Methodenartikel

Monitoring van neutrofiele Elastase en Cathepsine G-activiteit in menselijke Sputummonsters

21.9K weergaven

⸱

DOI:

10.3791/62193

⸱

21 mei 2021

 ,  ,  , 
1Translational Lung Research Center Heidelberg (TLRC), German Center for Lung Research (DZL), 2Dept. of Translational Pulmonology, University of Heidelberg, 3Molecular Medicine Partnership Unit (MMPU), European Molecular Biology Laboratory (EMBL), University of Heidelberg, 4Faculty of Biosciences, Collaboration for Joint Ph.D. Degree between EMBL and Heidelberg University, University of Heidelberg, 5Dept. of Pediatric Pulmonology, Immunology and Critical Care Medicine, Charité – Universitätsmedizin Berlin, 6Berlin Institute of Health (BIH), 7German Center for Lung Research (DZL), Associated Partner Site, Berlin, 8Dept. of Chemical Physiology and Biochemistry, Oregon Health and Science University

* These authors contributed equally

In dit artikel

Samenvatting

De hierin beschreven protocollen bieden een gids om de activiteit van neutrofiele proteasen in humaan sputum te visualiseren en te kwantificeren. De toepassingen van een dergelijke analyse variëren van de evaluatie van ontstekingsremmende behandelingen tot biomarkervalidatie, geneesmiddelenscreening en grote cohort klinische studies.

Samenvatting

Proteasen zijn regulatoren van talloze fysiologische processen en het precieze onderzoek van hun activiteiten blijft een intrigerende biomedische uitdaging. Onder de ~600 proteasen gecodeerd door het menselijk genoom, worden neutrofiele serine proteasen (NSP's) grondig onderzocht op hun betrokkenheid bij het begin en de progressie van ontstekingsaandoeningen, waaronder ademhalingsziekten. Uniek is dat uitgescheiden NSP's niet alleen diffuus zijn in extracellulaire vloeistoffen, maar ook lokaliseren naar plasmamembranen. Tijdens de vorming van neutrofiele extracellulaire val (NET's) worden NSP's een integraal onderdeel van het afgescheiden chromatine. Dergelijk complex gedrag maakt het begrijpen van NSP's pathofysiologie een uitdagende taak. Hier worden gedetailleerde protocollen getoond om vrije en membraangebonden neutrofiele elastase (NE) en cathepsine G (CG) activiteiten in sputummonsters te visualiseren, te kwantificeren en te discrimineren. NE en CG zijn NSP's waarvan de activiteiten pleiotrope rollen hebben bij de pathogenese van cystische fibrose (CF) en chronische obstructieve longziekte (COPD): ze bevorderen weefselremodellering, reguleren downstream immuunresponsen en correleren met de ernst van longaandoeningen. De protocollen laten zien hoe vloeistof en cellulaire fractie te scheiden, evenals de isolatie van neutrofielen van menselijk sputum voor enzymatische activiteit kwantificering via kleine molecuul Förster resonantie energieoverdracht gebaseerde (FRET) verslaggevers. Om specifieke inzichten te verzamelen in de relatieve rol van NE- en CG-activiteiten, kan een FRET-uitlezing worden gemeten met verschillende technologieën: i) in vitro plaatlezermetingen maken een hoge doorvoer en bulkdetectie van proteaseactiviteit mogelijk; ii) confocale microscopie spatiotemporally opgelost membraan-gebonden activiteit op het celoppervlak; iii) fretstroomcytometrie met een klein molecuul maakt een snelle evaluatie van ontstekingsremmende behandelingen mogelijk via kwantificering van proteaseactiviteit met één cel en fenotypering. De implementatie van dergelijke methoden opent de deuren om NSP's pathobiologie en hun potentieel als biomarkers van ziekte ernst voor CF en COPD te verkennen. Gezien hun standaardisatiepotentieel, hun robuuste uitlezing en eenvoud van overdracht, zijn de beschreven technieken onmiddellijk deelbaar voor implementatie in onderzoeks- en diagnostische laboratoria.

Inleiding

Neutrofiel elastase (NE), cathepsine G (CG), protease 3 (PR3) en neutrofiel serine protease 4 (NSP4) zijn de vier neutrofiele serine proteasen (NSP's)1. Ze worden samen met myeloperoxidase opgeslagen in neutrofiele primaire of azurofiele korrels. Vanwege hun verhoogde proteolytische inhoud is de afscheiding van primaire korrels strak gereguleerd en moeten neutrofielen opeenvolgend worden uitgedaagd met aanzuigende en activerende stimuli2.

In het fagolysoom functioneren NSP's als intracellulaire bacteriedodende middelen3. Wanneer ze worden uitgescheiden, worden NSP's sterke ontstekingsbemiddelaars: ze splitsen cytokinen en oppervlaktereceptoren en activeren parallelle pro-inflammatoire paden3. Belangrijk is dat ontstekingsaandoeningen een ongecontroleerde NSP-afscheiding hebben. Bijvoorbeeld, binnen ontstoken luchtwegen, overmatige NE activiteit veroorzaakt slijm hypersecretie, bokaalcellen metaplasie, CFTR inactivatie en extracellulaire matrix remodellering4,5. Cathepsine G neemt ook deel aan ontstekingen: het klieven en activeert specifiek twee componenten van de IL-1-familie, IL-36α en IL-36β6. In samenwerking met NE splitst CG protease-geactiveerde receptoren op het luchtwegepitheel en activeert ook TNF-α en IL-1β.

Endogene anti-proteasen zoals alfa-1-antitrypsine, alfa-1-antichymotrypsine en de secretoire leukocyten proteaseremmer reguleren neutrofiel elastase en cathepsine G activiteit5. In de loop van de progressie van longziekten overschrijdt de continue afscheiding van proteasen echter stoichiometrisch het anti-proteaseschild, wat leidt tot niet-oplossende neutrfilie in de luchtwegen, verergering van ontstekingen en weefselschade5,7. Hoewel is aangetoond dat NE-concentratie en -activiteit in oplosbare fracties van de luchtwegen van patiënten een veelbelovende biomarker zijn van ziekte ernst8, associëren NE en CG ook met het neutrofiele plasmamembraan en met extracellulair DNA via elektrostatische interacties9,10 waar ze minder toegankelijk worden voor anti-proteasen. Belangrijk is dat preklinische studies een scenario definieerden waarin celoppervlakgerelateerde proteaseactiviteit eerder en/of onafhankelijk van de oplosbare tegenhangerverschijnt 4,11. Om detecteerbaar te worden, moet vrije proteaseactiviteit eerst het anti-proteaseschild overweldigen. In plaats daarvan blijft aan het celoppervlak de membraangebonden proteaseactiviteit ten minste gedeeltelijk intact als gevolg van de ontoegankelijkheid van grote remmers tot het celplasmamembraan12. Dergelijk complex proteasegedrag heeft belangrijke gevolgen voor het begin en de voortplanting van neutrofiele ontstekingen en moet daarom worden onderzocht met nauwkeurige en informatieve hulpmiddelen.

In de loop der jaren vonden Förster resonantie-energieoverdrachtsondes (FRET)-gebaseerde sondes tal van biomedische toepassingen als hulpmiddelen die een specifieke proteaseactiviteit in menselijke monsters efficiënt en snel beoordelen13. Om te functioneren, protease verslaggevers zijn samengesteld uit een herkenning motief (d.w.z. een peptide), die wordt herkend door het doelenzym en vertrouwen op FRET, een fysiek proces waarbij, bij excitatie, een donor fluorofoor energie overdraagt aan een acceptor molecuul. De verwerking die door het enzym op de melder wordt uitgevoerd, namelijk de splitsing van het herkenningsgedeelte, resulteert in de acceptor om zich van de donor te verspreiden: de enzymactiviteit wordt daarom gemeten als een tijdsafhankelijke verandering in de donor ten opzichte van de acceptorfluorescentie. Een dergelijke uitlezing is zelfnormaliserend en ratiometrisch, waardoor het slechts marginaal wordt beïnvloed door omgevingsomstandigheden zoals pH en lokale sondeconcentratie. NEmo-114 en sSAM15 zijn FRET-sondes die specifiek rapporteren over respectievelijk NE- en CG-activiteit. Dergelijke verslaggevers lokaliseren echter niet specifiek in een cellulair compartiment, daarom worden ze gebruikt om de proteaseactiviteit in menselijke vloeistoffen te controleren. Om proteaseactiviteit op een ruimtelijk gelokaliseerde manier te monitoren, ontwikkelden wij en anderen FRET-sondes die zich associëren met subcellulaire componenten via moleculaire tags14,15,16,17,18,19. Een dergelijke synthetische strategie maakte de ontwikkeling van NEmo-2 en mSAM mogelijk, twee FRET-sondes uitgerust met lipidenankers die zich lokaliseren naar het plasmamembraan. Deze verslaggevers voedden een dieper begrip van NE- en CG-proteasen bij cystische fibrose en chronische obstructieve longziekten14,15.

Hier worden gedetailleerde protocollen verstrekt voor de visualisatie en kwantificering van oplosbare en membraangebonden NE- en CG-activiteiten in menselijk sputum door middel van NEmo- en SAM-serie FRET-sondes. Om verschillende aspecten van NSP's pathofysiologie aan te pakken en een scala aan methoden te bieden die kunnen worden gebruikt volgens de gebruikersspecifieke behoefte, wordt de analyse via fluorescentiespectroscopie, fluorescentiemicroscopie en flowcytometrie getoond.

Protocol

De volgende protocollen beschrijven de analyse die is uitgevoerd op menselijk sputum. De behandeling van menselijke monsters werd goedgekeurd door de ethische commissie van de Universiteit van Heidelberg en schriftelijke geïnformeerde toestemming werd verkregen van alle patiënten of hun ouders/ wettelijke voogden (S-370/2011) en gezonde controles (S-046/2009).

OPMERKING: De volgende protocollen beschrijven het monsterpreparaat en de kwantificering van de activiteit van neutrofiele serine proteasen (NSP's). De hierin gepresenteerde experimentele procedures zijn gericht op de activiteitsmeting van humaan sputum en neutrofiel elastase14,20,21 (NE) of cathepsine G15 (CG). Kleine aanpassingen in het monstervoorbereidingsprotocol maken de analyse van bloedafnamecellen en tumorhomogenaten echter mogelijk. Bovendien kunnen matrix metalloproteinase 12 en cathepsine S-activiteiten op dezelfde manier worden onderzocht door middel van speciale FRET-sondes22,23,24,25,26.

1. Monstervoorbereiding: celisolatie en supernatantscheiding

OPMERKING: Indien mogelijk moet de behandeling van sputum binnen 120 minuten na de slijmopeving worden uitgevoerd en moet het sputum tot verdere verwerking op ijs worden bewaard.

  1. Als spontane slijmopwedding van sputum niet mogelijk is, induceer dan sputum zoals eerder beschreven19. Adem kort 200 μg van de β-2-receptor-antagonist salbutamol in voordat u de sputuminductieprocedure start. Adem daarna gedurende 15 minuten een hypertone (6%) zoutoplossing in met behulp van een vernevelaar. Verzamel het verwachte sputum in een petrischaaltje.
  2. Scheid de slijmklonters van het speeksel in een Petrischaaltje met behulp van een pipetpunt.
  3. Weeg het slijm.
    OPMERKING: Het gemiddelde gewicht van een slijmmonster is 0,8 g (variërend tussen 0,1 g en 5 g); 0,1 g zijn meestal voldoende om de genoemde procedures uit te voeren.
  4. Voeg 4 delen (v/w) van 10% Sputolysine (in PBS) toe aan sputum (bijvoorbeeld: 4 ml 10% Sputolysine voor elke gram sputum).
    LET OP: Sputolysine bestaat uit geconcentreerde dithiothreitol in fosfaatbuffer, behandel het daarom met zorg.
  5. Incubeer het mengsel op kamertemperatuur (RT) gedurende 15 minuten op een schommelende shaker om het slijm op te lossen. Plaats de shaker om veiligheidsredenen in een zuurkast.
  6. Blus de reactie door hetzelfde volume koude PBS toe te voegen (bijvoorbeeld: 1 ml koude PBS voor elke ml 10% Sputolysine).
  7. Meng door pipetten om een homogene oplossing te verkrijgen.
  8. Filtreer het mengsel door een nylon celzeef van 100 μm in een buis van 50 ml.
  9. Herhaal de filtratiestap door een nylon celzeef van 40 μm.
  10. Centrifugeer de oplossing gedurende 10 min bij 300 x g bij 4 °C.
  11. Doe de supernatantfractie voorzichtig in een verse buis en bewaar deze op ijs.
    OPMERKING: De supernatansfracties kunnen tot nader order bij -20 °C of -80 °C worden bewaard.
  12. Resuspend de celkorrel voorzichtig in 500 μL koude PBS en leg deze op ijs.
    OPMERKING: De celfractie moet onmiddellijk worden verwerkt.

2. Neutrofiele serine protease activiteitsmeting

OPMERKING: Hier worden verschillende methoden geïntroduceerd om de NSP-activiteit te kwantificeren door middel van FRET-verslaggevers. De keuze van de technologie wordt bepaald door de specifieke biomedische vraag en het doel van het experiment. De gepresenteerde sondes werden uitgebreid getest op hun specificiteit aan de hand van een reeks longrelevante enzymen14,15. Hoewel de sondes specifiek zijn voor hun doelenzym, controleer altijd de specificiteit van de sonde op het klinische monster van belang. Dit kan worden bereikt door het monster te incuberen met een specifieke proteaseremmer voorafgaand aan de toevoeging van de sonde, die elke toename van de D/A-verhouding zou moeten afschaffen.

  1. Oplosbare NSP's activiteit kwantificering via fluorimeter of plaatlezertest
    OPMERKING: Proteaseactiviteit in oplosbare fracties van het monster kan worden gedetecteerd met elk instrument dat fluorescentiedetectie kan detecteren.
    1. Ontdooi enzymen op ijs.
    2. Bewaar NE en CG tot gebruik in een zure opslagbuffer (50 mM natriumacetaat, 200 mM NaCl, pH 5,5) om zelfsplitsing te voorkomen.
    3. Om een enzymstandaardcurve in te stellen, bereidt u een 1:2 seriële verdunning van enzym (33,9 - 0,271 nM voor NE; 42,6 - 0,333 nM voor CG) in activeringsbuffer (10 mM Tris-HCl, 500 mM NaCl bij pH 7,5). De activeringsbuffer heeft een neutrale pH en maakt het dus mogelijk om enzymatische katalyse efficiënt te laten verlopen.
      1. Om de hoogste standaardconcentratie (NE-concentratie: 33,9 nM) te bereiden, verdunt u 1 μL NE (33,9 μM) in 999 μL activeringsbuffer.
      2. Om de tweede norm (NE-concentratie: 16,95 nM) voor te bereiden, mengt u 200 μL van de eerste verdunning met 200 μL activeringsbuffer.
      3. Ga dienovereenkomstig te werk om de resterende 1:2 verdunningen voor te bereiden.
      4. De laatste standaard, die leeg is, bestaat uit pure activeringsbuffer. Het meten van technische duplicaten of drievoud wordt aanbevolen. Probeer tijdens de standaard- en monstervoorbereiding flacons op ijs te houden.
    4. Verdun sputummonsters parallel aan het standaardpreparaat in de activeringsbuffer. Verdun de menselijke monsters voordat u hun proteaseactiviteit beoordeelt om in het lineaire bereik van de toename van het signaal van de verslaggever te blijven (donor/acceptor ratio). Als patiëntmonsters onverdund zouden blijven, zou het decolleté te snel gebeuren voor een betrouwbare pasvorm. Aangezien gezond donorspoeum minder actieve proteasen bevat in vergelijking met monsters van CF- en COPD-patiënten, worden over het algemeen verschillende verdunningen uitgevoerd (1:10 voor gezonde sputumsupernatant, 1:20-500 voor sputumsupernatans van COPD- of CF-patiënten).
      OPMERKING: Om de proteaseactiviteit in monsters waarvan de concentratie onbekend is kwantitatief te meten, moet een standaardcurve met bekende enzymconcentraties parallel worden gemeten, idealiter op dezelfde plaat. De concentratie van actief enzym in menselijk sputum wordt berekend door de in menselijke sputummonsters gemeten hellingen te interpoleren met de hellingen die met de standaardcurven zijn gemeten.
    5. Voordat u de monsters klaarmaakt voor meting, stelt u het instrument in. Stel de excitatiegolflengte voor ne fret sonde (NEmo-114) in op 354 nm, en stel de detectie golflengte in op 400 nm voor de donor en 490 nm voor de acceptor. Stel de excitatiegolflengte voor CG FRET-sonde (sSAM15) in op 405 nm en stel de emissie in op 485 (donor) en 580 nm (acceptor).
    6. Voeg 40 μL monsters, standaard of blanco, toe aan de putten van een zwarte plaat met een half oppervlak van 96 wells.
    7. Om de mastermix met de verslaggevers voor te bereiden (concentratie van de reporter in de mastermix: 10 μM), verdun de sondevoorraad (1 mM in DMSO) 1:100 in activeringsbuffer. Bereid het benodigde mastermixvolume voor door 10 μL x het aantal vereiste plaatputten te vermenigvuldigen. Om de optimale eindconcentratie (2 μM) voor fluorescentiemeting van NEmo-1- en sSAM-verslaggevers te bereiken, voegt u 10 μL van de hoofdmix toe aan elke put (met 40 μL monster, standaard of blanco) en start u de uitlezing. NEmo-1- en sSAM-verslaggevers zullen daarom respectievelijk oplosbare neutrofiele elastase en cathepsine G-activiteit monitoren.
      OPMERKING: Als er geen reagensinjector beschikbaar is, zorg er dan voor dat u de uitlezing zo snel mogelijk na toevoeging van de monsters aan de verslaggever start.
    8. Start de meting van de plaatlezer en registreer de toename van de donor/acceptorverhouding elke 60-90 seconden gedurende ten minste 20 minuten of totdat de toename van het signaal een plateau bereikt.
    9. Zodra de gegevens zijn geëxporteerd, berekent u de donor/acceptorverhouding (D/A-verhouding) door de relatieve fluorescentie-eenheden (RFU) van de donor te delen met de acceptor-RFU voor elk tijdspunt en monster.
    10. Bereken het gemiddelde D/A-verhoudingsgemiddelde en de standaardafwijking van elk monster.
    11. Bepaal de helling binnen de lineaire groei van de D/A-verhoudingsverandering. De helling is een indicator van de enzymsplitsingssnelheid voor een FRET-sonde. Bereken de concentratie van het actieve enzym in sputum door de lineaire regressiehellingen afgeleid van de menselijke monsters aan te passen aan die berekend op basis van de enzymstandaard.
  2. Membraangebonden NSP's activiteit kwantificering via fluorimeter of plaatlezertest
    1. Isoleer sputumcellen zoals hierboven beschreven. Resuspend 3 x 104 cellen in een volume van 40 μL PBS. Voeg de cellen goed toe aan de plaatlezer.
    2. Zet het instrument op. Stel de excitatiegolflengte voor membraangebonden NE FRET-sonde (NEmo-214) in op 405 nm en stel de detectiegolflengte in op 485 nm voor de donor en 580 nm voor de acceptor. Stel de excitatiegolflengte voor membraangebonden CG FRET-sonde (mSAM15) in op 405 nm en stel de emissie in op 485 (donor) en 580 nm (acceptor).
    3. Om de mastermix met de verslaggevers voor te bereiden, verdunt u de sondevoorraad in activeringsbuffer tot een concentratie van 10 μM. Bereid het benodigde mastermixvolume voor door 10 μL X het aantal vereiste plaatputten te vermenigvuldigen. Om de optimale eindconcentratie (2 μM) voor fluorescentiemeting van NEmo-2- en mSAM-verslaggevers te bereiken, voegt u 10 μL van de hoofdmix toe aan elke put (met 40 μL monster, standaard of blanco) en start u de uitlezing. NEmo-2- en mSAM-verslaggevers zullen daarom respectievelijk membraangebonden neutrofiele elastase en cathepsine G-activiteit volgen.
      OPMERKING: Een cellulaire negatieve controle kan worden gebruikt, bijvoorbeeld cellen die NSP's niet actief afscheiden. Bijvoorbeeld, de incubatie van de verslaggevers met 3 x 104 leukocyten voorlopers HL-60 promyelocytische cellen vertegenwoordigt een geldige decolleté negatieve controle.
    4. Registreer verandering in donor/acceptor ratio gedurende ten minste 20 minuten of totdat de toename van het signaal een plateau bereikt. Analyseer de gegevens zoals hierboven beschreven.
  3. Membraangebonden NSP's activiteitsmeting via fluorescentiemicroscopie
    1. Bepaal het aantal voorwaarden dat moet worden geanalyseerd.
      OPMERKING: Voor elke sputummonstermeting wordt de bereiding en analyse van aanvullende positieve (PC) en negatieve (NC) controle aanbevolen.
    2. Resuspendeer voor elke meting 3 x 104 sputumcellen in een volume van 50 μL PBS in een buis van 1,5 ml.
    3. Als negatieve controle incubeer sputumcellen met een specifieke remmer (Sivelestat, specifieke NE-remmer of cathepsine-G-remmer I, specifieke CG-remmer, bij een eindconcentratie van 100 μM). Incubeer gedurende 10 minuten bij RT.
    4. Als positieve controle moet sputumcellen met het juiste enzym (NE of CG bij respectievelijk 340 nM of 200 nM) gedurende 10 minuten bij RT worden geïncubeerd.
    5. Voeg 50 μL PBS met de FRET-reporter en een kernvlek (in een eindverdunning van 1:1000) toe aan elke buis (positieve met controle behandelde cellen, negatieve met controle behandelde cellen en onbehandelde cellen) om een sonde-eindconcentratie van 2 μM te bereiken. Incubeer gedurende 10-20 minuten bij RT.
      BELANGRIJK: De toevoeging van een kernvlek vergemakkelijkt fluorescentiemicroscopie beeldvorming omdat het mogelijk is om te zoeken naar sputumcellen van belang zonder de FRET-sondekanalen te gebruiken en daarom te voorkomen dat verslaggevers bleken. Bovendien maakt de DNA-vlek het mogelijk om sputumcellen te segmenteren op basis van de vorm van hun kern. Neutrofielen zijn bijvoorbeeld gemakkelijk te herkennen aan hun multilobulaire kernen. Ook kan aanvullende informatie over de levensvatbaarheid van de cellen worden opgehaald (neutrofielen met een meer gesegmenteerde kern hebben meer kans om te leven).
      OPMERKING: Naast de membraangebonden, kan de activiteit van DNA-gebonden NE of CG in menselijk sputum op dezelfde manier worden gemeten door middel van H-NE en H-CG, extracellulaire DNA-associatieve FRET-sondes27. Bij het bereiden van de mastermix kunnen H-NE en H-CG worden toegevoegd bij de concentratie van 10 μM en worden geïncubeerd met sputum voorafgaand aan cytospin- en diavoorbereiding. De D/A-ratio kwantificering op extracellulair DNA verloopt identiek aan NEmo-2 en mSAM, met als enige verschil dat extracellulaire DNA-aggregaten worden gesegmenteerd in plaats van enkele cellen27.
    6. Doof de reactie door 100 μL ijskoud PBS toe te voegen en breng monsters over op ijs.
    7. Cytospin het mengsel op microscopie dia's, aan de lucht drogen, fixeren met ijskoude methanol 10% gedurende 10 minuten, aan de lucht drogen en monteren met een geschikt montagemedium.
      OPMERKING: De microscopieglaasjes kunnen tot een maand in het donker bij 4 °C worden bewaard tot verdere analyse.
    8. Verkrijg microscopiebeelden met behulp van een confocale microscoop met een PL APO 40x of 63x olie objectief. Om de beeldkwaliteit te verhogen en de acquisitietijd te verkorten, wordt een sequentiële beeldverwervingsmodus aanbevolen.
      1. Beeld de nucleaire vlek eerst in via 633 nm excitatie met de helium-neon-laserlijn en registreer de emissie tussen 650 en 715 nm.
      2. Registreer de donor (cumarine 343) van de FRET-verslaggever tussen 470 en 510 nm bij excitatie bij 458 nm met een argonlaser. Verkrijg de gesensibiliseerde acceptor (5,6-TAMRA) emissie tussen 570 en 610 nm na enige donor excitatie.
      3. Registreer de directe acceptoremissie in een afzonderlijk kanaal tussen 470 en 510 nm bij optimale excitatie bij 561 nm met behulp van de diode pumped solid state (DPSS) laser.
      4. Stel het pinhole in aan het begin van het experiment en onderhoud tijdens de beeldvormingssessie.
        OPMERKING: Vanwege hun kleine formaat wordt het gebruik van een 40x of 63x microscoop objectief aanbevolen om neutrofielen goed te visualiseren. Meestal worden beelden verkregen in verschillende opeenvolgende kanalen, te beginnen met de langere excitatiegolflengte om fotobleaching van de verslaggever tijdens acquisitie te voorkomen.
    9. Afbeelding ten minste 100 cellen per voorwaarde voor sluitende statistieken. Voor analyse van microscopiebeelden gebruikt u een geschikte software: segmenteer de cellen en bereken de D/A-verhouding per pixel, bereken vervolgens het gemiddelde of de mediaan van een bepaald interessegebied dat handmatig door de gebruiker wordt geselecteerd. Voor representatieve resultaten zie figuur 1.

figure-protocol-1
Figuur 1: Representatieve beelden en kwantificering van membraangebonden NE-activiteit op neutrofielen geïsoleerd van CF-patiënt sputum. a) Representatieve confocale microscopiebeelden van neutrofielen die gedurende 10 minuten zijn geïncubeerd (bovenpaneel) met 100 μM Sivelestat (w/) of onbehandeld (w/o) (onderste paneel) vóór toevoeging van reporter NEmo-2 (2 μM). De eerste kolom van links toont de nucleaire vlek, de tweede het donorkanaal, de derde het acceptorkanaal en de laatste de berekende D/A-verhouding verkregen door donor- en acceptorkanalen pixel voor pixel te delen. De grenzen van de regio van belang (enkele neutrofiel) worden afgebeeld als stippellijn. Schaal (10 μm) en kalibratiebalken (D/A-verhouding) zijn aangegeven. b) Box- en dot-plots met de D/A-verhouding van sputum neutrofielen van een representatieve CF-patiënt. Cellen geïncubeerd met remmers en onbehandelde cellen worden respectievelijk in grijs en blauw weergegeven. Elke punt vertegenwoordigt één cel (N: w/inhibitor = 113 en w/o inhibitor = 96). Klik hier om een grotere versie van deze afbeelding te bekijken.

  1. Membraangebonden NSP's activiteitsmeting via flowcytometrie
    1. Resuspend 1 x 106 cellen in 100 μL PBS in een 5 ml FACS polystyreen ronde bodembuis en plaats de buis op ijs.
    2. Gebruik de volgende antilichamen om sputum neutrofielen te gaten: CD14 (1:50), CD16 (1:50), CD45 (1:33) en CD66b (1:50). Bereid voldoende mastermix voor alle monsters. Leg de mastermix op ijs in het donker.
    3. Stel de gatingstrategie in zoals beschreven in figuur 2. De neutrofielen worden gated als 7AAD-CD45+CD14-CD16+CD66b+ events. De gated events worden vervolgens geanalyseerd op hun membraangebonden proteaseactiviteit voor hun donor (λexc = 405 nm, λem = 450/50 nm) en acceptor (λexc = 405 nm, λem = 585/42 nm) gemiddelde fluorescentieintensiteiten (MFI's).
    4. Voeg 2 μL FcBlock toe aan elk monster en incubeer gedurende 5 minuten bij RT.
    5. Voeg de gekozen antilichamen toe aan elke buis en incubeer gedurende 30 minuten op ijs in het donker.
    6. Was cellen door 2 ml koude PBS toe te voegen en centrifugeer gedurende 5 minuten bij 300 x g en 4 °C. Gooi supernatant en resuspend cellen weg in 200 μL koude PBS.
    7. Splits de 200 μL in twee buizen met elk 100 μL en voeg in elke buis 5 μL cel levensvatbaarheidskleuringsoplossing toe. Leg buizen op ijs.
    8. Voeg een geschikte specifieke NSP-remmer (voor NE-gebruik Sivelestat bij 225 μM eindconcentratie, voor CG-gebruik cathepsine G-remmer I bij 100 μM) toe aan de negatieve controle (NC) reageerbuis. Incubeer de monsters bij RT gedurende 10 minuten in het donker.
    9. Voeg 100 μL koude PBS toe aan het monster, filtreer het door een filter van 40 μm in een schone FACS-buis om verstopping van het instrument te voorkomen.
    10. Voeg de melder (voor NE, NEmo-2 bij een eindconcentratie van 4 μM, voor CG, mSAM bij een eindconcentratie van 2 μM) toe aan het NC-monster, draai de buis voorzichtig om.
    11. Begin met het verkrijgen van cellen geïncubeerd met de specifieke remmer om, indien nodig, de poorten en de spanningen van de verslaggever PMT's enigszins aan te passen.
    12. Neem minstens 1000 neutrofielen op. Bewaar het monster op kamertemperatuur.
      OPMERKING: Hoewel er meer gebeurtenissen kunnen worden geregistreerd, zorgen 1000 cellen voor een goed compromis tussen de juiste statistieken en de opnametijd.
    13. Ga dienovereenkomstig verder met de volgende buizen (onbehandelde sputummonsters).
    14. Om veranderingen in de D/A-verhouding als gevolg van membraangebonden proteaseactiviteit vast te leggen, registreert u elke 5 tot 10 minuten 100 neutrofielen uit elke buis.
      OPMERKING: Na een succesvolle FRET reporter decolleté zal de intensiteit van de MFI's van het donorkanaal in de loop van de tijd toenemen. De intensiteit van de MFI's van het acceptorkanaal moet in de loop van de tijd afnemen of constant blijven.
    15. Bereken de FRET-verhouding door de donor te delen door de acceptorkanaalwaarden voor de monsters gemeten op de gated viable single neutrophils.
    16. Normaliseer monstermetingen door ze te delen met het overeenkomstige tijdspunt van 0 minuten (voor representatieve resultaten en analyse zie figuur 2).
      OPMERKING: De registratie van ten minste twee tijdspunten (d.w.z. 0 en 10 min) is noodzakelijk voor een dynamische meting van de D/A-verhoudingsverandering. Om de activiteitsmeting voor elk monster te normaliseren, wordt de D/A-verhouding gemeten in latere tijdspunten (bijv. 10 min) gedeeld door de verhouding die onmiddellijk na de toevoeging van de sonde (0 min) wordt berekend.

figure-protocol-2
Figuur 2: Gatingstrategie en representatieve plots van membraangebonden NE-activiteit gemeten op neutrofielen geïsoleerd van CF-patiëntsputum. a) Om sputum neutrofielen te gaten worden de volgende antilichamen gebruikt: CD14 (1:50), CD16 (1:50), CD45 (1:33) en CD66b (1:50). De neutrofielen worden gated als 7-AAD-CD45+CD14-CD16+CD66b+ events. De gated events worden geanalyseerd op hun donor (λexc= 405 nm, λem= 450/50 nm) en acceptor (λexc= 405 nm, λem= 585/42 nm) gemiddelde fluorescentieintensiteiten (MFI's). b) Representatieve histogrammen van CF sputum neutrofielen geanalyseerd op hun membraangebonden NE-activiteit. De linkerkolom toont het donorsignaal, de rechterkolom toont het acceptorsignaal. De bovenste rij toont gemiddelde fluorescentieintensiteiten van cellen die gedurende 10 minuten met Sivelestat (w/) zijn behandeld voordat de verslaggever wordt opgewaardeerd. De onderste rij toont onbehandelde (w/o) cellen waarvan de fluorescentie van de verslaggever onmiddellijk wordt gemeten (0 min, grijs) en 10 min (blauw) na toevoeging van de verslaggever. Neutrofielen worden gated volgens de strategie in paneel a. c) De gegevenstabel toont een representatieve dataset bestaande uit ruwe MFI's voor de donor en acceptor signaal op neutrofielen gemeten over verschillende tijdspunten (0-3-5-10-15-20 min) evenals de berekende D/A ratio. De D/A-verhouding kan worden genormaliseerd, d.w.z. tot het tijdspunt van 0 minuten (wit lettertype). 0 min geeft een opname aan die zo snel mogelijk na de toevoeging van de verslaggever aan de stroombuis met bevlekte sputumcellen is gedaan. MFI-gegevens worden weergegeven als gemiddelde ± standaardafwijking voor 1000 neutrofielen. Klik hier om een grotere versie van deze afbeelding te bekijken. 

Resultaten

De resultaten in figuur 1a illustreren een representatieve microscopiegegevensset. Het kernsignaal wordt gebruikt om neutrofielen te identificeren aan de hand van hun karakteristieke gesegmenteerde kernen. De regio van belang (ROI) wordt handmatig geselecteerd (stippellijn in figuur 1a). De afbeelding van de D/A-verhouding wordt berekend door de intensiteiten van het donorkanaal te delen door de intensiteiten van het acceptorkanaal per pixel. In de laatste stap wordt de gemiddelde D/A-verhouding per cel (ROI) berekend. In figuur 1b vertegenwoordigt elke stip het gemiddelde van één ROI (neutrofiel). Het wordt aanbevolen om ongeveer 100 cellen per aandoening in beeld te brengen en te evalueren.

Figuur 2ageeft een representatieve flow cytometrie gating strategie weer . Een dergelijke gating maakt het mogelijk om sputum neutrofielen te discrimineren en te bestuderen. Om fluoresceringsoverloop of compensatieartefacten te voorkomen, wordt aanbevolen om een laserlijn (bijv. blauwe laser) te wijden aan de fluorescentiedetectie van de FRET-sonde. Flow cytometrie fluorescentiecompensatie moet worden uitgevoerd voor antilichamen en niet voor de FRET-sonde. Figuur 2b toont de MFI-verdeling op 0 en 10 minuten na toevoeging van de verslaggever. Elke rij in figuur 2c geeft de gemiddelde donor- en acceptor MFI-waarden aan voor 1000 sputum neutrofielen. De D/A-verhouding wordt berekend door de donor en acceptor MFI's te delen. Het tijdsverloop in figuur 2c aan de rechterkant toont de progressie van de meting: na een snelle initiële toename bereikt de D/A-verhouding een plateau, afhankelijk van de activiteit van het membraangebonden enzym.

Discussie

De gerapporteerde protocollen verklaren verschillende benaderingen om de activiteit van neutrofiel elastase en cathepsine G in menselijke sputummonsters te kwantificeren. Kritische punten voor een succesvolle enzymactiviteitsmeting zijn de i) nauwkeurige timing en standaardisatie van de operatieprocedure en ii) het gebruik van betrouwbare negatieve en positieve controles. Als aan deze voorwaarden wordt voldaan, zijn de beschreven methoden niet beperkt tot sputum, maar kunnen ze ook gemakkelijk worden aangepast aan de analyse van proteaseactiviteit in bloed, bronchoalveolaire lavagevloeistoffen en weefselsecties of homogenaten.

Elk van de drie technieken heeft zijn sterke punten en beperkingen, die elkaar vaak aanvullen. Flowcytometrie maakt bijvoorbeeld een snelle analyse van zeldzame celpopulaties en celfenotypering mogelijk, maar mist ruimtelijke resolutie-informatie, die kan worden bereikt door microscopie. In plaats daarvan maken plaatlezermetingen het mogelijk om verschillende monsters of omstandigheden parallel te beoordelen op een manier met hoge doorvoer. Aangezien verse sputumcellen niet kunnen worden ingevroren en opgeslagen, vereisen de drie methoden dat monsters snel na de slijmopweving worden verwerkt. Dit beperkt de flexibiliteit of de doorvoer van de membraangebonden activiteitsmetingen. De ontwikkeling van een flowcytometrieprotocol dat het mogelijk maakt om cellen te fixeren na toevoeging van de sonde en enzymatisch decolleté zou openstaan voor de parallelle meting van een hoger aantal buizen. Bovendien moet bijzondere aandacht worden besteed aan de hantering en opslag van de FRET-sondes. In feite ondergaan sommige aminozuren in het peptidesubstraat, zoals methionine, oxidatie, wat leidt tot verminderde gevoeligheid van de verslaggever. Om de houdbaarheid van de verslaggever te verlengen (geschat op ongeveer drie maanden bij 20 °C), kunnen ze worden opgeslagen in kleine hoeveelheden aliquots (1-2 μL) onder inert gas zoals stikstof of argon.

Bij CF en andere chronische inflammatoire longziekten is het belangrijk om de ontsteking zo vroeg mogelijk op te sporen, en betrouwbare biomarkers hebben het potentieel om een dergelijk doel te bereiken. De mogelijkheid om oppervlaktegebonden NSP-activiteit te detecteren, waarvan is aangetoond dat deze schadelijk is voor het omliggende weefsel, ook in omstandigheden waarin er geen of weinig vrije NE-activiteit is, voegt een ander niveau van waardevolle informatie toe, die nauwelijks kan worden bereikt met behulp van andere bestaande methoden4,11.

De verslaggevers kunnen worden gebruikt om het verband van membraangebonden geassocieerde NSP-activiteit met ernst en progressie van longziekte te bestuderen, vooral bij het vroege begin. De methoden kunnen worden gebruikt om de werkzaamheid van de behandeling te controleren (bijv. ontstekingsremmende behandelingen of zeer effectieve CFTR-modulatoren en potentiatoren28)en de resulterende demping van neutrofiele ontstekingen te onderzoeken. Bovendien zijn de protocollen gebaseerd op niet-invasieve monsterprocedures die een zeer laag risico voor de patiënt met zich meebrengen en daarom op zeer brede schaal kunnen worden gebruikt en de deuren openen voor tal van opwindende toepassingen.

Openbaarmakingen

De auteurs verklaren geen belangenverstrengeling.

Dankbetuigingen

Dit project werd ondersteund door subsidies van het Duitse ministerie van Onderwijs en Onderzoek (FKZ 82DZL004A1 aan M.A.M) en de German Research Foundation (SFB-TR84TP B08 to M.A.M). Het werk dat in dit manuscript wordt beschreven, werd ondersteund door het Duitse Centrum voor Longonderzoek (DZL) en de EMBL Heidelberg via een doctoraatsbeurs voor M.G. Wij danken J. Schatterny, S. Butz en H. Scheuermann voor deskundige technische bijstand.

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel
NaamBedrijfCatalogusnummerOpmerkingen
100 µm Nylon cell strainerCorning Inc.431752
2300 EnSpire (Multilabel Plate Reader)PerkinElmer
35x10mm Dish, Nunclon DeltaThermo Fisher Scientific150318
40 µm Nylon cell strainerCorning Inc.431750
50 mL tubesSarstedt10535253
7-AAD, viability dyeBio Legend4204045 µL/100 µL
BalanceOHAUS Instruments (Shanghai) Co., Ltd.PR124
BD Falcon Round-Bottom Tubes 5 mLBD Bioscience352054
BD LSRFortessa cell analyzerBD Bioscience
black flat bottom 96 well half area plateCorning Life Science3694
Cathepsin GElastin Products CompanySG623
Cathepsin G Inhibitor IMerck KGaA219372
Centrifuge 5418REppendorf AGEP5401000137
Combitips advanced 1.0 mLEppendorf AG0030 089 430
cOmplete proteinase inhibitorRoche11697498001
Countig chambers improved NeubauerGlaswarenfabrik Karl Hecht GmbH & Co KG40442
coverslips Ø 25mmThermo Fisher ScientificMENZCB00250RA003
Cytospin 4Thermo Fisher Scientific
DRAQ5 (nuclear stain)BioStatus LimitedDR500501:10000
FACSDiva software, v8.0.1BD Bioscience
FcBlockBD Bioscience564219
Fiji (Fiji Is Just ImageJ)fiji.sc
Flow Jo software, v10TreeStar
FluoQ Plugin, v3-97
Heraeus Megafuge 16RThermo Fisher Scientific
Human Sputum Leucocyte ElastaseElastin Products CompanySE563
Leica SP8 confocal microscopeLeica Microsystems
Mini Rock-ShakerPEQLAB Biotechnologie GmbHMR-1
mouse anti-human CD14, Pe-Cy7, clone M5E2BD Bioscience557742 Lot:82219831:50
mouse anti-human CD16, AF700, clone 3G8BD Bioscience557820 Lot:82087911:50
mouse anti-human CD45, APC-Cy7, clone 2D1BD Bioscience557833 Lot:80596881:33
mouse anti-human CD66b, PE/Dazzel 594, clone G10F5BioLegend305122 Lot:B2419211:50
mSAMin house2 mM
Multipette plusEppendorf AG
NEmo-1SiChemSC-02001 mM
NEmo-2ESiChemSC-02012 mM
Pari Boy SX with an LC Sprint jet nebulizerPari085G3001
phosphate buffered salineGibco10010-015
ROTI Histokitt (mounting medium)Carl Roth GmbH + Co.KG6638.1
SalbutamolTeva GmbH
SivelestatCayman Chemicals17779
SputolysinCalbiochem560000-1SET
sSAMin house2 mM
SuperFrost Plus Adhesion slidesThermo Fisher Scientific10149870
Trypan Blue solutionSigma-AldrichT8154

Referenties

  1. Korkmaz, B., Moreau, T., Gauthier, F. Neutrophil elastase, proteinase 3 and cathepsin G: Physicochemical properties, activity and physiopathological functions. Biochimie. 90 (2), 227-242 (2008).
  2. Sheshachalam, A., Srivastava, N., Mitchell, T., Lacy, P., Eitzen, G. Granule Protein Processing and Regulated Secretion in Neutrophils. Frontiers in Immunology. 5, 448(2014).
  3. Pham, C. T. N. Neutrophil serine proteases: Specific regulators of inflammation. Nature Reviews Immunology. 6 (7), 541-550 (2006).
  4. Gehrig, S., et al. Lack of neutrophil elastase reduces inflammation, mucus hypersecretion, and emphysema, but not mucus obstruction, in mice with cystic fibrosislike lung disease. American Journal of Respiratory and Critical Care Medicine. 189 (9), 1082-1092 (2014).
  5. McKelvey, M. C., Weldon, S., McAuley, D. F., Mall, M. A., Taggart, C. C. Targeting proteases in cystic fibrosis lung disease paradigms, progress, and potential. American Journal of Respiratory and Critical Care Medicine. 201 (2), 141-147 (2020).
  6. Clancy, D. M., et al. Extracellular Neutrophil Proteases Are Efficient Regulators of IL-1, IL-33, and IL-36 Cytokine Activity but Poor Effectors of Microbial Killing. Cell Reports. 22 (11), 2937-2950 (2018).
  7. Giacalone, V. D., Margaroli, C., Mall, M. A., Tirouvanziam, R. Neutrophil adaptations upon recruitment to the lung: New concepts and implications for homeostasis and disease. International Journal of Molecular Sciences. 21 (3), 1-21 (2020).
  8. Sly, P. D., et al. Risk Factors for Bronchiectasis in Children with Cystic Fibrosis. New England Journal of Medicine. 368 (21), 1963-1970 (2013).
  9. Owen, C. A., Campbell, M. A., Sannes, P. L., Boukedes, S. S., Campbell, E. J. Cell surface-bound elastase and cathepsin G on human neutrophils: A novel, non-oxidative mechanism by which neutrophils focus and preserve catalytic activity of serine proteinases. Journal of Cell Biology. 131 (3), 775-789 (1995).
  10. Brinkmann, V., et al. Neutrophil Extracellular Traps Kill Bacteria. Science. 303 (5663), 1532-1535 (2004).
  11. Margaroli, C., et al. Elastase Exocytosis by Airway Neutrophils Associates with Early Lung Damage in Cystic Fibrosis Children. American Journal of Respiratory and Critical Care Medicine. , (2018).
  12. Owen, C., Campbell, M. A., Sannes, P. L., Boukedes, S. S., Carolina, N. Cell surface-bound elastase and cathepsin G on human neutrophils: a novel, non-oxidative mechanism by which neutrophils focus and preserve catalytic activity of serine proteinases. The Journal of cell biology. 131 (3), 775-789 (1995).
  13. Garland, M., Yim, J. J., Bogyo, M. A Bright Future for Precision Medicine: Advances in Fluorescent Chemical Probe Design and Their Clinical Application. Cell chemical biology. 23 (1), 122-136 (2016).
  14. Gehrig, S., Mall, M. A., Schultz, C. Spatially resolved monitoring of neutrophil elastase activity with ratiometric fluorescent reporters. Angewandte Chemie - International Edition. 51 (25), 6258-6261 (2012).
  15. Guerra, M., et al. Cathepsin G Activity as a New Marker for Detecting Airway Inflammation by Microscopy and Flow Cytometry. ACS Central Science. 5 (3), 539-548 (2019).
  16. Hu, H. Y., et al. In vivo imaging of mouse tumors by a lipidated cathepsin S substrate. Angewandte Chemie - International Edition. 53 (29), 7669-7673 (2014).
  17. Korkmaz, B., et al. Measuring elastase, proteinase 3 and cathepsin G activities at the surface of human neutrophils with fluorescence resonance energy transfer substrates. Nature Protocols. 3 (6), 991-1000 (2008).
  18. Craven, T. H., et al. Super-silent FRET Sensor Enables Live Cell Imaging and Flow Cytometric Stratification of Intracellular Serine Protease Activity in Neutrophils. Scientific Reports. 8 (1), 13490(2018).
  19. Mu, J., et al. A small-molecule fret reporter for the real-time visualization of cell-surface proteolytic enzyme functions. Angewandte Chemie - International Edition. 53 (52), 14357-14362 (2014).
  20. Hagner, M., et al. New method for rapid and dynamic quantification of elastase activity on sputum neutrophils from patients with cystic fibrosis using flow cytometry. European Respiratory Journal. 55 (4), 1902355(2020).
  21. Dittrich, A. S., et al. Elastase activity on sputum neutrophils correlates with severity of lung disease in cystic fibrosis. European Respiratory Journal. , 1701910(2018).
  22. Cobos-Correa, A., Trojanek, J. B., Diemer, S., Mall, M. A., Schultz, C. Membrane-bound FRET probe visualizes MMP12 activity in pulmonary inflammation. Nature Chemical Biology. 5 (9), 628-630 (2009).
  23. Hu, H. -Y., et al. FRET-based and other fluorescent proteinase probes. Biotechnology Journal. 9 (2), 266-281 (2014).
  24. Trojanek, J. B., et al. Airway mucus obstruction triggers macrophage activation and matrix metalloproteinase 12-dependent emphysema. American Journal of Respiratory Cell and Molecular Biology. 51 (5), 709-720 (2014).
  25. Wagner, C. J., Schultz, C., Mall, M. A. Neutrophil elastase and matrix metalloproteinase 12 in cystic fibrosis lung disease. Molecular and Cellular Pediatrics. 3 (1), 25(2016).
  26. Gaggar, A., et al. The role of matrix metalloproteinases in cystic fibrosis lung disease. The European respiratory journal. 38 (3), 721-727 (2011).
  27. Guerra, M., et al. Protease FRET Reporters Targeting Neutrophil Extracellular Traps. Journal of the American Chemical Society. 142 (48), 20299-20305 (2020).
  28. Middleton, P. G., et al. Elexacaftor-Tezacaftor-Ivacaftor for Cystic Fibrosis with a Single Phe508del Allele. New England Journal of Medicine. 381 (19), 1809-1819 (2019).

Herprints en machtigingen

Toestemming aanvragen om de tekst of afbeeldingen van dit JoVE-artikel te hergebruiken

Toestemming aanvragen

Trefwoorden

Neutrofiel elastase activiteitneutrofiele serineproteasenFRET reporterassayflowcytometrieconfocale microscopieplaatlezer metingencystische fibrose biomarkersprotease bij luchtwegziekten

Gerelateerde artikelen