuten bij 23-26 °C.
  13. Was twee keer met 1× PBS op 23-26 °C gedurende 5 minuten in een glaasje.
  14. Monteer dia's met anti-fading montagemedium en laat het montagemedium 24 uur uitharden in het donker.
  15. Bewaar objectglaasjes op de juiste temperatuur tot ze op de beeldvorming zijn, om fluorescentievervaging te voorkomen.

7. Microscopie beeldvorming

  1. Afbeelding dia's met behulp van een epifluorescentie- of confocale microscoop die is uitgerust met de juiste filters voor de gebruikte fluoroforen.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Resultaten

Het huidige protocol is gericht op het verkrijgen van microscopiebeelden waarin het gen van de onderzoeker en de neuronale activiteitsmarker pS6 fluorescerend zijn gelabeld. De beschreven methode omvat Tyramide Signal Amplification, die duidelijke en sterke labeling produceert met weinig tot geen achtergrond. pS6-immunokleuring verschijnt als een cytoplasmatisch fluorescerend signaal dat gewoonlijk het hele neuronale cellichaam vult, terwijl in situ hybridisatiesignaal voor olfa...

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Discussie

Het hier beschreven protocol identificeert op betrouwbare wijze sensorische neuronen die worden geactiveerd door chemische signalen in het reuksysteem door een combinatie van in situ detectie van OK- of VR-receptoren met immunodetectie van pS6, een indirecte marker van neuronale activiteit. De onderzoeker moet extra voorzichtig zijn om de integriteit van de histologie te behouden en alle stappen vóór hybridisatie onder RNase-vrije omstandigheden uit te voeren. Als u dit niet doe...

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Openbaarmakingen

De auteurs verklaren dat ze geen enkele concurrerende belangen hebben.

Dankbetuigingen

We danken GAG Pereira en JA Yunes voor hun middelen, APF Ferreira en WO Bragança voor administratieve en technische hulp, en het personeel van de Life Sciences Core Facility (LaCTAD-UNICAMP) voor hun hulp bij confocale microscopie. Dit werk werd ondersteund door de Sao Paulo Research Foundation (FAPESP; subsidienummers 2009/00473-0 en 2015/50371-0 aan F.P.), door PRP/UNICAMP (subsidienummers 2969/16, 725/15, 348/14 en 315/12 aan F.P.), door FAPESP-beurzen aan V.M.A.C. (2014/25594-3, 2012/21786-0, 2012/01689-0), T.S.N. (2012/04026-1), en door Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior (CAPES) fellowship aan T.S.N.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel
NaamBedrijfCatalogusnummerOpmerkingen
10x phosphate-buffered saline (PBS)Thermo Fisher ScientificAM9625n/a
20x amplification diluent (reaction buffer from Alexa Fluor 555 Tyramide SuperBoost kit)Thermo Fisher ScientificB40923 or B40922verwezen naar als Amplification Buffer A in werkoplossingen voor tyramide-Alexa 488 of tyramide-Alexa 555 signaalversterking
20x SSCMerck (Calbiochem)8310-OPn/a
30% Bovine Serum Albumin (BSA)Merck (Sigma-Aldrich)A9576n/a
30% hydrogen peroxyde (H2O2)Merck (Sigma-Aldrich)H1009n/a
Acetic anhydrideMerck (Sigma-Aldrich)320102n/a
AgaroseMerck (Sigma-Aldrich)A9539n/a
Amplification diluent (from TSA Biotin kit)Akoya Biosciences (Perkin Elmer)SAT700001EAverwezen naar als Amplification Buffer B in werkoplossing voor tyramide-biotine signaalversterking
Anti-pS6 (Ser 244/247) rabbit polyclonal antibodyThermo Fisher ScientificCat# 44-923G, RRID:AB_2533798n/a
Blocking buffer 1x (from Alexa Fluor 488 Tyramide SuperBoost kit)Thermo Fisher ScientificB40923 or B40922verwezen naar als blocking oplossing B in de tyramide signaal ontwikkelingsstap
Blocking reagent (from TSA Biotin kit)Akoya Biosciences (Perkin Elmer)SAT700001EAverwezen naar als blocking reagens A in de formulering voor TNB buffer
DAPI nuclear stainThermo Fisher ScientificD1306n/a
Denhardt's solution (50x)Merck (Sigma-Aldrich)D9905n/a
Deoinized formamideMerck (Sigma-Aldrich)F9037n/a
Dextran sulfate solution (50%)Merck (Chemicon)S4030n/a
Ethylene-diamine-tetraacetic acid (EDTA)Merck (Sigma-Aldrich)E9884n/a
Hoechst 33342 nuclear stainThermo Fisher ScientificH1399n/a
Hydrochloric acid (HCl)Merck (Sigma-Aldrich)320331n/a
Olfactory stimulin/aPapes et al. (2010), Carvalho et al. (2015), Nakahara er al. (2016), Carvalho et al. (2020)n/a
ParaformaldehydeMerck (Sigma-Aldrich)P6148n/a
Peroxidase-conjugated anti-digoxigenin antibody (Fab fragments)Merck (Roche)11207733910; RRID:AB_514500verwezen naar als peroxidase-geconjugeerd anti-DIG antilichaam
Peroxidase-conjugated anti-rabbit secondary antibody (polyHRP-conjugated goat anti-rabbit reagent from Alexa Fluor 488 Tyramide SuperBoost kit)Thermo Fisher ScientificB40922n/a
Peroxidase-conjugated streptavidin (from TSA biotin kit)Akoya Biosciences (Perkin Elmer)SAT700001EAn/a
ProLong Gold antifade mountantThermo Fisher ScientificP36934verwezen naar als anti-vervaging montage medium
RNase-free ultrapure waterThermo Fisher Scientific10977015n/a
Sodium chloride (NaCl)Merck (Sigma-Aldrich)S9888n/a
Sodium dodecyl sulfate (SDS)Merck (Sigma-Aldrich)436143n/a
Sodium hydroxide (NaOH)Merck (Sigma-Aldrich)S8045n/a
SucroseMerck (Sigma-Aldrich)S0389n/a
TriethanolamineMerck (Sigma-Aldrich)T58300n/a
Triton X-100Merck (Sigma-Aldrich)X100n/a
Trizma hydrochloride (Tris-Cl)Merck (Sigma-Aldrich)T5941n/a
Tween-20Merck (Sigma-Aldrich)822184n/a
Tyramide-Alexa 488 conjugate (from Alexa Fluor 488 Tyramide SuperBoost kit)Thermo Fisher ScientificB40922n/a
Tyramide-Alexa 555 conjugate (from Alexa Fluor 555 Tyramide SuperBoost kit)Thermo Fisher ScientificB40923n/a
Tyramide-Biotin conjugate (from TSA Biotin kit)Akoya Biosciences (Perkin Elmer)SAT700001EAn/a
Yeast tRNAMerck (Roche)10109495001n/a
Kritieke commerciële assays en dieren
Alexa Fluor 488 Tyramide SuperBoost kitThermo Fisher ScientificB40922n/a
Alexa Fluor 555 Tyramide SuperBoost kitThermo Fisher ScientificB40923n/a
DIG RNA Labeling Kit (SP6/T7)Merck (Roche)11175025910n/a
High Sensitivity RNA ScreenTape Analysis reagents (buffer, ladder, and tape)Agilent5067-5580, 5067-5581, and 5067-5579verwezen naar als geautomatiseerd elektroforesesysteem
Mouse: C57BL/6J inbred strainJackson LaboratoriesStock No: 000664; RRID:IMSR_JAX:000664)n/a
ProbeQuant G-50 Micro ColumnsCytiva Biosciences28903408verwezen naar als gel-filtratie gebaseerd zuiveringskit
QIAquick gel extraction kitQiagen28506verwezen naar als mini-kolom gebaseerde gel-zuiveringskit
RNeasy MinElute cleanup kitQiagen74204verwezen naar als mini-kolom gebaseerde RNA zuiveringskit
TSA Biotin kitAkoya Biosciences (Perkin Elmer)SAT700001EAn/a
Oligonucleotiden

Referenties

  1. Stowers, L., Holy, T. E., Meister, M., Dulac, C., Koentges, G. Loss of sex discrimination and male-male aggression in mice deficient for TRP2. Science. 295 (5559), 1493-1500 (2002).
  2. Chamero, P., et al. Identification of protein pheromones that promote aggressive behaviour. Nature. 450 (7171), 899-902 (2007).
  3. Papes, F., Logan, D. W., Stowers, L. The vomeronasal organ mediates interspecies defensive behaviors through detection of protein pheromone homologs. Cell. 141 (4), 692-703 (2010).
  4. Munger, S. D., Leinders-Zufall, T., Zufall, F. Subsystem organization of the mammalian sense of smell. Annual review of physiology. 71, 115-140 (2009).
  5. Chess, A., et al. Allelic inactivation regulates olfactory receptor gene expression. Cell. 78, 823-834 (1994).
  6. Mombaerts, P. Genes and ligands for odorant, vomeronasal and taste receptors. Nature Reviews Neuroscience. 5, 263-278 (2004).
  7. Malnic, B., Hirono, J., Sato, T., Buck, L. B. Combinatorial receptor codes for odors. Cell. 96 (5), 713-723 (1999).
  8. Dulac, C., Axel, R. A novel family of genes encoding putative pheromone receptors in mammals. Cell. 83 (2), 195-206 (1995).
  9. Herrada, G., Dulac, C. A novel family of putative pheromone receptors in mammals with a topographically organized and sexually dimorphic distribution. Cell. 90 (4), 763-773 (1997).
  10. Martini, S., Silvotti, L., Shirazi, A., Ryba, N. J. P., Tirindelli, R. Co-Expression of Putative Pheromone Receptors in the Sensory Neurons of the Vomeronasal Organ. J. Neurosci. 21 (3), 843-848 (2001).
  11. Silvotti, L., Moiani, A., Gatti, R., Tirindelli, R. Combinatorial co-expression of pheromone receptors, V2Rs. Journal of Neurochemistry. 103 (5), 1753-1763 (2007).
  12. Ishii, T., Mombaerts, P. Expression of nonclassical class I major histocompatibility genes defines a tripartite organization of the mouse vomeronasal system. Journal of Neuroscience. 28 (10), 2332-2341 (2008).
  13. Saraiva, L. R., et al. Hierarchical deconstruction of mouse olfactory sensory neurons: From whole mucosa to single-cell RNA-seq. Scientific Reports. 5, (2015).
  14. Hanchate, N. K., et al. Single-cell transcriptomics reveals receptor transformations during olfactory neurogenesis. Science. 350, 1251-1255 (2015).
  15. Matsunami, H. Functional expression of mammalian odorant receptors. Chemical Senses. 30, Suppl 1 95-96 (2005).
  16. Isogai, Y., et al. Molecular organization of vomeronasal chemoreception. Nature. 478 (7368), 241-245 (2011).
  17. Xu, L., Li, W., Voleti, V., Zou, D. J., Hillman, E. M. C., Firestein, S. Widespread receptor-driven modulation in peripheral olfactory coding. Science. 368 (6487), (2020).
  18. Pfister, P., et al. Article Odorant Receptor Inhibition Is Fundamental to Odor Encoding Odorant Receptor Inhibition Is Fundamental to Odor Encoding. Current Biology. , 1-14 (2020).
  19. de March, C. A., Titlow, W. B., Sengoku, T., Breheny, P., Matsunami, H., McClintock, T. S. Modulation of the combinatorial code of odorant receptor response patterns in odorant mixtures. Molecular and Cellular Neuroscience. 104, 103469(2020).
  20. Nakahara, T. S., Carvalho, V. M. A., Souza, M. A. A., Trintinalia, G. Z., Papes, F. Detection of Activated Mouse Neurons with Temporal Resolution via Dual c-Fos Staining. STAR Protocols. 1 (3), 100153(2020).
  21. Nakahara, T. S., et al. Detection of pup odors by non-canonical adult vomeronasal neurons expressing an odorant receptor gene is influenced by sex and parenting status. BMC biology. 14 (1), 12(2016).
  22. Carvalho, V. M. A., et al. Lack of spatial segregation in the representation of pheromones and kairomones in the mouse medial amygdala. Frontiers in Neuroscience. 9, 1-19 (2015).
  23. Carvalho, V. M. A., et al. Representation of Olfactory Information in Organized Active Neural Ensembles in the Hypothalamus. Cell Reports. 32 (8), 108061(2020).
  24. Papes, F., Nakahara, T. S., Camargo, A. P. Behavioral assays in the study of olfaction: a practical guide. Methods in Molecular Biology, v1820: Olfactory receptors. , 289-388 (2018).
  25. Jiang, Y., Gong, N. N., Hu, X. S., Ni, M. J., Pasi, R., Matsunami, H. Molecular profiling of activated olfactory neurons identifies odorant receptors responding to odors in vivo. Nature Neuroscience. 18, 1446-1454 (2015).
  26. Von Der Weid, B., et al. Large-scale transcriptional profiling of chemosensory neurons identifies receptor-ligand pairs in vivo. Neuroscience. 18 (10), (2015).

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Herprints en machtigingen

Tags

Neuronale activatiereukstelsel van de muisgefosforyleerd S6detectie van chemische stimuliG-eiwitgekoppelde receptorenreukgedragingenvomeronasale receptoren

Dit artikel is gepubliceerd

Video binnenkort beschikbaar

Neem contact met ons op
Aanbevelen aan de bibliotheek

Privacy

Gebruiksvoorwaarden

Beleidsoverzicht

Copyright © 2026 MyJoVE Corporation. Alle rechten voorbehouden.