Methodenartikel

Twee infectietesten om niet-dodelijke virulentiefenotypes te bestuderen in C. albicans met behulp van C. elegans

DOI:

10.3791/62170

⸱

17 mei 2021

 ,  , 
1Graduate Program in Genetics & Molecular Biology, Emory University, 2Department of Biology, Emory University

In dit artikel

Samenvatting

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Schimmelopportunistische pathogenen kunnen zowel levensbedreigende als kleine infecties veroorzaken, maar niet-dodelijke fenotypes worden vaak genegeerd bij het bestuderen van virulentie. Daarom hebben we een nematodenmodel ontwikkeld dat zowel de overleving als de voortplanting van de gastheer monitort om de virulentie van schimmels te onderzoeken.

Samenvatting

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Hoewel ziekteverwekkers dodelijk kunnen zijn voor mensen, veroorzaken veel van hen een reeks infectietypes met niet-dodelijke fenotypes. Candida albicans, een opportunistische schimmelpathogeen bij de mens, is de vierde meest voorkomende oorzaak van nosocomiale infecties, wat resulteert in ~40% mortaliteit. Andere C. albicans-infecties zijn echter minder ernstig en zelden dodelijk en omvatten vulvovaginale candidiasis, die ~75% van de vrouwen treft, evenals orofaryngeale candidiasis, die voornamelijk zuigelingen, aidspatiënten en kankerpatiënten treft. Hoewel muizenmodellen het vaakst worden gebruikt om de pathogenese van C. albicans te bestuderen, beoordelen deze modellen voornamelijk de overleving van de gastheer en zijn ze kostbaar, tijdrovend en beperkt in replicatie. Daarom zijn er verschillende mini-modelsystemen, waaronder Drosophila melanogaster, Danio rerio, Galleria mellonella en Caenorhabditis elegans, ontwikkeld om C. albicans te bestuderen. Deze minimodellen zijn zeer geschikt voor het screenen van mutantenbibliotheken of diverse genetische achtergronden van C. albicans. Hier beschrijven we twee benaderingen om C. albicans-infectie te bestuderen met behulp van C. elegans. De eerste is een vruchtbaarheidstest die de reproductie van de gastheer meet en de overleving van individuele gastheren controleert. De tweede is een afstammingsuitbreidingstest die meet hoe C. albicans-infectie de groei van de gastheerpopulatie over meerdere generaties beïnvloedt. Samen bieden deze tests een eenvoudige, kosteneffectieve manier om snel de virulentie van C. albicans te beoordelen.

Inleiding

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Candida albicans is een opportunistische schimmelpathogeen van mensen die in verschillende niches woont, waaronder de mondholte, gastro-intestinale en urogenitale kanalen1. Hoewel typisch commensaal, C. albicans veroorzaakt zowel slijmvlies- als bloedbaaninfecties, waarvan de laatste dodelijk kan zijn. De ernst van C. albicans-infectie is afhankelijk van de immuunfunctie van de gastheer, waarbij immuungecompromitteerde personen vatbaarder zijn voor infectie dan gezonde personen1. Naast gastheergerelateerde factoren heeft C. albicans verschillende virulentiekenmerken, waaronder hyfen, biofilmvorming en productie van secretoire aspartylproteïnasen (SAP's), die fungeren om adhesie en invasie van C. albicans in gastheerepitheelcellente bevorderen 2, en candidalysine, een cytolytisch peptidetoxine 3,4. Samen suggereert dit dat de virulentie van C. albicans een complex fenotype is dat het resultaat is van een interactie tussen de ziekteverwekker en zijn gastheeromgeving. Daarom kan het onderzoeken van virulentie het beste worden bestudeerd met behulp van modelorganismen die dienen als gastheeromgevingen, in tegenstelling tot in vitro benaderingen.

Verschillende gastheermodellen, waaronder zowel gewervelde als ongewervelde organismen, zijn ontwikkeld om C. albicans-infectie te bestuderen. Het muizenmodel, dat als de gouden standaard wordt beschouwd, wordt vaak gebruikt vanwege het adaptieve en aangeboren immuunsysteem en het vermogen om de ziekteprogressie zowel systemisch als in specifieke organen te volgen5. Er zijn echter aanzienlijke beperkingen aan dit hostmodel, waaronder onderhoudskosten, een klein aantal nakomelingen en verminderd vermogen en reproduceerbaarheid in verband met kleine steekproefgroottes5. Daarom zijn er andere, eenvoudigere modelorganismen ontwikkeld, zoals zebravissen (Danio rerio), fruitvliegjes (Drosophila melanogaster), wasmot (Galleria mellonella) en nematoden (Caenorhabditis elegans). Deze niet-zoogdiermodelorganismen zijn kleiner, vereisen minder laboratoriumonderhoud en grotere steekproefgroottes zorgen voor een groter vermogen en reproduceerbaarheid in vergelijking met muizenmodellen. Elk van deze modellen heeft specifieke voor- en nadelen waarmee rekening moet worden gehouden bij het kiezen van een infectiemodel. G. mellonella biedt de fysiologisch meest vergelijkbare omgeving voor mensen, aangezien het kan worden gekweekt bij 37 °C en verschillende fagocytische cellen heeft7. Bovendien maakt dit model de directe injectie van een specifiek inoculum7 mogelijk. Er is echter geen volledig gesequenced genoom en geen gevestigde methode om mutante stammen te creëren. Net als bij G. mellonella maakt het D. rerio-model directe injectie van een specifiek entmateriaal mogelijk 5,7. Het heeft ook zowel een adaptief als een aangeboren immuunsysteem5, wat uniek is voor dit niet-zoogdiermodel, maar toch aquatische kweektanks nodig heeft om te onderhouden. D. melanogaster en C. elegans hebben vergelijkbare voor- en nadelen, waaronder volledig gesequencede genomen die gemakkelijk te manipuleren zijn en mutante stammen genereren7 maar geen adaptieve immuniteit of cytokines hebben7. Van al deze niet-zoogdiermodellen heeft C. elegans de snelste levenscyclus, zelfbevruchting om grote aantallen genetisch identieke nakomelingen te genereren en is het meest vatbaar voor grootschalige schermen 6,7,8. C. elegans is buitengewoon krachtig geweest voor high-throughput screening van antischimmelmiddelen 9,10, het karakteriseren van virulentiefactoren7 en het identificeren van C. albicans-specifieke gastheerafweernetwerken11. Het aangeboren immuunsysteem in C. elegans heeft meerdere componenten die sterk geconserveerd zijn bij mensen12. Aangeboren afweer van de gastheer omvat de productie van antimicrobiële peptiden13 (AMP's) en reactieve zuurstofsoorten 14,15,16.

De ernst van C. albicans-infectie wordt voornamelijk gemeten aan de hand van de overleving van de gastheer, maar kan geen niet-letale virulentiefenotypes weergeven. Een vaak over het hoofd gezien aspect van de fitness van de gastheer is de voortplanting, maar verschillende onderzoeken suggereren dat C. albicans de voortplanting beïnvloedt door de levensvatbaarheid van het sperma te verminderen17,18, wat suggereert dat dit een belangrijk aspect kan zijn van de fitness van de gastheer om te bestuderen. Daarom is de impact van C. albicans-infectie op de vruchtbaarheid van de gastheer een nuttige manier om niet-dodelijke virulentiefenotypes te bestuderen. We hebben twee infectietesten ontwikkeld met behulp van C. elegans om zowel overlevings- als reproductiefenotypes bij gezonde gastheren te onderzoeken19,20. Hier beschrijven we zowel de vruchtbaarheids- als de afstammingsuitbreidingstesten. Vruchtbaarheid meet zowel het geproduceerde nageslacht als de overleving van individuele gastheren, en uitbreiding van de afstamming beoordeelt de gevolgen van infectie over drie gastgeneraties. We laten zien hoe deze testen kunnen worden gebruikt om C. albicans-deletiemutanten te screenen om zowel dramatische als subtiele verschillen in dodelijke en niet-dodelijke virulentiefenotypes vast te leggen.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. Voorbereidende stappen voor de experimenten

  1. Bereiding van C. albicans en Escherichia coli culturen
    OPMERKING: De stammen die in dit onderzoek zijn gebruikt, staan vermeld in tabel 1.
    1. Houd C. albicans - en E. coli-stammen als glycerolvoorraden bij -80 °C.
    2. Gebruik een steriele tandenstoker om de gewenste C. albicans-zeef op vaste gist pepton dextrose (YPD) (1% gistextract, 2% bactopepton, 2% glucose, 1,5% agar, 0,004% adenine, 0,008% uridine) te planten en 's nachts te laten groeien bij 30 °C.
      OPMERKING: Als de C. albicans-stam auxotroof is, vul de media dan aan met de nodige aminozuren.
    3. Inoculeer met behulp van een steriele lus of tandenstoker een enkele C. albicans-kolonie in 2 ml vloeibare YPD. Incubeer bij 30 °C en schud gedurende 24 uur.
    4. Streep met een steriele tandenstoker E. coli (OP50) op Luria-bouillon (LB; 10 g/L trypton, 5 g/L gistextract, 10 g/L NaCl, 15 g/L agar) agarplaten. Incubeer een nacht bij 30 °C.
    5. Inoculeer een enkele OP50-kolonie in 50 ml LB. Incubeer bij 30 °C en schud een nacht door.
  2. Preparaat van nematoden groeimedia
    1. Voeg in een kolf van 2 l 29 g poeder van nematodengroeimedia (NGM; 17,5 g/l agar, 3,0 g/l natriumchloride, 2,5 g/l Peptone, 0,005 g/l cholesterol) toe aan 1 l water en meng met een roerstaaf.
    2. Om overgroei van E. coli te remmen en de proliferatie van C. albicans mogelijk te maken, vult u NGM aan met 0,2 g/L streptomycinesulfaat na autoclaveren.
      OPMERKING: Als NGM wordt gebruikt voor het onderhoud van nematoden, is streptomycine niet vereist.
  3. Behoud van nematodenpopulaties
    1. Verdeel 300 μl nachtelijke E. coli-cultuur op geprepareerde NGM-agarplaten met behulp van een metaalstrooier. Deze techniek wordt zaaien genoemd.
    2. Laat de borden drogen bij kamertemperatuur (RT). Kweek de platen een nacht bij 30 °C.
    3. Houd de nematodenpopulatie in stand door elke 3-4 dagen op een nieuw gezaaide NGM-plaat met E. coli te hakken. Bewaren bij 20 °C. Chunking is een techniek die wordt gebruikt om snel een willekeurige populatie nematoden over te brengen naar een nieuw gezaaide plaat, waardoor populaties zich kunnen vermenigvuldigen. Gebruik hiervoor een steriele spatel om een klein vierkant (1 x 1 inch) uit de NGM-agarplaat te snijden. Breng het vierkant voorzichtig over op een nieuwe gezaaide NGM-plaat met de kant met de nematoden naar beneden gericht op de nieuwe agar8.
      OPMERKING: C. elegans die op 20 °C wordt gehouden, zal ~48 uur later nakomelingen produceren, wat nuttig is om rekening mee te houden bij het synchroniseren van een populatie nematoden. C. elegans die op 25 °C worden gehouden, zullen zich sneller ontwikkelen en voortplanten en populaties die op 15 °C worden gehouden, zullen langzamer groeien.
  4. Synchronisatie van nematodenpopulaties
    1. Begin met een bestaande nematodenpopulatie die op NGM/OP50 wordt onderhouden.
    2. Pipetteer ~3 ml M9-buffer op de NGM-plaat met nematoden. Was nematodeneieren van het bord en gebruik voorzichtig de punt van de pipet om eieren van de agar te schrapen (ze hebben de neiging om te plakken). Breng met behulp van een P1000-pipet de vloeistof met zowel eieren als wormen over in een conische buis van 15 ml. Om het aantal eieren dat nog op het bord ligt te beoordelen, gebruikt u een ontleedmicroscoop om naar de agar te kijken.
    3. Conisch centrifugeren gedurende 2 minuten bij 279 x g en RT.
    4. Verwijder de supernatant en zorg ervoor dat u de nematodenkorrel niet verstoort.
    5. Voeg 3 ml 25% bleekoplossing toe ("LET OP" bij het hanteren).
    6. Keer de buis 2 minuten om. Controleer met de ontleedmicroscoop of de nematoden dood zijn - ze zijn kaarsrecht en niet-beweeglijk.
      LET OP: Dit doodt alleen de bestaande nematoden. De integriteit van de eieren wordt niet aangetast.
    7. Centrifugeer gedurende 2 minuten bij 279 x g en RT.
    8. Verwijder het bovenstaande middel en suspendeer de korrel opnieuw in 3 ml M9.
    9. Centrifugeer gedurende 2 minuten bij 279 x g en RT.
    10. Verwijder het bovenstaande middel en suspendeer de pellet opnieuw in 300 μl M9.
    11. Controleer met een ontleedmicroscoop de concentratie van eieren door 5 μL eieren op een klein petriplaatje te pipetteren. De ideale concentratie zou tussen de 20-100 eieren moeten liggen. Als de cultuur te verdund is, concentreer de oplossing dan door centrifugeren en verwijderen van overtollige vloeistof. Als de cultuur te geconcentreerd is, voeg dan meer M9 toe totdat de gewenste concentratie is bereikt.
  5. Bereid C. albicans - en E. coli-culturen voor op nematodeninfectie (zaaien).
    1. Bereid een blanco oplossing voor. Meng in een cuvet 900 μL ddH2O en 100 μL vloeibare YPD.
    2. Plaats de cuvet in de spectrofotometer. Stel de golflengte in op 600 nanometer met behulp van de pijl omhoog. Klik op de knop "0 ABS 100% T" om de lege oplossing in te stellen.
    3. Meng in een nieuwe cuvet 900 μL ddH2O en 100 μL nachtgistcultuur. Haal de blanco oplossing uit de spectrofotometer en voeg de cuvet met de gistoplossing toe. Registreer de optische dichtheid die op het scherm wordt weergegeven (druk op geen enkele knop). Vermenigvuldig de waarde met 10 (de gemeten gistoplossing was een verdunning van 1:10).
    4. Normaliseer de cultuur tot 3,0 OD600/ml met ddH2O in een microcentrifugebuis van 1,5 ml. 1 OD600 is ongeveer 3 x 10-7 kve/ml21.
      OPMERKING: Als de OD600-waarde 6.7 , 3 OD/6.7 OD= 0.447 ml is, voeg dan 447 μL C. albicans-cultuur toe aan de microcentrifugebuis. Centrifugeer op maximale snelheid (16.873 x g) gedurende 30 s. Verwijder het bovenstaande en suspendeer opnieuw in 1 ml ddH2O.
    5. Breng de nachtelijke E. coli-cultuur over in een conische buis van 50 ml.
    6. Centrifugeer de cultuur op 279 x g gedurende 2 minuten bij RT.
    7. Aspireer een meerderheid van de supernatant op, waardoor ~ 1 ml overblijft.
    8. Resuspendeer de pellet in het resterende bovenstaande middel en breng over naar een vooraf gewogen microcentrifugebuis van 1,5 ml.
    9. Draai de microcentrifugebuis gedurende 30 s op maximale snelheid naar beneden.
    10. Gebruik een p1000-pipet om het bovenstaande te verwijderen en weeg de laatste pellet.
    11. Verdun E. coli tot 200 mg/ml in ddH2O.
    12. Gebruik mastermixberekeningen (tabel 2) en schaal op de juiste manier.

2. Vruchtbaarheidstest

OPMERKING: Representatieve gegevens worden weergegeven in aanvullende tabel 1 en een schema wordt weergegeven in afbeelding 1A.

  1. Verkrijg of prepareer het volgende: 35 mm x 10 mm petriplaten, NGM aangevuld met 0,2 g/l streptomycinesulfaat, E. coli OP50-cultuur, LB, C. albicans-cultuur , YPD, draadprik, M9-buffer (3,0 g/l KH2PO4, 6,0 g/l Na2HPO4, 0,5 g/l NaCl, 1,0 g/l NH4cl), Conische buizen van 15 ml.
    Twee dagen voor het experiment
  2. Inoculeer C. albicans-stammen in 2 ml YPD en E. coli (OP50) in 50 ml LB en laat 's nachts groeien bij 30 °C.
  3. Bereid 35 mm x 10 mm petriplaten voor met NGM aangevuld met 0,2 g/L streptomycinesulfaat. Het aantal voorbereide platen moet het hele experiment meegaan. Het aanbevolen aantal duplicaten is 10 per behandeling. Voor 10 replicaten worden 70 platen gebruikt. 1 L NGM is goed voor ~250 platen.
    Een dag voor het experiment
  4. Zaad 35 mm x 10 mm NGM-agarplaten aangevuld met streptomycine voor dag 0, dag 2 en dag 3 volgens het hierboven beschreven zaaiprotocol met de mastermixconcentratie (tabel 2). Pipetteer de juiste hoeveelheid mastermix op het midden van de plaat. Het verspreiden van de cultuur is niet nodig, omdat een enkele plek met microbiële groei voldoende is voor gastheervoeding en ons in staat stelt om gemakkelijk gastheren buiten het zaad te identificeren. Incubeer de platen een nacht bij RT.
    OPMERKING: De Day 0 mastermix bevat 50 μL "zaad" per replicaat voor elke experimentele behandeling. Dagen 2-7 omvatten 10 μL "zaad" per replicaat voor elke experimentele behandeling. Er is geen dag 1-plaat omdat nematoden 48 uur nadat ze zijn gesynchroniseerd met een dag 0-plaat het L4-stadium bereiken. Zodra ze L4 bereiken, worden individuele nematoden overgebracht naar platen op dag 2.
Voor 1 replicaatE. coli (OP50) controle conditieC. albicans & E. coli (OP50) behandelingsconditie
OP50H2OTotaalOP50C. albicansH2OTotaal
Dag 06,25 ul43,75 ul50 ul6,25 ul1,25 ul42,5 ul50 ul
Dagen 2-71,25 ul8,75 ul10 ul1,25 ul.25 ul8,5 ul10 ul

Tabel 2: Mastermix-volumes van E. coli- en C. albicans-culturen die nodig zijn om nematoden te infecteren voor de vruchtbaarheidstest.

Dag van het experiment (dag 0)

  1. Synchroniseer nematoden en plaats ~50 eieren op elke dag 0-replicatie van de controleplaten (alleen OP50) en behandelingsplaten (C. albicans + OP50). Incubeer gedurende 48 uur bij 20 °C.
    Dag 2
  2. Breng een enkel L4-nematode over door8 van de dag 0-plaat te plukken naar elk van de gerepliceerde dag 2-gezaaide platen. L4-gastheren zijn te herkennen aan een klein zakje in het midden van de dorsale zijde van hun lichaam22. Breng de uitgekomen en gerijpte nematoden over van hetzelfde type gezaaide plaat (d.w.z. L4-nematoden van D0-controleplaten moeten worden overgebracht naar controleplaten van dag 2).
  3. Inoculeer C. albicans-culturen die nodig zijn in 2 ml YPD en E. coli (OP50-stam) in 50 ml LB.
    Dag 3
  4. Breng nematoden over van platen van dag 2 naar platen met zaden van dag 3, waarbij elke replicaat wordt bijgehouden (d.w.z. replicaat A van dag 2 moet worden verplaatst naar de plaat Replicate A dag 3).
  5. Broed de platen van dag 2 (alleen met eieren) en dag 3 (met de enkele volwassene) uit bij 20 °C gedurende 24 uur.
  6. Zaad 35 mm x 10 mm NGM aangevuld met streptomycineplaten voor dag 4 en 5 met 10 μL mastermix per plaat (Tabel 2) en incubeer platen bij RT gedurende 24 uur.
    Dag 4
  7. Breng nematoden over van borden van dag 3 naar borden met zaden van dag 4.
  8. Incubeer de platen op dag 3 en dag 4 gedurende 24 uur bij 20 °C.
  9. Tel met behulp van een ontleedscoop het levensvatbare nageslacht voor elke plaat van dag 2. Noteer alle replica's die zijn overleden of niet meer op de plaat liggen (gecensureerd). Zodra het aantal nakomelingen is geregistreerd, worden de platen van dag 2 weggegooid.
    OPMERKING: Gecensureerd verwijst naar nematoden die op de plaat verdwijnen. Dit kan gebeuren wanneer nematoden van de plaat kruipen. Hoewel ze minder vaak voorkomen tijdens het 24-uursvenster, vallen de karkassen van dode nematoden uiteen in de agar, wat ook resulteert in censuur. Gecensureerde gegevens worden niet opgenomen in de uiteindelijke analyse van nakomelingschaps- en overlevingsgegevens.
  10. Inoculeer nieuwe culturen van C. albicans-stammen in 2 ml YPD en E. coli (OP50) in 50 ml LB.
    Dag 5
  11. Breng nematoden over van borden van dag 4 naar borden met zaden van dag 5.
  12. Incubeer de platen op dag 4 en dag 5 gedurende 24 uur bij 20 °C.
  13. Tel het levensvatbare nageslacht voor elke plaat op dag 3. Noteer alle replica's die zijn overleden of niet meer op de plaat liggen (gecensureerd). Zodra het aantal nakomelingen is geregistreerd, gooit u de platen van dag 3 weg.
  14. Zaad 35 mm x 10 mm NGM aangevuld met streptomycineplaten voor dag 6 en 7 met 10 μL mastermix per plaat (Tabel 2) en incubeer platen bij kamertemperatuur gedurende 24 uur.
    Dag 6
  15. Breng nematoden over van borden van dag 5 naar borden met zaden van dag 6.
  16. Incubeer de platen op dag 5 en dag 6 gedurende 24 uur bij 20 °C.
  17. Tel het levensvatbare nageslacht voor elke plaat op dag 4. Noteer alle replica's die zijn overleden of niet meer op de plaat liggen (gecensureerd). Zodra het aantal nakomelingen is geregistreerd, gooi u de platen van dag 4 weg.
    Dag 7
  18. Breng nematoden over van borden van dag 6 naar borden met zaden van dag 7.
  19. Incubeer de platen op dag 6 en dag 7 gedurende 24 uur bij 20 °C.
  20. Tel het levensvatbare nageslacht voor elke dag 5 plaat. Noteer alle replica's die zijn overleden of niet meer op de plaat liggen (gecensureerd). Zodra het aantal nakomelingen is geregistreerd, gooit u de platen van dag 5 weg.
    Dag 8
  21. Tel het levensvatbare nageslacht voor elke plaat op dag 6. Noteer alle replica's die zijn overleden of niet meer op de plaat liggen (gecensureerd). Zodra het aantal nakomelingen is geregistreerd, worden de platen van dag 6 weggegooid.
    Dag 9
  22. Tel het levensvatbare nageslacht voor elke dag 7 plaat. Tel de grootste nematode (ouder) niet mee. Noteer alle replica's die zijn overleden of niet meer op de plaat liggen (gecensureerd). Zodra het aantal nakomelingen is geregistreerd, worden de platen van dag 7 weggegooid.
    OPMERKING: Deze test kan ook worden gebruikt om de overleving te beoordelen. Noteer wanneer elke nematode stierf. Aan het einde van het experiment kan het percentage nematoden dat het zevendaagse experiment heeft overleefd voor elke behandeling worden vergeleken. Nematoden kruipen soms weg van de voedsel-/ziekteverwekkerbron en proberen de dia's van de petriplaat te beklimmen. Controleer alle delen van de plaat voordat u verder gaat. Dode nematoden laten over het algemeen een karkas achter. Censureer elke nematode die niet kan worden gevonden en beschouw die nematode niet als dood. Neem geen gecensureerde gegevens mee in de uiteindelijke analyse van het nageslacht en de overleving.
  23. Analyseer gegevens voor broedgrootte en late voortplanting met behulp van eenrichtings-ANOVA of Kruskal-Wallis, afhankelijk van de normaliteit van de datasets, evenals post-hoc Tukey/Dunn's meervoudige testen om significante verschillen tussen de behandelingsgroepen te identificeren met behulp van GraphPad Prism-software. Detecteer verschillen tussen overlevingscurves met behulp van de Wilcoxon log-rank test.

3. Assay voor uitbreiding van de afstamming

OPMERKING: Representatieve gegevens worden weergegeven in aanvullende tabel 2 en een schema wordt weergegeven in afbeelding 2A.

  1. Verkrijg of bereid het volgende: 100 mm x 15 mm petriplaten die NGM-agar bevatten, aangevuld met 0,2 g/l streptomycinesulfaat, E. coli OP50-culturen, LB, C. albicans-culturen , YPD, M9-buffer, draadpick, conische buizen van 15 ml.
    Dag -2
  2. Inoculeer C. albicans-stammen in 2 ml YPD en E. coli (OP50) in 50 ml LB en laat 's nachts groeien bij 30 °C.
    Dag -1
  3. Zaad 100 mm x 15 mm NGM-agarplaten aangevuld met streptomycine met 300 μL mastermix per plaat (Tabel 3). Verdeel de mastermix op de plaat met behulp van een steriele metalen spreider. Incubeer de platen een nacht bij 30 °C. Zes replicaten per behandeling worden aanbevolen. Bereid dus zeven platen voor (één plaat voor gesynchroniseerde nematoden, zes platen voor elke volwassen nematode) per behandeling.
E. coli (OP50) controle conditieC. albicans & E. coli (OP50). Behandeling voorwaarde
Voor 1 replicaatOP50H2OTotaalOP50C. albicansH2OTotaal
1,25 ul8,75 ul10 ul37,5 ul7,5 ul255 ul300 ul

Tabel 3: Mastermix-volumes van E. coli- en C. albicans-culturen die nodig zijn om nematoden te infecteren voor de afstammingsuitbreidingstest.

Groei van de nematodenpopulatie: dag 0

  1. Synchroniseer nematoden en leg 10-25 eieren op een enkele plaat voor elke controle (alleen OP50) en behandeling (C. albicans + OP50) en broed gedurende 48 uur bij 20 °C.
    Dag 2:
  2. Breng een enkele L4-worm over van elke controle- en behandelingsplaat op dag 0 op gezaaide platen van dezelfde behandeling. L4-gastheren zijn te herkennen aan een klein zakje in het midden van de dorsale zijde van hun lichaam22.
  3. Incubeer gedurende 5 dagen bij 20 °C (in totaal een week na synchronisatie).
    Dag 7:
  4. Was met behulp van een p1000-pipet de hele nematodenpopulatie van elke plaat met 5 ml M9-buffer en breng over naar een conische buis van 15 ml.
  5. Bewaar gedurende 1 uur bij 4 °C om de nematoden te laten bezinken en gemakkelijker te tellen.
  6. Verdun elke conische tot het uiteindelijke volume van 10 ml met M9-buffer.
  7. Tel voor elke biologische replicaat het aantal nematoden in een aliquot van 20 μl. Herhaal dit om 6 technische replicaten te verkrijgen voor elke biologische replicaat. Terugrekenen om de totale populatiegrootte te bepalen. Als de monsters te verdund zijn (d.w.z. minder dan 10 nematoden per monster), concentreer de populatie dan in een kleiner volume M9-buffer.
    OPMERKING: Centrifugeren van levende nematoden is niet schadelijk voor de nematoden.
    Voorbeeld berekening:
    70 gastheren = X (Totaal aantal gastheren)
    20 μL (aliquot) 10.000μL (totaal volume)
  8. Analyseer gegevens voor uitbreiding van de afstamming met behulp van eenrichtings-ANOVA of Kruskal-Wallis, afhankelijk van de normaliteit van de datasets, evenals post-hoc Tukey/Dunn's meervoudige testen om significante verschillen tussen de behandelingsgroepen te identificeren met behulp van GraphPad Prism-software.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Resultaten

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Hier presenteren we twee testen die de virulentie van C. albicans meten als een niet-dodelijk fenotype met C. elegans als infectiemodel. De eerste test, vruchtbaarheid, controleert hoe C. albicans-infectie individuele gastheren beïnvloedt voor de productie en overleving van het nageslacht. De tweede test, uitbreiding van de afstamming, meet hoe C. albicans-infectie de populatiegroei over meerdere generaties beï...

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Discussie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Hier presenteren we twee eenvoudige testen die de virulentie van schimmels meten. Beide testen maken gebruik van C. elegans als een gastheersysteem dat monitoring omvat voor zowel letale als niet-letale gastheerfenotypes. Vruchtbaarheidstesten onderzoeken bijvoorbeeld het reproductieve succes van individuele geïnfecteerde gastheren en meten tegelijkertijd de individuele overleving. De dagelijkse monitoring geeft niet alleen de totale broedgrootte weer, maar ook de reproductieve ...

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Openbaarmakingen

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

De auteurs hebben geen concurrerende belangen om bekend te maken.

Dankbetuigingen

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

We danken Dorian Feistel, Rema Elmostafa en McKenna Penley voor hun hulp bij het ontwikkelen van onze testen en gegevensverzameling. Dit onderzoek wordt ondersteund door NSF DEB-1943415 (MAH).

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel
NaamBedrijfCatalogusnummerOpmerkingen
1.5 mL eppendorf microtubes 3810XMillipore SigmaZ606340
100 mm x 15 mm petrischalenSigma-AldrichP5856-500EA
15 mL Falcon ConicalsFisher Scientific14-959-70C
50 mL Falcon ConicalsFisher Scientific14-432-22
AdenineMillipore SigmaA8626
Agar (gegranuleerd, bacteriologisch kwaliteit)Apex BioResearch Produces20-248
Aluminiumdraad (95% Pt, 32 Gauge)Genesee Scientific59-1M32P
Ammonium ChlorideMillipore Sigma254134
Bacteria Cell SpreaderSP Scienceware21TP50
BactoPeptoneFisher BioReagentsBP1420-500
Wegwerp kweekbuizen (20 x 150 mm)FIsherBrand14-961-33
Dissectiemicroscoop (NI-150 High Intensity Illuminator)Nikon Instrument Inc.
E. coliCaenorhabditis Genetics CenterOP50
GlucoseMillipore Sigma50-99-7
Medium Petri Dishes (35 X 10 mm)Falcon353001
Metaal SpatulaSP Scienceware8TL24
Nematode Growth Media (NGM)Dot ScientificDSN81800-500
Kaliumfosfaat monobasicSigmaP0662-500G
Natrium ChlorideFisher ScientificBP358-1
NatriumfosfaatFisher ScientificBP332-500
Streptomycin SulfateThermo-Fisher Scientific11860038
TryptoneMillipore Sigma91079-40-2
UridineMillipore SigmaU3750
Wildtype C. elegansCaenorhabditis Genetics CenterN2
Gist ExtractMillipore Sigma8013-01-2

Referenties

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Underhill, D. M., Iliev, I. D. The mycobiota: interactions between commensal fungi and the host immune system. Nature Reviews Immunology. 14 (6), (2014).
  2. Ibrahim, A. S., Filler, S. G., Sanglard, D., Edwards, J. E., Hube, B. Secreted Aspartyl Proteinases and Interactions of Candida albicans with Human Endothelial Cells. Infection and Immunity. 66 (6), 3003-3005 (1998).
  3. Calderone, R. A., Fonzi, W. A. Virulence factors of Candida albicans. Trends in Microbiology. 9 (7), 327-335 (2001).
  4. Mayer, F. L., Wilson, D., Hube, B. Candida albicans pathogenicity mechanisms. Virulence. 4 (2), 119-128 (2013).
  5. Chin, V., Lee, T., Rusliza, B., Chong, P. Dissecting Candida albicans Infection from the Perspective of C. albicans Virulence and Omics Approaches on Host-Pathogen Interaction: A Review. International Journal of Molecular Sciences. 17 (10), 1643(2016).
  6. Elkabti, A., Issi, L., Rao, R. Caenorhabditis elegans as a Model Host to Monitor the Candida Infection Processes. Journal of Fungi. 4 (4), 123(2018).
  7. Arvanitis, M., Glavis-Bloom, J., Mylonakis, E. Invertebrate models of fungal infection. Biochimica et biophysica acta. 1832 (9), 1378-1383 (2013).
  8. Issi, L., Rioux, M., Rao, R. The Nematode Caenorhabditis Elegans - A Versatile Vivo Model to Study Host-microbe Interactions. Journal of Visualized Experiments. (128), e56487(2017).
  9. Breger, J., et al. Antifungal Chemical Compounds Identified Using a C. elegans Pathogenicity Assay. PLoS Pathogens. 3 (2), 18(2007).
  10. Okoli, I., et al. Identification of antifungal compounds active against Candida albicans using an improved high-throughput Caenorhabditis elegans assay. PloS one. 4 (9), 7025(2009).
  11. Pukkila-Worley, R., Ausubel, F. M., Mylonakis, E. Candida albicans Infection of Caenorhabditis elegans Induces Antifungal Immune Defenses. PLoS Pathogens. 7 (6), 1002074(2011).
  12. Kim, D. H., Ausubel, F. M. Evolutionary perspectives on innate immunity from the study of Caenorhabditis elegans. Current Opinion in Immunology. 17 (1), 4-10 (2005).
  13. Kim, D. H., et al. A Conserved p38 MAP Kinase Pathway in Caenorhabditis elegans Innate Immunity. Science. 297 (5581), 623-626 (2002).
  14. van der Hoeven, R., McCallum, K. C., Cruz, M. R., Garsin, D. A. Ce-Duox1/BLI-3 Generated Reactive Oxygen Species Trigger Protective SKN-1 Activity via p38 MAPK Signaling during Infection in C. elegans. PLoS Pathogens. 7 (12), 1002453(2011).
  15. van der Hoeven, R., Cruz, M. R., Chávez, V., Garsin, D. A. Localization of the Dual Oxidase BLI-3 and Characterization of Its NADPH Oxidase Domain during Infection of Caenorhabditis elegans. PLOS ONE. 10 (4), 0124091(2015).
  16. Chávez, V., Mohri-Shiomi, A., Garsin, D. A. Ce-Duox1/BLI-3 Generates Reactive Oxygen Species as a Protective Innate Immune Mechanism in Caenorhabditis elegans. Infection and Immunity. 77 (11), 4983-4989 (2009).
  17. Vander, H., Prabha, V. Evaluation of fertility outcome as a consequence of intravaginal inoculation with sperm-impairing micro-organisms in a mouse model. Journal of Medical Microbiology. 64, Pt_4 344-347 (2015).
  18. Castrillón-Duque, E. X., Suárez, J. P., Maya, W. D. C. Yeast and Fertility: Effects of In Vitro Activity of Candida spp. on Sperm Quality. Journal of Reproduction & Infertility. 19 (1), 49-55 (2018).
  19. Feistel, D. J., et al. A Novel Virulence Phenotype Rapidly Assesses Candida Fungal Pathogenesis in Healthy and Immunocompromised Caenorhabditis elegans Hosts. mSphere. 4 (2), (2019).
  20. Feistel, D. J., Elmostafa, R., Hickman, M. A. Virulence phenotypes result from interactions between pathogen ploidy and genetic background. Ecology and Evolution. 10 (17), 9326-9338 (2020).
  21. Mitchell, B. M., Wu, T. G., Jackson, B. E., Wilhelmus, K. R. Candida albicans Strain-Dependent Virulence and Rim13p-Mediated Filamentation in Experimental Keratomycosis. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 48 (2), 774-780 (2007).
  22. Altun, Z. F., Hall, D. H. WormAtas Hermaphrodite Handbook - Introduction. WormAtlas. , (2006).
  23. Yuan, X., Mitchell, B. M., Hua, X., Davis, D. A., Wilhelmus, K. R. The RIM101 Signal Transduction Pathway Regulates Candida albicans Virulence during Experimental Keratomycosis. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 51 (9), 4668-4676 (2010).
  24. Davis, D., Edwards, J. E., Mitchell, A. P., Ibrahim, A. S. Candida albicans RIM101 pH Response Pathway Is Required for Host-Pathogen Interactions. Infection and Immunity. 68 (10), 5953-5959 (2000).
  25. Chamilos, G., et al. Candida albicans Cas5, a Regulator of Cell Wall Integrity, Is Required for Virulence in Murine and Toll Mutant Fly Models. The Journal of Infectious Diseases. 200 (1), 152-157 (2009).
  26. Bruno, V. M., et al. Control of the C. albicans Cell Wall Damage Response by Transcriptional Regulator Cas5. PLoS Pathogens. 2 (3), 21(2006).
  27. Davis, D. Adaptation to environmental pH in Candida albicans and its relation to pathogenesis. Current Genetics. 44 (1), 58(2003).
  28. Jain, C., Yun, M., Politz, S. M., Rao, R. P. A Pathogenesis Assay Using Saccharomyces cerevisiae and Caenorhabditis elegans Reveals Novel Roles for Yeast AP-1, Yap1, and Host Dual Oxidase BLI-3 in Fungal Pathogenesis. Eukaryotic Cell. 8 (8), 1218-1227 (2009).
  29. De, A., Sahu, A. K., Singh, V. Bite size of Caenorhabditis elegans regulates feeding, satiety and development on yeast diet. bioRxiv. , 473256(2018).
  30. Pukkila-Worley, R., Ausubel, F. M. Immune defense mechanisms in the Caenorhabditis elegans intestinal epithelium. Current Opinion in Immunology. 24 (1), 3-9 (2012).
  31. Smith, A. C., Hickman, M. A. Host-Induced Genome Instability Rapidly Generates Phenotypic Variation across Candida albicans Strains and Ploidy States. mSphere. 5 (3), 00433(2020).
  32. Palominos, M. F., Calixto, A. Quantification of Bacteria Residing in Caenorhabditis elegans Intestine. BIO-PROTOCOL. 10 (9), (2020).
  33. Marsh, E. K., May, R. C. Caenorhabditis elegans, a Model Organism for Investigating Immunity. Applied and Environmental Microbiology. 78 (7), 2075-2081 (2012).
  34. Liberati, N. T., et al. Requirement for a conserved Toll/interleukin-1 resistance domain protein in the Caenorhabditis elegans immune response. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 101 (17), 6593-6598 (2004).

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Herprints en machtigingen

Toestemming aanvragen om de tekst of afbeeldingen van dit JoVE-artikel te hergebruiken

Toestemming aanvragen

Trefwoorden

Candida albicansvruchtbaarheidsassaylineage expansiereproductie van de gastheerpopulatiegroeimini modelsystemen
Video binnenkort beschikbaar

Gerelateerde artikelen