Methodenartikel

ROS Live Cell Imaging tijdens neuronale ontwikkeling

DOI:

10.3791/62165

⸱

9 februari 2021

 ,  , 
1Department of Biological Sciences, Purdue University, 2Purdue Institute for Integrative Neuroscience, Purdue University, 3Bindley Bioscience Center, Purdue University

In dit artikel

Samenvatting

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Dit protocol beschrijft het gebruik van een genetisch gecodeerd waterstofperoxide (H2O2)-biosensor in gekweekte zebravisneuronen en larven voor het beoordelen van de fysiologische signaleringsrollen van H2O2 tijdens de ontwikkeling van het zenuwstelsel. Het kan worden toegepast op verschillende celtypen en worden aangepast met experimentele behandelingen om reactieve zuurstofsoorten (ROS) in de algemene ontwikkeling te bestuderen.

Samenvatting

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Reactieve zuurstofsoorten (ROS) zijn gevestigde signaalmoleculen, die belangrijk zijn in de normale ontwikkeling, homeostase en fysiologie. Onder de verschillende ROS wordt waterstofperoxide (H2O2) het best gekarakteriseerd met betrekking tot rollen in cellulaire signalering. H2O2 is betrokken geweest bij de ontwikkeling van verschillende soorten. Zo is in de eerste dagen na de bevruchting een voorbijgaande toename vanH2 O2 waargenomen bij zebravisembryo's. Bovendien, het uitputten van een belangrijke cellulaire H2O2 bron, NADPH oxidase (NOX), vermindert de ontwikkeling van het zenuwstelsel, zoals de differentiatie, axonale groei, en begeleiding van retinale ganglioncellen (RGCs) zowel in vivo als in vitro. Hier beschrijven we een methode voor beeldvorming van intracellulaire H2O2-niveaus in gekweekte zebravisneuronen en hele larven tijdens de ontwikkeling met behulp van de genetisch gecodeerde H2O2-specifiekebiosensor, roGFP2-Orp1. Deze sonde kan tijdelijk of stabiel worden uitgedrukt in zebravislarven. Bovendien vermindert de ratiometrische uitlezing de kans op het detecteren van artefacten als gevolg van differentiële genexpressie of volume-effecten. Ten eerste laten we zien hoe we RGC's kunnen isoleren en kweeken die zijn afgeleid van zebravisembryo's die roGFP2-Orp1 tijdelijk uitdrukken. Vervolgens gebruiken we hele larven om H 2O 2-niveausop weefselniveau te controleren. De sensor is gevalideerd door de toevoeging van H2O2. Bovendien zou deze methode kunnen worden gebruikt om H 2 O2-niveausin specifieke celtypen en weefsels te meten door transgene dieren te genereren met weefselspecifieke biosensorexpressie. Aangezien zebravissen genetische en ontwikkelingsmanipulaties vergemakkelijken, zou de hier aangetoonde aanpak kunnen dienen als een pijplijn om de rol van H2O2 tijdens neuronale en algemene embryonale ontwikkeling bij gewervelde dieren te testen.

Inleiding

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Reactive oxygen species (ROS) signalering reguleert de ontwikkeling en werking van het zenuwstelsel1. Een belangrijke cellulaire ROS-bron zijn NADPH-oxidasen (NOX), transmembrane-eiwitten die superoxide en waterstofperoxide genereren (H2O2)2. NOX-enzymen worden gevonden in het centrale zenuwstelsel (CZS) en NOX-afgeleide ROS dragen bij aan neuronale ontwikkeling3,4,5,6. Onderhoud en differentiatie van neurale stamcellen, het vaststellen van neuronale polariteit, neurietuitgroei en synaptische plasticiteit hebben voldoende ros7,8,9,10,11nodig . Aan de andere kant draagt ongecontroleerde productie van ROS door NOXen bij aan neurodegeneratieve aandoeningen, waaronder de ziekte van Alzheimer, multiple sclerose en traumatisch hersenletsel12,13,14. Daarom is de productie van fysiologisch relevante ROS van cruciaal belang voor het behoud van gezonde omstandigheden.

De ontwikkeling van genetisch gecodeerde biosensoren vergemakkelijkte de detectie van cellulaire ROS aanzienlijk. Een belangrijk voordeel van genetisch gecodeerde biosensoren is de verhoogde temporele en ruimtelijke resolutie van het ROS-signaal, omdat deze sensoren specifiek op verschillende locaties kunnen worden gericht. Redox-gevoelige GFP (roGFP) is een type van dergelijke ROS-biosensoren. De roGFP2-Orp1-variant detecteert specifiek H2O2 via zijn Orp1-domein, een glutathion peroxiredoxinefamilie-eiwit uit gist15,16. De oxidatie van het Orp1-eiwit wordt overgebracht naar roGFP2 om de conformatie ervan te wijzigen (figuur 1A). De sonde vertoont twee excitatiepieken in de buurt van 405 nm en 480 nm en een enkele emissiepiek bij 515 nm. Bij oxidatie verandert de fluorescentie-intensiteit rond excitatiepieken: terwijl 405 nm excitatie toeneemt, neemt 480 nm excitatie af. RoGFP2-Orp1 is dus een ratiometrische biosensor en H2O2-niveaus worden gedetecteerd door de verhouding van fluorescentieintensiteiten opgewekt op twee verschillende golflengten (Figuur 1B). Over het algemeen is roGFP2-Orp1 een veelzijdig hulpmiddel voor ROS-beeldvorming dat efficiënt in vivokan worden gebruikt.

figure-introduction-1
Figuur 1: Schematische representatie en excitatiespectra van roGFP2-Orp1. (A) Oxidant transfer vindt plaats tussen Orp1 en roGFP2 als reactie op H2O2, wat leidt tot conformationele veranderingen in roGFP2. (B) De excitatiespectra van de roGFP2-Orp1 vertoont twee excitatiepieken bij 405 nm en 480 nm en enkele emissiepiek bij 515 nm. Bij oxidatie door H2O2neemt de excitatie van 405 nm toe terwijl de excitatie van 480 nm afneemt. Dit resulteert in een ratiometrische uitlezing voor H2O2 aanwezigheid. Het cijfer is gewijzigd van Bilan en Belousov (2017)16 en Morgan et al. (2011)25. Klik hier om een grotere versie van deze afbeelding te bekijken.

Het Danio rerio (zebravis) modelsysteem heeft verschillende voordelen voor het toepassen van genetisch gecodeerde biosensoren. De optische transparantie van de embryo's en larven maakt niet-invasieve in vivo beeldvorming mogelijk. Er worden nieuwe beeldvormingstools ontwikkeld om een hogere resolutie en diepere penetratie te bereiken17. Verder zijn er gevestigde instrumenten voor genetische manipulatie (ectopische mRNA-expressie, Tol2-transgenese, enz.) en genoombewerking (TALEN's, CRISPR/Cas9, enz.), die de generatie van transgene dierenbevordert 18. Naarmate de zebravisembryo's zich buiten de moeder ontwikkelen, maakt dit systeem verder gemakkelijkere toegang tot en manipulatie van de embryo's mogelijk. Bijvoorbeeld, eencellige stadium injecties en medicamenteuze behandelingen kunnen gemakkelijk worden gedaan.

Hier gebruikten we zebravissen om de H 2O2-specifiekebiosensor roGFP2-Orp1 tijdelijk uit te drukken door in vitro getranscribeerd mRNA te injecteren. Deze embryo's kunnen worden gebruikt voor zowel in vitro beeldvorming van gekweekte neuronen als in vivo beeldvorming (figuur 2). We beschrijven een protocol voor het ontleden en plateren van retinale ganglioncellen (RGCs) uit zebravisembryo's, gevolgd door het beoordelen van H2O2-niveaus in gekweekte neuronen. Vervolgens presenteren we een methode voor in vivo beeldvorming van roGFP2-Orp1-uitdrukkende embryo's en larven met behulp van confocale microscopie. Deze aanpak maakt het niet alleen mogelijk om fysiologische H2O2-niveauste bepalen, maar ook potentiële veranderingen die optreden in verschillende ontwikkelingsstadia of omstandigheden. Over het algemeen biedt dit systeem een betrouwbare methode voor het detecteren van H2O2 in levende cellen en dieren om de rol van H2O2 in ontwikkeling, gezondheid en ziekte te bestuderen.

figure-introduction-2
Figuur 2. Schets van de experimentele aanpak. Kort na het verzamelen van embryo's wordt roGFP2-Orp1 mRNA geïnjecteerd in de dooier van zebravisembryo's in één celstadium. Het ontwikkelen van embryo's kan worden gebruikt voor zowel (A) in vitro als (B) in vivo beeldvorming. (A) GFP-positieve embryo's worden gebruikt om netvlies te ontleden voor RGC-verzameling bij 34 hpf. Gedissocieerde RGCs worden geplateerd op PDL/laminine-gecoate coverslips in ZFCM (+) media. Groeikegelbeeldvorming kan worden uitgevoerd terwijl RGC's hun axonen verlengen na 6-24 uur plateren. Cellen kunnen worden onderworpen aan verschillende behandelingen om de potentiële veranderingen in H 2 O2-niveauste meten. Hier hebben we H 2 O2-niveausgemeten in de groeikegels van RGCs (rood). (B) GFP-positieve embryo's worden gebruikt voor in vivo beeldvorming. Op de gewenste leeftijd kunnen embryo's worden verdoofd en gemonteerd op glazen bodemschalen van 35 mm voor confocale beeldvorming. Hier worden embryo's ventrally gemonteerd voor retinale beeldvorming. Schematisch toont retinale ontwikkeling bij zebravissen. RGCs vormen ganglioncellaag (GCL), de binnenste laag in het netvlies. RGC axonen ontwikkelen zich tot oogzenuw om de middellijn te kruisen en vormen optisch chiasme. Vervolgens groeien RGC axonen dorsaal om synapsen te maken in het optische tectum in de middenhersenen. Klik hier om een grotere versie van deze afbeelding te bekijken.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Alle dierproeven werden ethisch beoordeeld en goedgekeurd door het Purdue Animal Care and Use Committee (PACUC), volgens de NIH-richtlijnen met het protocol 2006002050 goedgekeurd op 24-07-2020.

1. Voorbereiding van oplossingen

  1. E2 media (1x)
    1. Bereid oplossingen van 100x E2A (500 mL), 500x E2B (100 mL) en 500x E2C (100 mL) voor door alle in tabel 1afgebeelde componenten te combineren. Autoclaaf E2A, E2B en E2C oplossingen. Bewaren bij 4 °C.
    2. Voor 1x E2 media: Combineer 5 ml van 100x E2A, 1 ml van 500x E2B en 1 ml van 500x E2C. Breng het volume met steriel water op 500 ml. Stel de pH in op 7,0-7,5.
    3. Bereid 50 ml aliquots van 1x E2 mediaopslag bij -20 °C voor langdurige opslag. Bij het ontdooien kan er echter neerslag optreden. Zorg ervoor dat de neerslag volledig is opgelost voordat u de voorraadoplossing gebruikt.
oplossingbestanddeelaantalconcentratie
100X E2A (500mL)
NaCl43,8 g1500 mM
Kcl1,88 g50 mM
MgSO46 g100 mM
KH2PO41,03 g15 mM
Na2HPO40,34 g5 mM
500X E2B (100 ml)
CaCl25,5 g500 mM
500X E2C (100 ml)
NaHCO33 g350 mM
1X E2 (500 ml)
100X E2A5 ml1x
500X E2B1 ml1x
500X E2C1 ml1x

Tabel 1: Componenten van 1x E2 media voor zebraviscelkweek.

  1. E3 Media (1x)
    1. Los de componenten op in steriel water van 1 L zoals aangegeven in tabel 2 om 100x bouillon te maken. Verdun de bouillon in steriel water om 1x E3 media te maken.
    2. Voeg 0,2% methyleenblauw toe. Voeg voor 20 ml 1x E3-media 40 μL methyleenblauw toe.
    3. Maak nog een batch zonder methyleenblauw voor fluorescerende beeldvorming.
bestanddeelBedrag (g)Concentratie in 100X voorraad (mM)
NaCl29.22500
Kcl1.2617
CaCl2 2H2O4.8533
MgSO4 7H2O8.1333

Tabel 2: Componenten van 100x E3 media voor het onderhoud van zebravisembryo's.

  1. 80x zoutoplossing
    1. Combineer alle componenten in tabel 3. Voeg water toe om een oplossing van 100 ml te maken. Meng tot alle componenten zijn opgelost. Bewaar de oplossing bij 4 °C.
bestanddeelBedrag (g)Concentratie op voorraad (mM)
glucose1.4480
Natrium pyruvaat0.4440
CaCl2 2H2O0.14810
HEPES6.1256

Tabel 3: Componenten van 80x zoutoplossing voor zebraviscelkweekmedia.

  1. Zebraviscelkweekmedium (ZFCM+)
    1. Combineer alle componenten in tabel 4 om media van 250 ml te maken. Stel de pH in op 7,5. Filter media met een filter van 0,22 μm en bewaar bij 4 °C.
bestanddeelHoeveelheid (ml)Volume %
L-15 medium (met fenolrood)212.7585.1
Foetale Runderserum (FBS)52
Penicilline/Streptomycine10.4
80X Zoutoplossing3.1251.25
Water28.12511.25

Tabel 4: Componenten van zebraviscelkweekmedium met serum en antibiotica.

  1. Zebraviscelkweekmedium voor beeldvorming (ZFCM-)
    1. Combineer alle componenten in tabel 5 om media van 250 ml te maken. Stel de pH in op 7,5. Filter media met een filter van 0,22 μm.
    2. Maak aliquots voor eenmalig gebruik (batches van 50 ml) om besmetting te voorkomen. Bewaren bij 4 °C.
bestanddeelHoeveelheid (ml)Volume %
L-15 medium (geen fenolrood)212.7585.1
80X Zoutoplossing3.1251.25
Water34.12513.65

Tabel 5: Componenten van zebraviscelkweekmedium zonder serum en antibiotica voor in vitro beeldvorming.

  1. Spuitgietmatrijzen
    1. Los 1,5% agarose op in E3 media. Giet ~ 25 ml agarose in een petrischaal van 100 x 15 mm.
    2. Leg de mal op de agarose met een hoek van 45° ten opzichte van het oppervlak en laat deze met een slow motion op agarose drijven. Dit zal helpen bij het vermijden van bubbels. Laat de agarose afkoelen en stollen op de bank.
    3. Eenmaal volledig gestold, verwijder de mal langzaam om te voorkomen dat agarose breekt. Voeg verse E3-media toe, voeg paraffinefolie rond de schaal toe om morsen te voorkomen en bewaar bij 4 °C ( figuur 3).

figure-protocol-1
Figuur 3: Spuitgietmatrijzen. (A) De plastic mal die wordt gebruikt om injectieplaten te maken. De mal heeft zes hellingen, een 90° en een 45° afgeschuinde kant voor het houden van embryo's op hun plaats. (B) De injectieplaat nadat de agarose gestold is en schimmel is verwijderd. Schaalbalken = 1 cm. Klik hier om een grotere versie van deze afbeelding te bekijken.

2. Bereiding en injectie van roGFP2-Orp1 mRNA

OPMERKING: roGFP2-Orp1 construct werd verkregen van Dr. Tobias Dick, DKFZ, Duitsland. Het werd gesubkloond in de pCS2+ vector in Dr. Qing Deng's Lab, Purdue University. Om afbraak door RNase te voorkomen, moeten verschillende voorzorgsmaatregelen worden genomen. RNase-vrije reagentia en buizen moeten te allen tijde worden gebruikt, handschoenen moeten voor alle stappen worden gedragen en als alternatief kunnen materialen en oppervlakken worden afgeveegd met een reinigingsmiddel voor RNase-verwijdering.

  1. Lineariseer de 3-10 μg pCS2+/roGFP2-Orp1 vector met NotI.
  2. Zuiver de lineaire plasmide met een PCR clean-up kit.
  3. In vitro transcriberen van de roGFP2-Orp1 mRNA met een in vitro transcriptiekit volgens de instructies van de fabrikant.
    1. Gecapitpte transcriptiereactieassemblage
      1. Plaats RNA-polymerase en ge lineariseerd/gezuiverd DNA op ijs. Vortex 10x reactiebuffer en 2x NTP/CAP tot ze volledig in oplossing zijn. Bewaar NTP/CAP op ijs, maar houd de buffer op kamertemperatuur (RT) tijdens het monteren van de reactie. Draai alle reagentia aan voordat u buizen opent om verontreiniging te voorkomen.
      2. Stel de RNA-synthesereactie in de onderstaande volgorde in bij RT in een RNase-vrije centrifugebuis van 0,5 ml. Het uiteindelijke volume van de reactie is 20 μL. De reactie-instelling is weergegeven in tabel 6.
      3. Voeg indien nodig 10 μL ribonucleotidemix, 2x NTP/CAP en nucleasevrij water toe aan de buis. Voeg 2 μL 10X reactiebuffer toe. Voeg 1-1,5 μg lineair DNA (tot 6 μL) toe. Voeg indien nodig nucleasevrij water toe om een reactievolume van 20 μL in te halen.
      4. Sluit de buis, vortex kort en touch-spin microfuge. Voeg 2 μL 10x SP6 enzymmix toe. Sluit met een vingerklik en touch-spin in een microfuge.
      5. Plaats in 37 °C gedurende 2-2,5 uur (kan oplopen tot 18 uur).
        OPMERKING: In het gepresenteerde experiment werd 's nachts 16-18 uur incubatie bij 37 °C uitgevoerd voor de beste resultaten.
      6. Voeg 1 μL DNase toe om DNA-sjabloon, vingerklik, aanraakspin en incubeer bij 37 °C gedurende 15 minuten te verwijderen.
ReagensVolume (μL)Hoeveelheid in reactie
2X NTP/DOP101x
10x reactiebuffer21x
Sjabloon DNATot 61-1,5 μg
Nucleasevrij waterToevoegen om 20 μL te maken
10X SP6 enzymmix21x

Tabel 6: Reactie-instelling voor roGFP2-Orp1 mRNA in vitro transcriptie.

  1. RNA-herstel
    1. Voeg 25 μL lithiumchloride (LiCl) toe in de in vitro transcriptiekit. Ten minste 30 minuten in een niet-vorstvrije vriezer bij -20 °C plaatsen.
    2. Draai gedurende 25 minuten op maximale snelheid in een tafelcentrifuge bij 4 °C. Verwijder en gooi supernatant voorzichtig weg, om pellet niet te verstoren. Voeg 25 μL koude 75% ethanol toe en draai gedurende 5 minuten bij 4 °C.
    3. Verwijder voorzichtig en gooi het supernatant weg. Laat de pellet minstens 5 minuten aan de lucht drogen bij RT. Laat niet uitdrogen. Voeg 12 μL nucleasevrije Tris-EDTA (TE) buffer (pH 7,0) toe en houd het monster op ijs.
    4. Meet de RNA-concentratie met een spectrofotometer. 0,5- 1 μg/μL wordt meestal verkregen.
    5. Bereid 100 ng/μL mRNA in fenolrode oplossing (0,5% fenolrood in Dulbecco's fosfaatgebufferde zoutoplossing -DPBS) en aliquot voor eenmalig gebruik (3-5 μL). Bewaar de mRNA aliquots bij - 80 °C.
  1. Micro-invoeging van mRNA
    1. Gebruik op de dag van injectie een van de mRNA-aliquots en volg het zebravisembryo-injectieprotocol om 1 nL van het mRNA in de embryo's in het stadium van één cel te injecteren via hun dooier19. Hieronder vindt u een korte beschrijving.
    2. Fok volwassen vissen en verzamel embryo's zoals eerder beschreven20.
    3. Trek micro-injection naalden met pipet puller. Snijd de punt van de naalden met een tang om een tipopening van 10 μm te creëren.
    4. Lijn embryo's uit in een spuitgietmatrijs die werd beschreven in stap 1.6.
    5. Injecteer 1 nL van het mRNA in fenolrood met een glazen micro-injectiepipet.
    6. Verzamel embryo's en bewaar ze in E3-media.
    7. Bewaar embryo's in de incubator van 27 °C in E3-media totdat de gewenste ontwikkelingsfase is bereikt. Geïnjecteerde embryo's kunnen zowel voor in vitro (rubriek 3 en rubriek 4) als voor in vivo beeldvorming (rubriek 5) worden gebruikt. Embryo's die roGFP2-Orp1 uitdrukken, kunnen vooraf worden geselecteerd voordat ze worden geëxperixt, met een gewone dissectiemicroscoop uitgerust met fluorescerend licht en een blauw/groene filterset.

3. Primaire retinale ganglioncelcultuur afgeleid van zebravisembryo's

OPMERKING: Dit protocol is aangepast aan een eerder gepubliceerde methode 21. Voer stap 3.1 en 3.2 uit in een laminaire stromingskap.

  1. Voorbereiding van deklips
    1. Bereid 4-6 kweekplaten voor in elk experiment. Gebruik zuur gereinigde afdeklips (22 x 22 mm vierkant; 0,16-0,19 mm dikte) die worden opgeslagen in 100% ethanol.
    2. Verwijder een afdeklip uit de opslagcontainer met behulp van een tang en vlam deze om resterende ethanol te verwijderen.
    3. Droog de afdeklip volledig aan de lucht door deze schuin in een kweekschaal van 35 mm te plaatsen.
    4. Bereid poly-D-Lysine (PDL) werkoplossing (1x) door 10x bouillon (5 mg/ml) in steriel water te verdunnen.
    5. Breng 100 μL 0,5 mg/ml PDL aan op het midden van elke afdeklip en vermijd verspreiding van de oplossing naar de randen.
    6. Incubeer de PDL op coverslips gedurende 20-30 min bij kamertemperatuur (RT). Zorg ervoor dat de PDL niet uitdroogt.
    7. Was de PDL driemaal met steriel water van 0,5 ml. Laat de platen volledig drogen.
    8. Bereid lagoline werkoplossing (1x) door 50x bouillon (1 mg/ml) in 1x PBS te verdunnen.
    9. Breng 100 μL 20 μg/ml laminine in PBS aan op het midden van elke afdeklip en vermijd de verspreiding van de oplossing naar de randen.
    10. Incubeer de platen bij 37 °C in een bevochtigde incubator gedurende 2-6 uur. Vermijd het drogen van de lagoplossing.
  2. Embryodissectie en plating RGCs
    1. Bereid en etiketteer vier 35 mm weefselkweekgerechten en vul met 4 ml: 70% ethanol, "E2 media 1", "E2 media 2", "E2 media 3" op de dag van dissectie. Bewaar de gerechten in de koelkast tot ze ontleden zijn.
    2. Wanneer zebravisembryo's 34 uur na de bevruchting (hpf) zijn, haal dan de kweekschotels bedekt met lag uit de broedmachine en was de deklipjes drie keer met 0,5 ml 1x PBS.
    3. Voeg na de laatste wasbeurt 4 ml ZFCM(+) media toe aan elke kweekschaal en vermijd het drogen van de plaat.
    4. Haal de bereide kweekgerechten uit stap 3.2.1. Laat ze gelijk zijn aan RT.
    5. Vul 4-6 PCR-buizen met 15 μL ZFCM(+) media. Eén buis is nodig om RGCs van 4 ogen voor te bereiden om op één afdeklip te worden geplateerd.
    6. Haal zebravisembryo's uit de incubator en dompel embryo's onder in een 35 mm weefselkweekschaal met 70% ethanol gedurende 5-10 s om te steriliseren.
    7. Breng embryo's met behulp van een transferpipet over naar een E2 Media 1-schaal met steriele E2-media om overtollige ethanol te wassen.
    8. Breng embryo's over naar E2 Media 2 en verwijder hun koraal met een scherpe tang.
    9. Breng embryo's over naar de laatste E2 Media 3-schaal om dissecties uit te voeren.
    10. Ontleed met behulp van een paar fijne tangen het netvlies zoals eerder beschreven 22.
    11. Plaats en houd embryo's voor of achter hun dooier met een van de tangen en verwijder de staartpostie in de dooierzak met de andere tang.
    12. Pak de nek met een tang en doe het hoofd eraf om hersenen en ogen bloot te stellen aan de E2-media. Vermijd het snijden van de dooierzak.
    13. Rol met de punt van de fijne tang de ogen voorzichtig van het hoofd af, terwijl u het schedelweefsel met de tweede tang naar beneden houdt. Houd de ogen geïsoleerd van het aangrenzende weefselresten.
    14. Breng vier ogen over op een van de eerder bereide buizen met ZFCM(+).
    15. Titreer voorzichtig op en neer met de P20 pipet en een gele punt ongeveer 45 keer om cellen te dissociateren. Vermijd luchtbellen.
    16. Breng de ZFCM(+) met gedissocieerde cellen over naar het midden van de coverslip. Herhaal stap 10-12 voor extra coverslips.
    17. Onderhoud culturen op een tafelblad bij 22 °C op een polystyreenschuimrek om trillingen te absorberen.
    18. Voer beeldvorming 6-24 uur na plating uit.
      OPMERKING: Gebruik transferpipet om embryo's over te brengen naar verschillende kweekgerechten. Vervang de pipet voor elke oplossing om te voorkomen dat ethanol wordt overgedragen (stappen 6-8).

4. In vitro ROS beeldvorming van gekweekte RGC neuronen

  1. Controleer op de dag van beeldvorming (meestal 6-24 uur na het plateren van cellen) cellen onder de microscoop om de groei van RGC-axonen te valideren.
  2. Voor live-cell imaging, transfer coverslips van kweekschaal naar een live cell imaging kamer. In dit geval werd een op maat gemaakte open kamer gebruikt, die eerder is beschreven23.
  3. Zet een microscoop op voor beeldvorming. Gebruik een omgekeerde microscoop uitgerust met een differentieel interferentiecontrast (DIC) objectief, OG590 long-pass rood filter en een EM-CCD camera.
  4. Vervang het ZFCM(+) medium vóór de beeldvorming door ZFCM(-).
  5. Zodra cellen zijn gepositioneerd met 10x objectief, verkrijgt u beelden bij 60x vergroting met behulp van een hoge NA olie onderdompelingsdoelstelling. Gebruik een extra vergroting van 1,5x.
  6. Koop eerst DIC-afbeeldingen. Afbeelding roGFP2-Orp1 met behulp van een geschikte filterset. Excite roGFP2-Orp1 met 405/20 en 480/30 nm excitatiefilters opeenvolgend en verkrijg beelden met 535/30 nm emissiefilter nadat emissielicht de dichroïsche spiegel 505DCXR heeft gepasseerd.
  7. Na het maken van de eerste set afbeeldingen, wissel je media uit met media met verschillende behandelingsoplossingen. Media moeten elke 30 minuten beeldvorming worden gewijzigd om pH- en osmolariteitsveranderingen te voorkomen.

5. In vivo ROS beeldvorming van zich ontwikkelende embryo's

  1. Voor in vivo beeldvorming, houd embryo's in E3 media die 0.003% Phenylthiourea (PTU) bevatten zonder methyleenblauw van 22-24 hpf. Media uitwisselen en dagelijks dode embryo's verwijderen.
  2. Verdoof embryo's op de gewenste leeftijd in 0,016% tricaine. Monteer verdoofde embryo's in 1% laagsmeltende agarose op 35 mm glazen bodemkweekgerechten. Embryo's kunnen dorsaal, ventrale of lateraal worden georiënteerd, afhankelijk van de regio die van belang is voor beeldvorming.
  3. Nadat agarose stolt, vul de gerechten met E3-media zonder methyleenblauw/0,016% tricaïne.
  4. Zet de microscoop klaar voor beeldvorming. Gebruik een omgekeerde laserscan confocale microscoop. U kunt ook een rechtopstaande confocale microscoop gebruiken die is uitgerust met een wateronderdompelingslens om embryo's te bekijken die bovenop een agarosedruppel zijn gemonteerd.
  5. Excite roGFP2-Orp1 met 405 nm en 488 nm excitatiefilters opeenvolgend en verkrijg overeenkomstige beelden met emissiefilters in het bereik van 515-535 nm.
  6. Verkrijg z-stacks met een doorsnededikte van 5 μm door het gewenste deel van de embryo's. Embryo's kunnen worden bewaard voor beeldvorming in latere stadia van ontwikkeling.
  7. Verwijder embryo's na beeldvorming met fijne tang uit agarose en bewaar ze in de incubator tot de gewenste leeftijd in methyleenblauwvrije media met PTU.

6. Beeldanalyse en -verwerking

  1. Meting van H2O2-niveaus op basis van 405/480-ratiowaarden
    1. Gebruik een geschikte software voor beeldanalyse. ImageJ software werd hier gebruikt voor beeldanalyse en verwerking.
    2. Open DIC-, 405/535- en 480/535-afbeeldingen in ImageJ-software door de bestanden te slepen of op Bestand | te klikken Open. Als u dit nog niet hebt gedaan, converteert u afbeeldingen naar 32-bits door op Afbeelding | Type | 32-bits.
    3. Definieer regio van belang (ROI) met gratis handgereedschap van de bedieningsbalk (cellichaam, groeikegel, netvlies, enz.). Open de ROI manager door te klikken op Analyseren | Gereedschap | ROI Manager. Klik op Toevoegen op het tabblad ROI Manager om de gedefinieerde ROI toe te voegen.
    4. Teken een regio dicht bij roi en voeg toe als achtergrond ROI. Meet de gemiddelde achtergrondwaarden door de ROI te selecteren en op Meten te klikken op het tabblad ROI-manager.
    5. Noteer de gemiddelde intensiteitswaarden van de meting. Trek de waarde van de gemiddelde achtergrond af van de fluorescerende afbeeldingen door te klikken op Proces | Wiskunde | Aftrekken. Voer deze stap uit voor zowel 405/535- als 480/535-afbeeldingen.
    6. Voeg de waarde van "1" toe aan 480/535 fluorescerende afbeelding om "0"-waarden te elimineren door op Proces | Wiskunde | Functie toevoegen voorafgaand aan ratioberekening.
    7. Klik op proces | Afbeelding Calculator | Deel functie in ImageJ om 405/535 afbeelding te delen door 480/535 afbeelding pixel-voor-pixel. Selecteer 405/535 afbeelding te delen door 480/535 afbeelding. Selecteer een 32-bits uitvoerafbeelding.
    8. Pas de afbeelding ROI-verhouding toe door eerst op de verhoudingsafbeelding te klikken en vervolgens op de ROI op het tabblad ROI-manager.
    9. Meet de gemiddelde verhoudingswaarden van 405/535-afbeelding tot 480/535-afbeelding door op Meten te klikken op het tabblad ROI-manager.
    10. Voer de stappen 6.1.2-6.1.9 uit voor zoveel mogelijk monsters om de juiste statistische analyse uit te voeren.
  2. Afbeelding van de weergaveverhouding
    OPMERKING: Deze procedure is om de achtergrond buiten het monster af te trekken en een kleuropzoektabel op de afbeelding toe te passen.
    1. Zodra de verhoudingsafbeelding in Afbeelding J in stap 6.1.7 is gemaakt, maakt u een 32-bits zwarte afbeelding door op Bestand | Nieuwe | Afbeelding.
    2. Pas de ROI die u wilt weergeven H2O2 niveaus voor toe op de nieuwe afbeelding door eerst op de nieuwe afbeelding te klikken en vervolgens op de ROI op het tabblad ROI manager.
    3. Maak een masker door op Bewerken | te klikken Selectie | Masker maken.
    4. Deel maskerafbeelding door 255 om de ROI-waarde aan te passen aan "1" en achtergrondwaarden zijn "0". Klik op proces | Wiskunde | Verdeel en typ 255.
    5. Masker vermenigvuldigen met de verhoudingsafbeelding door op Proces | te klikken Afbeelding Calculator | Vermenigvuldig de functie. Dit resulteert in een afbeelding met een grijsschaalverhouding die alleen de ROI weergeeft.
    6. Wijzig de opzoektabel in "Fire" door op Afbeelding | te klikken Tabellen | opzoeken Vuur.
      OPMERKING: Een vermenigvuldigingsfactor kan op alle afbeeldingen worden toegepast voor een betere visualisatie van de verhouding door te klikken op Proces | Afbeelding | Vermenigvuldig.
    7. Converteer de verhoudingsafbeelding naar 8-bits door op Afbeelding | te klikken Type | 8-bits.
    8. Kalibratiebalk toevoegen door op | analyseren te klikken Gereedschap | Kalibratiebalk.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Resultaten

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Gekweekte zebravis RGCs strekken axonen uit binnen 1d. Figuur 4A geeft een representatief beeld van de verhouding 405/480 van deH2 O2-biosensor . Het cellichaam, axon en groeikegels zijn duidelijk zichtbaar in individuele neuronen. Deze neuronen kunnen in de loop van de tijd aan verschillende behandelingen worden onderworpen om H 2 O2-veranderingente controleren. We ontdekten eerder dat het toevoegen van 100 μM H2O2 aan cultu...

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Discussie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Er zijn verschillende kritieke stappen die aandacht nodig hebben in dit protocol. Wij zijn van mening dat het overwegen van deze punten de experimentele stroom zal verbeteren. Voor primaire RGC-cultuur is de steriliteit van de ZFCM(-) erg belangrijk, omdat dit kweekmedium geen antibiotica bevat en besmetting voor of tijdens beeldvorming kan optreden. Om dit te voorkomen, adviseren wij om ZFCM(-) alleen in een bioveiligheidskast te bereiden en te gebruiken en regelmatig verse ZFCM(-) media te maken (stap 1.5). Bovendien m...

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Openbaarmakingen

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Auteurs verklaren dat ze geen belangenverstrengeling hebben.

Dankbetuigingen

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Dit werk werd ondersteund door de National Institutes of Health (Grant R01NS117701), National Science Foundation (Grant 1146944-IOS), het Indiana Traumatic Spinal Cord and Brain Injury Research Fund (Grant 20000289), de Purdue Research Foundation (Grant 209911) en het Office of the Executive Vice President for Research and Partnerships aan purdue University (Grant 210362). We danken Dr. Cory J. Weaver en Haley Roeder voor het opstellen van het zebravis RGC cultuurprotocol. We danken Haley Roeder bovendien voor het verstrekken van de gegevens van figuur 4. We danken Leah Biasi en Kenny Nguyen voor de hulp bij de RGC-cultuur. We danken Gentry Lee voor het bewerken van de tekst. We danken Dr. Tobias Dick voor het leveren van roGFP2-Orp1 en Dr. Qing Deng voor pCS2+ vector met roGFP2-Orp1. Figuur 2 is gemaakt met Biorender.com.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel
NaamBedrijfCatalogusnummerOpmerkingen
35-mm kweekschotelSarstedt83-3900
35-mm glazen bodemschotelMatTekP35G-1.5-10-C
AgaroseFisher ScientificBP160-500
Borosilicaat glazen capillaire buizenSutter/Fisher ScientificNC9029378
Calciumchloride DihydraatFisher ScientificC79-500
DekglasCorning2850-22
Weggeef Petri-schalen (100 x 15 mm)VWR25384-094
Foetaal runder serumThermoFisher Scientific26140087
GlucoseSigma AldichG7528
HEPESSigma AldichH4034
InjectiematrijsAdaptive Science ToolsTU-1
Inverteerde microscoopNikonTE2000
LaminineThermoFisher Scientific23017-015
Laser Scanning Confocal MicroscopieZeiss710
Leibovitz's L-15 Medium met fenol roodGibco/Fisher Scientific11-415-064
Leibovitz's L-15 Medium zonder fenol roodGibco/Fisher Scientific21-083-027
Laag smeltende agarosePromegaV2111
mMessage mMachine SP6 TranscriptiekitInvitrogenAM1340
NotINew England BiolabsR0189S
PBSHyclone/Fisher ScientificSH3025601
Penicilline/streptomycineThermoFisher Scientific15140122
FenolroodSigma AldichP0290
Fenylthioureum (PTU)Sigma AldichP7629
Pneumatische PicoPumpWorld Precision InstrumentsPV820
Poly-D-Lysine (PDL)Sigma AldichP7280
QiaQUICK PCR ZuiveringskitQIAGEN28104
Recombinant muis slit2R&D Systems5444-SL-050
Natrium PyruvaatSigma AldichP5280
Steritop 0.22 µm filterMilliporeS2GPT05RE
TE BufferAmbionAM9860
Tricaine MethanesulfonaatSigma AldichE10521
Vertical Pipet PullerDavid Kopf Instruments700C

Referenties

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Bórquez, D. A., et al. Dissecting the role of redox signaling in neuronal development. Journal of Neurochemistry. 137 (4), 506-517 (2016).
  2. Bedard, K., Krause, K. -H. The NOX family of ROS-generating NADPH oxidases: Physiology and pathophysiology. Physiological Reviews. 87 (1), 245-313 (2007).
  3. Weaver, C. J., Leung, Y. F., Suter, D. M. Expression dynamics of NADPH oxidases during early zebrafish development. Journal of Comparative Neurology. 524 (10), 2130-2141 (2016).
  4. Terzi, A., Suter, D. M. The role of NADPH oxidases in neuronal development. Free Radical Biology and Medicine. 154, 33-47 (2020).
  5. Infanger, D. W., Sharma, R. V., Davisson, R. L. NADPH oxidases of the brain: Distribution, regulation, and function. Antioxidants & Redox Signaling. 8 (9-10), 1583-1596 (2006).
  6. Coyoy, A., Olguin-Albuerne, M., Martinez-Briseno, P., Moran, J. Role of reactive oxygen species and NADPH-oxidase in the development of rat cerebellum. Neurochemistry International. 62 (7), 998-1011 (2013).
  7. Le Belle, J. E., et al. Proliferative neural stem cells have high endogenous ROS levels that regulate self-renewal and neurogenesis in a PI3K/Akt-dependant manner. Cell Stem Cell. 8 (1), 59-71 (2011).
  8. Nayernia, Z., et al. Decreased neural precursor cell pool in NADPH oxidase 2-deficiency: from mouse brain to neural differentiation of patient derived iPSC. Redox Biology. 13, 82-93 (2017).
  9. Wilson, C., Nunez, M. T., González-Billault, C. Contribution of NADPH oxidase to the establishment of hippocampal neuronal polarity in culture. Journal of Cell Science. 128 (16), 2989-2995 (2015).
  10. Munnamalai, V., et al. Bidirectional interactions between Nox2-type NADPH oxidase and the F-actin cytoskeleton in neuronal growth cones. Journal of Neurochemistry. 130 (4), 526-540 (2014).
  11. Kishida, K. T., et al. Synaptic plasticity deficits and mild memory impairments in mouse models of chronic granulomatous disease. Molecular and Cellular Biology. 26 (15), 5908-5920 (2006).
  12. Ravelli, K. G., et al. Nox2-dependent neuroinflammation in an EAE model of multiple sclerosis. Translational Neuroscience. 10 (1), 1-9 (2019).
  13. Park, L., et al. Nox2-derived radicals contribute to neurovascular and behavioral dysfunction in mice overexpressing the amyloid precursor protein. Proceedings of the National Academy of Sciences. 105 (4), 1347-1352 (2008).
  14. Schiavone, S., Neri, M., Trabace, L., Turillazzi, E. The NADPH oxidase NOX2 mediates loss of parvalbumin interneurons in traumatic brain injury: Human autoptic immunohistochemical evidence. Scientific Reports. 7 (1), 8752(2017).
  15. Gutscher, M., et al. Proximity-based protein thiol oxidation by H2O2-scavenging peroxidases. Journal of Biological Chemistry. 284 (46), 31532-31540 (2009).
  16. Bilan, D. S., Belousov, V. V. New tools for redox biology: from imaging to manipulation. Free Radical Biology and Medicine. 109, 167-188 (2016).
  17. Abu-Siniyeh, A., Al-Zyoud, W. Highlights on selected microscopy techniques to study zebrafish developmental biology. Laboratory Animal Research. 36 (1), 12(2020).
  18. Sassen, W. A., Koster, R. W. A molecular toolbox for genetic manipulation of zebrafish. Advances in Genomics and Genetics. 5, 151-163 (2015).
  19. Rosen, J. N., Sweeney, M. F., Mably, J. D. Microinjection of zebrafish embryos to analyze gene function. Journal of Visualized Experiments. (25), e1115(2009).
  20. Avdesh, A., et al. Regular care and maintenance of a Zebrafish (Danio rerio) laboratory: An introduction. Journal of Visualized Experiments. (69), e4196(2012).
  21. Chen, Z., et al. Primary neuron culture for nerve growth and axon guidance studies in Zebrafish (Danio rerio). PLoS One. 8 (3), 57539(2013).
  22. Zhang, L., Leung, Y. F. Microdissection of zebrafish embryonic eye tissues. Journal of Visualized Experiments. (40), e2028(2010).
  23. Suter, D. M. Live cell imaging of neuronal growth cone motility and duidance in vitro. Cell Migration: Methods in Molecular Biology. , 65-86 (2011).
  24. Weaver, C. J., et al. nox2/cybb deficiency affects zebrafish retinotectal connectivity. Journal of Neuroscience. 38 (26), 5854-5871 (2018).
  25. Morgan, B., Sobotta, M. C., Dick, T. P. Measuring EGSH and H2O2 with roGFP2-based redox probes. Free Radical Biology and Medicine. 51, 1943-1951 (2011).
  26. Li, Z., et al. Phenylthiourea specifically reduces zebrafish eye size. PLoS One. 7 (6), 40132(2012).
  27. Ermakova, Y. G., et al. Red fluorescent genetically encoded indicator for intracellular hydrogen peroxide. Nature Communications. 5, 5222(2014).
  28. Oparka, M., et al. Quantifying ROS levels using CM-H2DCFDA and HyPer. Methods. 109, 3-11 (2016).
  29. Dickinson, B. C., Peltier, J., Stone, D., Schaffer, D. V., Chang, C. J. Nox2 redox signaling maintains essential cell populations in the brain. Nature Chemical Biology. 7 (2), 106-112 (2011).
  30. Cannon, M. B., Remington, S. J. Redox-sensitive green fluorescent protein: Probes for dynamic intracellular redox responses. A review. Methods in Molecular Biology. 476, 51-65 (2009).
  31. Meyer, A. J., Dick, T. P. Fluorescent protein-based redox probes. Antioxidants & Redox Signaling. 13 (5), 621-650 (2010).
  32. Panieri, E., Millia, C., Santoro, M. M. Real-time quantification of subcellular H2O2 and glutathione redox potential in living cardiovascular tissues. Free Radical Biology and Medicine. 109, 189-200 (2017).
  33. Breus, O., Dickmeis, T. Genetically encoded thiol redox-sensors in the zebrafish model: Lessons for embryonic development and regeneration. Biological Chemistry. , (2020).
  34. Morgan, B., et al. Real-time monitoring of basal H2O2 levels with peroxiredoxin-based probes. Nature Chemical Biology. 12 (6), 437-443 (2016).
  35. Terzi, A., Roeder, H., Weaver, C. J., Suter, D. M. Neuronal NADPH oxidase 2 regulates growth cone guidance downstream of slit2/robo2. Developmental Neurobiology. , (2020).
  36. Bilan, D. S., Belousov, V. V. HyPer family probes: State of the art. Antioxidants & Redox Signaling. 24 (13), 731-751 (2016).
  37. Ermankova, Y. G., et al. SypHer3s: a genetically encoded fluorescent ratiometric probe with enhanced brightness and an improved dynamic range. Chemistry Communications. 54 (23), 2898-2901 (2018).
  38. Pak, V. V., et al. Ultrasensitive genetically encoded indicator for hydrogen peroxide identifies roles for the oxidant in cell migration and mitochondrial function. Cell Metabolism. 31 (3), 642-653 (2020).
  39. Kwan, K. M., et al. The Tol2kit: A multisite gateway-based construction Kit for Tol2 transposon transgenesis constructs. Developmental Dynamics. 236 (11), 3088-3099 (2007).

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Herprints en machtigingen

Toestemming aanvragen om de tekst of afbeeldingen van dit JoVE-artikel te hergebruiken

Toestemming aanvragen

Trefwoorden

Live Cell ImagingReactive Oxygen SpeciesHydrogen Peroxide BiosensorNeuronal DevelopmentZebrafish EmbryosRetinal Ganglion CellsroGFP2 Orp1 SensorConfocal MicroscopyAxon GrowthIn Vivo Imaging

Gerelateerde artikelen