Method Article

Visualiseren en kwantificeren van endonuclease-gebaseerde site-specifieke DNA-schade

DOI:

10.3791/62175

⸱

August 21st, 2021

 ,  ,  , 
1Institute of Pathology, Faculty of Medicine, University of Szeged

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Dit artikel introduceert essentiële stappen van immunostaining en chromatine immunoprecipitatie. Deze protocollen worden vaak gebruikt om DNA-schadegerelateerde cellulaire processen te bestuderen en om de rekrutering van eiwitten die betrokken zijn bij DNA-reparatie te visualiseren en te kwantificeren.

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Cellen worden continu blootgesteld aan verschillende DNA-schadelijke stoffen, waardoor verschillende cellulaire reacties worden afgeleid. Het toepassen van biochemische en genetische benaderingen is essentieel bij het onthullen van cellulaire gebeurtenissen die verband houden met de rekrutering en assemblage van DNA-reparatiecomplexen op de plaats van DNA-schade. In de afgelopen jaren zijn verschillende krachtige tools ontwikkeld om plaatsspecifieke DNA-schade te veroorzaken. Bovendien stellen nieuwe baanbrekende technieken ons in staat om deze processen op het niveau van de resolutie van één cel te bestuderen met behulp van zowel vaste als levende cellen. Hoewel deze technieken zijn gebruikt om verschillende biologische processen te bestuderen, presenteren we hierin de meest gebruikte protocollen op het gebied van DNA-reparatie, Fluorescentie Immunostaining (IF) en Chromatine Immunoprecipitatie (ChIP), die in combinatie met endonuclease-gebaseerde site-specifieke DNA-schade het mogelijk maken om de genomische bezetting van DNA-reparatiefactoren op een gerichte en gereguleerde manier te visualiseren en te kwantificeren, respectievelijk. Deze technieken bieden krachtige instrumenten voor de onderzoekers om nieuwe eiwitten te identificeren die gebonden zijn aan de beschadigde genomische locus, evenals hun post-translationele modificaties die nodig zijn voor hun fine-tune regulatie tijdens DNA-reparatie.

Introduction

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Ons genoom wordt voortdurend uitgedaagd door verschillende DNA-schadelijke stoffen. Deze aanvallen kunnen afkomstig zijn van omgevingsbronnen, zoals UV-licht of bestraling, evenals van endogene bronnen, zoals metabolische bijproducten veroorzaakt door oxidatieve stress of replicatiefouten1,2. Deze laesies kunnen de integriteit van een of beide DNA-strengen beïnvloeden, en als de gegenereerde fouten persistent worden, leidt dit vaak tot translocaties en genoominstabiliteit, wat kan leiden tot tumorigenese3,4. Om de genoomintegriteit te behouden, zijn ti....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. Immunodetection van specifieke eiwitten

  1. Voorbereiding van celkweek en experimentele opstelling
    1. Onderhoud U2OS-cellen in monolagen in DMEM-kweekmedium aangevuld met 10% foetale kalfsserum, 2 mM glutamine en 1% antibiotica-antimycotische oplossing.
      OPMERKING: Gebruik voor op endonuclease gebaseerde DNA-schade inductie met houtskool of een steroïdvrij medium om systeemlekken te voorkomen.
    2. Kweek cellen in een bevochtigde 5% CO2-omgeving bij 37 °C tot 80% samenvloeiing, waarbij het medium elke 2-3 dagen wordt vernieuwd.
    3. Aspireer het medium en was de cellen met 1x PBS. Maak cellen los met trypsine-E....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Results

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Het bestuderen van site-gestuurde DSB-geïnduceerde reparatieprocessen in cellen kan worden bereikt via stabiele of voorbijgaande transfectie. Er moet echter worden opgemerkt dat stabiele transfectie zorgt voor een homogene celpopulatie, die een uniforme en dus betrouwbaardere cellulaire respons geeft. In het geval van transfectie neemt slechts een klein deel van de celpopulatie het plasmide op en handhaaft het, wat diversiteit in het experiment introduceert. Voor het opzetten van ER-I-PpoI- of ER-AsiSI-endonuclease-gebas.......

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Discussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Hoewel DNA-reparatie een relatief recent onderzoeksveld is, breidt onze kennis zich snel uit met behulp van verschillende biochemische en microscopische methoden. Het behoud van genetische informatie is cruciaal voor cellen, omdat mutaties in genen die betrokken zijn bij reparatieprocessen een van de belangrijkste oorzaken van tumorigenese zijn en daarom is het ophelderen van de belangrijkste stappen van DNA-reparatieroutes essentieel.

Biochemische technieken (d.w.z. westerse vlek, immunopreci.......

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Acknowledgements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Dit onderzoek werd gefinancierd door het Nationaal Bureau voor Onderzoek, Ontwikkeling en Innovatie ginop-2.3.2-15-2016-00020, GINOP-2.3.2-15-2016-00036, GINOP-2.2.1-15-2017-00052, EFOP 3.6.3-VEKOP-16-2017-00009, NKFI-FK 132080, de János Bolyai Research Scholarship van de Hongaarse Academie van Wetenschappen BO/27/20, ÚNKP-20-5-S

....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
4-OHTSigma AldrichH7904
AgaroseLonza50004
Antibiotic-Antimycotic Solution (100×), StabilizedSigma AldrichA5955
Anti-gamma H2A.X (phospho S139) antibodyAbcamab26350
Bovine Serum Fraction V albuminBioseraPM-T1725
TrackIt™ Cyan/Yellow Loading BufferThermo Fisher Scientific10482035
DMEM with 1.0 g/L Glucose, without L-GlutamineLonza12-707F
DoxycyclineSigma AldrichD9891
Dynabeads™ M-280 Sheep Anti-Mouse IgGInvitrogen11202D
Dynabeads™ M-280 Sheep Anti-Rabbit IgGInvitrogen11204D
EDTASigma AldrichE6758
EGTASigma AldrichE3889
EthanolMolar Chemicals02910-101-340
Fetal Bovine Serum (South America Origin), EU-approvedGibcoECS0180L
Formaldehyde 37% solution free from acidSigma Aldrich1.03999
GlutaMAX™ SupplementThermo Fisher Scientific35050038
GlycineSigma Aldrich50046
IPure kit v2DiagenodeC03010015
Isoamyl alcoholSigma AldrichW205702
LiClSigma AldrichL9650
NaClSigma AldrichS5886
Na-DOCSigma AldrichD6750
NaHCO3Sigma AldrichS5761
Neocarzinostatin from Streptomyces carzinostaticusSigma AldrichN9162
NP-40Sigma AldrichI8896
PBS Powder without Ca2+, Mg2+Sigma AldrichL182-50-BC
PhenolSigma AldrichP4557
PIPESSigma AldrichP1851
Polysorbate 20 (Tween 20)Molar Chemicals09400-203-190
KClSigma AldrichP5405
ProLong™ Gold Antifade Mountant with DAPIThermo Fisher ScientificP36935
Protease Inhibitor Cocktail Set IRoche11873580001
Proteinase KSigma AldrichP2308
P-S2056 DNAPKcs antibodyAbcamab18192
RNase ARoche10109169001
CH3COONaSigma AldrichS2889
SDSSigma AldrichL3771
Tris Acetate-EDTA bufferSigma AldrichT6025
Tris-HClSigma Aldrich91228
TRITON X-100Molar Chemicals09370-006-340
Trypsin from porcine pancreasSigma AldrichT4799
Trypsin-EDTA (0.5%), no phenol redGibco15400054

References

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Borsos, B. N., Majoros, H., Pankotai, T. Ubiquitylation-Mediated Fine-Tuning of DNA Double-Strand Break Repair. Cancers (Basel). 12 (6), (2020).
  2. Borsos, B. N., Majoros, H., Pankotai, T. Emerging Roles of Post-Translational Modifications in Nucleotide Excision Repair.<....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Tags

Site Specific DNA DamageDNA RepairChromatin ImmunoprecipitationFluorescence ImmunostainingDouble Strand BreaksProtein RecruitmentPost Translational ModificationsSingle Cell ResolutionWestern BlotSuper Resolution Microscopy

Related Articles