Methodenartikel

Het creëren van aviaire voorhersenen chimaera's om de gezichtsontwikkeling te beoordelen

DOI:

10.3791/62183

⸱

18 februari 2021

 , 
1Department of Orthopaedic Surgery, Orthopaedic Trauma Institute, University of California

In dit artikel

Samenvatting

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Dit artikel beschrijft een weefseltransplantatietechniek die is ontworpen om de signalerings- en patrooneigenschappen van basale voorhersenen tijdens craniofaciale ontwikkeling te testen.

Samenvatting

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Het vogelembryo wordt al meer dan een eeuw gebruikt als een modelsysteem en heeft geleid tot fundamenteel begrip van de ontwikkeling van gewervelde dieren. Een van de sterke punten van dit modelsysteem is dat het effect van en de interactie tussen weefsels direct kan worden beoordeeld in chimere embryo's. We hebben eerder aangetoond dat signalen van de voorhersenen bijdragen aan de morfogenese van het gezicht door de vorm van het expressiedomein van sonic hedgehog (SHH) in de frontonasale ectodermale zone (FEZ) te reguleren. In dit artikel wordt de methode beschreven om de hersenchimaeren van de voorhersenen te genereren en illustraties te geven van de resultaten van deze experimenten.

Inleiding

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Veel hedendaags onderzoek in de ontwikkelingsbiologie richt zich op de rol van genen bij het vormen van embryo's. Er zijn goede tools om ontwikkelingsmechanismen vanuit een genetisch perspectief te onderzoeken. Embryo's worden echter geassembleerd en ondergaan morfogenese als reactie op weefselinteracties. Het vogelsysteem is een klassiek hulpmiddel dat wordt gebruikt om de verscheidenheid aan weefselinteracties te beoordelen die de ontwikkeling reguleren om de volgende redenen: de embryologie is goed begrepen, de embryo's zijn gemakkelijk toegankelijk, hulpmiddelen voor analyse van vogelsystemen zijn goed ontwikkeld en de embryo's zijn goedkoop.

Het vogeltransplantatiesysteem wordt al bijna een eeuw op grote schaal gebruikt voor het traceren van afstammingslijnen en om weefselinteracties tijdens de ontwikkeling te beoordelen 1,2,3,4. Dit systeem werd gebruikt om een signaleringscentrum te onderzoeken, de Frontonasal Ectodermal Zone (FEZ), dat morfogenese van de bovenkaak5 reguleert, en er werd een video gepubliceerd waarin die techniek eerderwerd beschreven 6. Naast kwartelkuikens zijn ook andere soorten gebruikt om chimaera's te produceren voor analyse van weefselinteracties. De muis FEZ werd bijvoorbeeld getransplanteerd van wild type7 en gemuteerde muizen8, en anderen hebben een eenden-, kwartel- en kuikensysteem gebruikt om de rol van neurale kuif te beoordelen bij het patroon van het gezichtsskelet 9,10,11,12.

In dit werk werd de rol van de voorhersenen bij het reguleren van het patroon van genexpressie in de FEZ door de ventrale voorhersenen wederzijds te transplanteren tussen kwartel-, eenden- en kuikenembryo's beoordeeld, omdat een signaal van de voorhersenen nodig is om Sonic-egelexpressie in de FEZ te induceren. Voorhersenentransplantaties zijn niet uniek in het veld. Deze transplantaties werden gebruikt om de ontwikkeling van motiliteit in kwartel- en eendenembryo's te beoordelen13, hoewel in deze experimenten ook weefsels werden getransplanteerd die bijdroegen aan niet-neurale derivaten. In ander werk zijn auditieve circuits bij vogels beoordeeld door voorhersenentransplantatie14, maar deze transplantaties bevatten vermoedelijke neurale topcellen, die bijdragen aan gezichtsvorm 9,10 en deelnemen aan het reguleren van SHH-expressie in de FEZ 15. Daarom werd een systeem bedacht om alleen de ventrale voorhersenen van de ene vogelsoort naar de andere te transplanteren voordat de neurale buis werd gesloten, om de rol van de hersenen in gezichtsvorm16 te beoordelen (figuur 1A, B). Deze methode was verstoken van neurale kambesmetting van het transplantaat. In dit artikel wordt de methode geïllustreerd en worden de verwachte resultaten beschreven en worden de uitdagingen besproken.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Witte Pekineend (Anas platyrhynchos), witte Leghorn kip (Gallus gallus) en Japanse kwartel (Cortunix coturnix japonica) worden geïncubeerd bij 37 °C in een bevochtigde kamer totdat ze op HH7/817 worden gematcht.

1. Voorbereiding van het donorweefsel

OPMERKING: Bereiding van reagentia en gereedschappen en hoe eieren te openen voor experimentele manipulatie is beschreven6.

  1. Bereid DMEM-media voor met neutraal rood, een glazen transferpipet en geslepen wolfraamnaalden.
  2. Embryo's blootstellen (zoals weergegeven in6).
  3. Oogst weefseltransplantaten van de linkerkant van de basale voorhersenen van stadium 7/8 embryo's. Gebruik gebogen geslepen wolfraamnaalden6 om voorzichtig een stuk van de voorhersenen van ~ 0,3 mm lang en 0,2 mm breed in te snijden, waarbij u ervoor zorgt dat u het onderliggende endoderm niet opneemt door de naald onder de voorhersenen te schuiven, zodat de naald evenwijdig is aan de as van de neurale buis.
  4. Pak met behulp van de glazen transferpipet het transplantaat op van het donorembryo.
  5. Breng het transplantaat gedurende 2 minuten over in DMEM met neutraal rood (0,01% in PBS, 23 °C) om het te kleuren en plaats het gekleurde transplantaat vervolgens in DMEM dat geen neutraal rood bevat totdat het klaar is voor transplantatie.

2. De host voorbereiden

  1. Incubeer bevruchte eieren van witte Leghorn-kip (Gallus gallus) bij 37 °C in een bevochtigde kamer tot HH7/8 17.
  2. Embryo's blootstellen (zoals weergegeven in6).
  3. Bereid met behulp van geslepen wolfraamnaalden de transplantaatplaats voor door voorzichtig te snijden en vervolgens een stuk basale voorhersenen van 0,3 mm bij 0,2 mm van de linkerkant te verwijderen om het transplantaat te accommoderen, zoals werd gedaan om het donorweefsel te isoleren.
  4. Zorg ervoor dat u overmatige verstoring van het onderliggende endoderm vermijdt, wat duidelijk zal zijn als dooierkorrels beginnen te lekken door elke scheur die wordt gemaakt. Dit vergt oefening en niet alle pogingen zullen succesvol zijn.
  5. Na het overbrengen naar de gastheer6, plaatst u het transplantaat om de uitgeroeide basale voorhersenen van de gastheer te vervangen.
  6. Plaats de tape stevig over het gat en breng het embryo gedurende de juiste tijd voor analyse terug naar de 37 °C-couveuse.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Resultaten

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Beoordeling van chimerisme en transplantatiebesmetting
Om de chimaera's te beoordelen, moet de mate van chimerisme en besmetting van het transplantaat met andere celtypen worden onderzocht. Het creëren van chimaera's door kwartelweefsels in kuikenembryo's te transplanteren, maakt dit soort analyse mogelijk. Met behulp van het QCPN-antilichaam kunnen kwartelcellen worden gevisualiseerd en onderscheiden van de gastheerweefsels (figuur 1 C,D). In dit geval w...

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Discussie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

De beschreven methode maakt het mogelijk om de weefselinteracties tussen de basale voorhersenen en het aangrenzende ectoderm te onderzoeken. Deze aanpak verschilt van eerdere voorhersenentransplantatiemethoden, omdat het donorweefsel beperkt was tot de ventrale voorhersenen. Dit elimineert transplantatie van de neurale topcellen, waarvan is aangetoond dat ze deelnemen aan patroonvormingvan gezichtsmorfologie 9,10. Daarom was het beperken van het transplantaat tot...

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Openbaarmakingen

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Alle auteurs hebben niets te onthullen.

Dankbetuigingen

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Onderzoek gerapporteerd in deze publicatie werd ondersteund door het National Institute of Dental and Craniofacial Research van de National Institutes of Health onder toekenningsnummers R01DE019648, R01DE018234 en R01DE019638.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel
NaamBedrijfCatalogusnummerOpmerkingen
1x PBSTEKTEKZR114
35x10 mm Petri schotelFalcon1008
DMEMThermofisher11965084
NaadhouderFine Science Tools26016-12
Neutral RedSigma553-24-2
No. 5 Dumont pincettenFine Science Tools11252-20
Pasteur PipettenThermofisher13-678-6B
QCPN antilichaamDevelopmental Studies Hybridoma Bank, Iowa University, Iowa, VS
SchaarFine Science Tools14058-11
Wolfraam naaldFine Science Tools26000

Referenties

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Waddington, C. Developmental Mechanics of Chicken and Duck Embryos. Nature. 125, 924-925 (1930).
  2. Noden, D. M. The role of the neural crest in patterning of avian cranial skeletal, connective, and muscle tissues. Developmental Biology. 96 (1), 144-165 (1983).
  3. Borue, X., Noden, D. M. Normal and aberrant craniofacial myogenesis by grafted trunk somitic and segmental plate mesoderm. Development. 131 (16), 3967-3980 (2004).
  4. Teillet, M. A., Ziller, C., Le Douarin, N. M. Quail-chick chimeras. Methods in Molecular Biology. 461, 337-350 (2008).
  5. Hu, D., Marcucio, R. S., Helms, J. A. A zone of frontonasal ectoderm regulates patterning and growth in the face. Development. 130 (9), 1749-1758 (2003).
  6. Hu, D., Marcucio, R. S. Assessing signaling properties of ectodermal epithelia during craniofacial development. Journal of Visualized Experiments. (49), (2011).
  7. Hu, D., Marcucio, R. S. Unique organization of the frontonasal ectodermal zone in birds and mammals. Developmental Biology. 325 (1), 200-210 (2009).
  8. Griffin, J. N., et al. Fgf8 dosage determines midfacial integration and polarity within the nasal and optic capsules. Developmental Biology. 374 (1), 185-197 (2013).
  9. Schneider, R. A., Helms, J. A. The cellular and molecular origins of beak morphology. Science. 299 (5606), 565-568 (2003).
  10. Tucker, A. S., Lumsden, A. Neural crest cells provide species-specific patterning information in the developing branchial skeleton. Evolution & Development. 6 (1), 32-40 (2004).
  11. Fish, J. L., Schneider, R. A. Assessing species-specific contributions to craniofacial development using quail-duck chimeras. Journal of Visualized Experiments. (87), (2014).
  12. Schneider, R. A. Neural crest and the origin of species-specific pattern. Genesis. 56 (6-7), 23219(2018).
  13. Sohal, G. S. Effects of reciprocal forebrain transplantation on motility and hatching in chick and duck embryos. Brain Research. 113 (1), 35-43 (1976).
  14. Chen, C. C., Balaban, E., Jarvis, E. D. Interspecies avian brain chimeras reveal that large brain size differences are influenced by cell-interdependent processes. PLoS One. 7 (7), 42477(2012).
  15. Hu, D., Marcucio, R. S. Neural crest cells pattern the surface cephalic ectoderm during FEZ formation. Developmental Dynamics. 241 (4), 732-740 (2012).
  16. Hu, D., et al. Signals from the brain induce variation in avian facial shape. Developmental Dynamics. 244 (9), 1133-1143 (2015).
  17. Hamburger, V., Hamilton, H. L. A series of normal stages in the development of the chick embryo. Journal of Morphology. 88 (1), 49-92 (1951).
  18. Xu, Q., et al. Correlations Between the Morphology of Sonic Hedgehog Expression Domains and Embryonic Craniofacial Shape. Evolutionary Biology. 42 (3), 379-386 (2015).
  19. Eames, B. F., Schneider, R. A. The genesis of cartilage size and shape during development and evolution. Development. 135 (23), 3947-3958 (2008).
  20. Merrill, A. E., Eames, B. F., Weston, S. J., Heath, T., Schneider, R. A. Mesenchyme-dependent BMP signaling directs the timing of mandibular osteogenesis. Development. 135 (7), 1223-1234 (2008).

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Herprints en machtigingen

Toestemming aanvragen om de tekst of afbeeldingen van dit JoVE-artikel te hergebruiken

Toestemming aanvragen

Trefwoorden

Weefseltransplantatiebasale voorhersenenneurale kamcellenSonic Hedgehogfrontonasale ectodermale zonekwartel kip chimerenwhole mount hybridisatieembryo manipulatie

Gerelateerde artikelen