Hier presenteren we een protocol om de CLARITY-methode van de hersenweefsels aan te passen voor volledig gemonteerde retinas om de kwaliteit van standaard immunohistochemische kleuring en hoge resolutie beeldvorming van retinale neuronen en hun subcellulaire structuren te verbeteren.
Een abonnement op JoVE is vereist om deze inhoud te bekijken. Log in of start vandaag met uw gratis proefperiode.
Methodenartikel
Immunostaining van Whole-Mount Retinas met de CLARITY Tissue Clearing Method
In dit artikel
Samenvatting
Samenvatting
De weefselhydrogeldelipidatiemethode (CLARITY), oorspronkelijk ontwikkeld door het Deisseroth-laboratorium, is gewijzigd en wordt veel gebruikt voor immunostaining en beeldvorming van dikke hersenmonsters. Deze geavanceerde technologie is echter nog niet gebruikt voor volledig gemonteerde retina's. Hoewel het netvlies gedeeltelijk transparant is, beperkt de dikte van ongeveer 200 μm (bij muizen) nog steeds de penetratie van antilichamen in het diepe weefsel en vermindert het de lichtpenetratie voor beeldvorming met hoge resolutie. Hier hebben we de CLARITY-methode voor het netvlies van de muis in zijn geheel aangepast door ze te polymeriseren met een acrylamidemonomeer om een nanoporeuze hydrogel te vormen en ze vervolgens te verwijderen in natriumdodecylsulfaat om eiwitverlies te minimaliseren en weefselschade te voorkomen. CLARITY-verwerkte retinas werden immunostained met antilichamen voor retinale neuronen, gliacellen en synaptische eiwitten, gemonteerd in een refractieve index matching oplossing, en afgebeeld. Onze gegevens tonen aan dat CLARITY de kwaliteit van standaard immunohistochemische kleuring en beeldvorming voor retinale neuronen en gliacellen in de hele montering kan verbeteren. Bijvoorbeeld, 3D-resolutie van fijne axon-achtige en dendritische structuren van dopaminerge amacrine cellen werden veel verbeterd door CLARITY. In vergelijking met niet-verwerkte retina's met hele monturen kan CLARITY immunostaining onthullen voor synaptische eiwitten zoals postsynaptisch dichtheidseiwit 95. Onze resultaten tonen aan dat CLARITY het netvlies optisch transparanter maakt na het verwijderen van lipiden en fijne structuren van retinale neuronen en hun eiwitten behoudt, die routinematig kunnen worden gebruikt voor het verkrijgen van beeldvorming met hoge resolutie van retinale neuronen en hun subcellulaire structuren in de voorbereiding van de hele berg.
Inleiding
Het gewervelde netvlies is misschien wel het meest toegankelijke deel van het centrale zenuwstelsel (CZS) en dient als een uitstekend model voor het bestuderen van de ontwikkeling, structuur en functie van de hersenen. Vijf klassen neuronen in het netvlies zijn verdeeld in drie nucleaire lagen gescheiden door twee plexivormlagen. De buitenste kernlaag (ONL) bestaat uit klassieke fotoreceptoren (staven en kegels) die licht omzetten in elektrische signalen. Elektrische signalen worden verwerkt door neuronen in de binnenste nucleaire laag (INL), waaronder bipolaire, horizontale en amacrinecellen, en vervolgens overgebracht naar retinale ganglioncellen (RGCs) in de ganglioncellaag (GCL). RGC's zijn de outputneuronen van het netvlies, waarbij de axonen naar de hersenen projecteren om bij te dragen aan beeldvormende en niet-beeldvormende visuele functie. Bovendien leveren drie soorten gliacellen (Muller-cellen, astroglia en microglia) voedingsstoffen aan neuronen en beschermen neuronen tegen schadelijke veranderingen in hun extracellulaire omgeving.
Een gespecialiseerde subpopulatie van amacrinecellen produceert en geeft dopamine vrij, een belangrijke neuromodulator in het CZS, die retinale neurale circuits herconfigureert tijdens lichtaanpassing1,2. Dopaminerge amacrinecellen (DAC's) hebben een uniek kenmerk van morfologische profielen. Hun somata bevinden zich in de proximale INL met dendrieten die rammen in het meest distale deel van de binnenste plexivormlaag (IPL). Axon-achtige processen van DAC's zijn ongemyelineerd, dun en lang, schaars vertakt en dragen spataderen (de plaatsen van dopamine-afgifte). Ze vormen een dichte plexus met dendrieten in de IPL, inclusief ringachtige structuren rond de somata van AII amacrinecellen. De axonen lopen ook door de INL naar de OPL en vormen een centrifugale route over het netvlies3. We hebben aangetoond dat DAC-processen receptoren uitdrukken als reactie op glutamaatafgifte uit presynaptische neuronen, waaronder bipolaire cellen en intrinsiek lichtgevoelige retinale ganglioncellen (ipRGCs)4,5,6. Het is echter onduidelijk of glutamaatreceptoren zich uitdrukken op de axonen, dendrieten of beide, omdat ze zijn afgesneden in verticale retinale secties en niet van elkaar kunnen worden onderscheiden5,6. Immunostaining moet worden uitgevoerd in volledig gemonteerde netvliezen om driedimensionale vertakking van DAC's en de aanwezigheid van glutamaatreceptoren op subcellulaire compartimenten aan het licht te komen. Hoewel het netvlies relatief transparant is, is de dikte van een muis volledig gemonteerd netvlies ongeveer 200 μm, wat de penetratie van antilichamen in het diepe weefsel beperkt en de lichtpenetratie vermindert voor beeldvorming met hoge resolutie als gevolg van weefsellichtverstrooiing. Om deze beperkingen te overwinnen, hebben we de immunostaining compatibele weefselhydrogel delipidatiemethode (CLARITY) die onlangs is ontwikkeld voor dikke hersensecties, aangepast aan het netvlies van de muis7.
De CLARITY-methode is oorspronkelijk ontwikkeld door het Deisseroth-laboratorium voor immunostaining en beeldvorming van dikke hersenmonsters7. Het maakt gebruik van een sterk reinigingsmiddel, natriumdodecylsulfaat (SDS) en elektroforese om de lipidecomponenten te verwijderen (die weefsellichtverstrooiing veroorzaken), waardoor de eiwitten en nucleïnezuren op hun plaats blijven. De verwijderde lipiden worden vervangen door een transparante steiger bestaande uit hydrogelmonomeren zoals acrylamide ter ondersteuning van de resterende eiwitstructuur. Het gewiste weefsel kan worden geëtiketteerd via immunohistochie en afgebeeld met aanzienlijk verhoogde lichtpenetratiediepte door het weefsel (tot enkele millimeters onder het weefseloppervlak). Sindsdien is de CLARITY-methode geoptimaliseerd en vereenvoudigd door verschillende onderzoeksgroepen8,9,10. Een gewijzigd CLARITY-protocol maakt gebruik van een passieve clearingtechniek om de mogelijke weefselschade veroorzaakt door elektroforese te voorkomen voor het opruimen van de hele hersenen en andere intacte organen11. Deze methode is echter nog niet toegepast op retina's met hele montering. Hier hebben we de passieve CLARITY-techniek voor volledig gemonteerde retina's aangepast om ze transparanter te maken voor immunohistochie en beeldvorming. We ontdekten dat een meerderheid van de geteste retinale eiwitten tijdens dit proces werd bewaard voor immunohistochgie. Met behulp van de refractieve index matching oplossing, waren we in staat om retinale neuronen in beeld te brengen over de ongeveer 200 μm dikte van de ONL naar de GCL in hele retinas.
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Protocol
Muizenzorg en alle experimentele procedures werden uitgevoerd volgens de richtlijnen van de National Institutes of Health voor proefdieren en werden goedgekeurd door de Institutional Animal Care and Use Committees van Oakland University (protocol nr. 18071).
OPMERKING: De namen van de oplossingen en hun samenstellingen zijn opgenomen in tabel 1.
1. Weefselvoorbereiding
- Euthanaseer de muis met een overdosis CO2,gevolgd door cervicale dislocatie.
- Maak de ogen met gebogen tangen en breng ze over in een kleine petrischaal met 0,1 M PBS (tabel 1). Prik onder een dissectiemicroscoop een klein gaatje langs de hoornvlies-sclera-verbinding met een naald. Breng gedurende 1 uur over op 4% paraformaldehyde (PFA).
- Breng het oog terug naar een schaal met PBS. Gebruik onder een dissectiemicroscoop een dissectieschaar om helemaal rond de hoornvlies-sclera-kruising te snijden. Verwijder het hoornvlies en de lens. Snijd aan de basis van de oogzenuw en pel de sclera voorzichtig af met een tang om het netvlies te isoleren.
- Maak vier kleine sneetjes gelijkmatig rond het netvlies en gebruik een fijne tipborstel gedrenkt in PBS om het plat (GCL-kant naar beneden) in een klaverachtige vorm op een kleine vierkante snede van nitrocellulosefilterpapier te leggen om het netvlies te stabiliseren.
- Breng het netvlies over met een tang om de hoek van het nitrocellulosepapier vast te houden (zonder het gemonteerde netvlies aan te raken) en plaats het gedurende 1 uur in een 48-putplaat met 4% PFA.
- Breng het filterpapier en netvlies over in een put met PBS en was (elk 3x gedurende 5 min).
- Breng over naar A4P0 (tabel 1) en incubeer 's nachts bij 4 °C met zachte agitatie.
- Pipet plantaardige olie in de put om de A4P0-oplossing volledig te bedekken. Incubeer gedurende 3 uur in een waterbad bij 40 °C zonder te schudden.
- Was (3x voor elk 5 min) in PBS en zorg ervoor dat alle olie is afgespoeld. Gebruik indien nodig een pipet om de resterende olie voorzichtig van de bovenkant van de put te verwijderen voordat u de laatste spoeling laat doen.
- Incubeer in 10% SDS bij 40 °C gedurende twee dagen met zacht schudden. Vervang SDS door verse oplossing op de tweede dag.
- Breng het filterpapier en netvlies over naar PBS met Triton-X-100 (PBST, tabel 1)en was (elk 5x gedurende 1,5 uur).
- Bewaren bij 4 °C in PBST met 0,01% natrium azide (NaN3) of direct overgaan op immunostaining.
2. Immunostaining en brekingsindex matching
- Verwijder het netvlies van het filterpapier door het voorzichtig af te pellen met een fijnpenseel in PBST.
- Incubeer het netvlies in primair antilichaam (Tabel 2) verdund in blokkeeroplossing (Tabel 1) gedurende 2 dagen bij 40 °C met zacht schudden.
- Wassen (5x, elk 1,5 uur) in PBST.
- Incubeer met de juiste secundaire antilichamen (tabel 3) verdund in blokkeeroplossing gedurende 2 dagen bij 40 °C met zacht schudden en beschermen tegen licht gedurende de rest van de procedure.
- Wassen (5x, elk 1,5 uur) in 0,02 M fosfaatbuffer (zie tabel 1).
- Incubeer in sorbitol-gebaseerde Refractive Index Matching Solution (sRIMS, zie tabel 1) bij 40 °C 's nachts met zacht schudden.
3. Montage
- Omlijn een glazen afdeklip van 18 mm x 18 mm x 1,5 mm met een permanente markering met fijne punt om een vierkante grens op de achterkant van een glasmicroscoopschuif te markeren.
- Draai de schuif om en gebruik een spuit om de grens te traceren met een dunne lijn siliconenvet aan de voorkant van de glijbaan, waardoor er een kleine opening in een hoek overblijft om overtollige montageoplossing te ontsnappen.
- Breng het netvlies over naar het midden van het begrensde gebied en schik met een borstel met fijne punt zodat het plat ligt met de fotoreceptorzijde tegen de glazen schuif.
- Pipetteer ongeveer 60 μL sRIMS zodat het het afgeplatte netvlies bedekt en zich uitstrekt tot een hoek van de behuizing, waarbij ervoor wordt gezorgd dat het netvlies plat en op zijn plaats blijft.
- Breng de afdeklip vanaf de hoek aan met de sRIMS en laat deze langzaam zakken totdat deze het vet aan alle kanten raakt, waardoor de vorming van luchtbellen wordt vermeden.
- Plaats een stapel van 3 coverslips aan elke kant van het gemonteerde netvlies als een afstandsruimte. Gebruik de lange rand van een andere dia om de afdeklip naar beneden te drukken, zodat de houder vlak en gelijkmatig is.
- Bewaar dia's plat bij 4 °C tot beeldvorming.
4. Beeldvorming
- Beeldmonsters op een conventionele fluorescentiemicroscoop of een confocale microscoop(tabel met materialen). Begin met het plaatsen van de dia op het microscoopstadium en het lokaliseren van het monster.
OPMERKING: Als een omgekeerde objectieve microscoop wordt gebruikt, plaatst u de schuif ondersteboven op het podium en zorgt u er eerst voor dat de blootgestelde delen van de glijbaan vrij zijn van alle siliconenvet en montageoplossing. - Om z-gestapelde beelden van co-gelabelde monsters te verkrijgen, richt u eerst op het signaal in elk kanaal afzonderlijk en stelt u de belichtingstijd of scansnelheid in, respectievelijk voor fluorescentie- of confocale microscopen.
- Stel het bereik voor de z-stack in door het brandpuntsvlak handmatig in te stellen aan de boven- en onderkant van het gewenste bereik, of door het middelpunt in te stellen en vervolgens een bereik rond het middelpunt op te geven.
- Pas de stapgrootte of het aantal segmenten naar wens aan.
- Leg de afbeelding vast en sla het oorspronkelijke bestand op en exporteert het als een TIFF-bestand of een ander gewenst formaat.
5. Beeldanalyse
- Gebruik de beeldanalysesoftware naar keuze (Table of Materials) om de helderheid en het contrast in elk kanaal aan te passen totdat optimale helderheid wordt bereikt in zowel de enkele beelden als de 3-dimensionale weergave van de z-stack.
OPMERKING: Als de geselecteerde stapgrootte voldoende klein is, kan ook 3D-deconvolutie worden uitgevoerd om het signaal te verbeteren.
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Resultaten
Gemodificeerde CLARITY-verwerkte retina's zijn optisch transparant weefsel.
Om een weefselophelderingsmethode te formuleren die compatibel is met immunohistochemische toepassingen in het netvlies, terwijl het voldoende delipidatie biedt en de structurele integriteit van de cellulaire eiwitten behoudt, hebben we de CLARITY-weefselopruimingsmethode aangepast aan het netvlies van de muis. We konden het protocol vereenvoudigen en wijzigen voor retina's met hele bevestiging (zie Protocol). Na voltooiing va...
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Discussie
Wijziging van het CLARITY-protocol voor retina's met hele montering.
We hebben het CLARITY-protocol vereenvoudigd om adequate polymerisatie te bereiken zonder dat er een vacuümevacuatie- of uitdrogingskamer nodig is, zoals wordt gebruikt in de meeste eerdere studies7,9,11. Het polymerisatieproces wordt geremd door zuurstof, waardoor het monster tijdens de polymerisatiestap van het protocol uit de lucht moet w...
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Openbaarmakingen
De auteurs verklaren geen concurrerende financiële belangen.
Dankbetuigingen
We willen Bing Ye, Nathan Spix en Hao Liu bedanken voor de technische ondersteuning. Dit werk werd ondersteund door het National Institute of Health Grants EY022640 (D.-Q.Z.) en Oakland University Provost Undergraduate Student Research Award (E.J.A.).
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Materialen
| Naam | Bedrijf | Catalogusnummer | Opmerkingen |
|---|---|---|---|
| 16% Paraformaldehyde | Electron Microscopy Sciences | 15710 | Fixatief |
| Acrylamide | Fisher Biotech | BP170 | Hydrogel monomeer |
| Axio Imager.Z2 | Zeiss | Fluorescentiemicroscoop | |
| BSA | Fisher Scientific | BP1600 | Blocking agens |
| Eclipse Ti | Nikon Instruments | Scanning confocal microscoop | |
| KCl | VWR | BDH0258 | Buffer component |
| KH2PO4 | Sigma | P5655 | Buffer component |
| Na2HPO4 | Sigma Aldrich | S9763 | Buffer component |
| NaCl | Sigma Aldrich | S7653 | Buffer component |
| NaH2PO4 | Sigma Aldrich | S0751 | Buffer component |
| NaN3 | Sigma Aldrich | S2002 | Bacteriostatische conserveermiddel |
| NDS | Aurion | 900.122 | Blocking agens |
| NIS Elements AR | Nikon | Beeldanalysesoftware | |
| SDS | BioRad | 1610301 | Delipidatie agens |
| Sorbitol | Sigma Aldrich | 51876 | Buffer component |
| Triton-X-100 | Sigma | T8787 | Tensioactieve stof |
| Tween-20 | Fisher Scientific | BP337 | Tensioactieve stof |
| VA-044 | Wako Chemicals | 011-19365 | Thermische initiator |
Referenties
- Witkovsky, P. Dopamine and retinal function. Documenta Ophthalmologica. 108 (1), 17-40 (2004).
- McMahon, D. G., Iuvone, P. M. Circadian organization of the mammalian retina: from gene regulation to physiology and diseases. Progress in Retinal and Eye Research. 39, 58-76 (2014).
- Prigge, C. L., et al. M1 ipRGCs Influence Visual Function through Retrograde Signaling in the Retina. Journal of Neuroscience. 36 (27), 7184-7197 (2016).
- Zhang, D. Q., Belenky, M. A., Sollars, P. J., Pickard, G. E., McMahon, D. G. Melanopsin mediates retrograde visual signaling in the retina. PLoS One. 7 (8), 42647(2012).
- Liu, L. L., Alessio, E. J., Spix, N. J., Zhang, D. Q. Expression of GluA2-containing calcium-impermeable AMPA receptors on dopaminergic amacrine cells in the mouse retina. Molecular Vision. 25, 780-790 (2019).
- Liu, L. L., Spix, N. J., Zhang, D. Q. NMDA Receptors Contribute to Retrograde Synaptic Transmission from Ganglion Cell Photoreceptors to Dopaminergic Amacrine Cells. Frontiers in Cellular Neuroscience. 11, 279(2017).
- Chung, K., et al. Structural and molecular interrogation of intact biological systems. Nature. 497 (7449), 332(2013).
- Poguzhelskaya, E., Artamonov, D., Bolshakova, A., Vlasova, O., Bezprozvanny, I. Simplified method to perform CLARITY imaging. Molecular Neurodegeneration. 9, 19(2014).
- Epp, J. R., et al. Optimization of CLARITY for Clearing Whole-Brain and Other Intact Organs. eNeuro. 2 (3), (2015).
- Magliaro, C., et al. Clarifying CLARITY: Quantitative Optimization of the Diffusion Based Delipidation Protocol for Genetically Labeled Tissue. Frontiers in Neuroscience. 10, 179(2016).
- Yang, B., et al. Single-cell phenotyping within transparent intact tissue through whole-body clearing. Cell. 158 (4), 945-958 (2014).
- Zheng, H., Rinaman, L. Simplified CLARITY for visualizing immunofluorescence labeling in the developing rat brain. Brain Structure and Function. 221 (4), 2375-2383 (2016).
- Witkovsky, P., Arango-Gonzalez, B., Haycock, J. W., Kohler, K. Rat retinal dopaminergic neurons: differential maturation of somatodendritic and axonal compartments. Journal of Comparative Neurology. 481 (4), 352-362 (2005).
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Herprints en machtigingen
