Hier worden methoden beschreven die worden gebruikt om het functionele effect van RYR1-mutaties te bestuderen die endogeen tot expressie komen in epstein barr-virus vereeuwigde menselijke B-lymfocyten en spierbiopsie afgeleide satellietcellen gedifferentieerd in myotubes.
Een abonnement op JoVE is vereist om deze inhoud te bekijken. Log in of start vandaag met uw gratis proefperiode.
Methodenartikel
Functionele karakterisering van endogene uitgedrukte menselijke RYR1-varianten
In dit artikel
Samenvatting
Samenvatting
Meer dan 700 varianten in het RYR1-gen zijn geïdentificeerd bij patiënten met verschillende neuromusculaire aandoeningen, waaronder maligne hyperthermiegevoeligheid, kernmyopathieën en centronucleaire myopathie. Vanwege de diverse fenotypen die verband houden met RYR1-mutaties is het van fundamenteel belang om hun functionele effecten te karakteriseren om varianten te classificeren die door patiënten worden gedragen voor toekomstige therapeutische interventies en niet-pathogene varianten te identificeren. Veel laboratoria zijn geïnteresseerd in het ontwikkelen van methoden om RYR1-mutaties in cellen van patiënten functioneel te karakteriseren. Deze aanpak heeft tal van voordelen, waaronder: mutaties worden endogeen tot expressie gebracht, RyR1 wordt niet overexpressie gegeven, het gebruik van heterologe RyR1-expressiecellen wordt vermeden. Omdat patiënten echter naast RYR1 mutaties in verschillende genen kunnen vertonen, is het belangrijk om resultaten van biologisch materiaal te vergelijken van personen met dezelfde mutatie, met verschillende genetische achtergronden. Het huidige manuscript beschrijft methoden die zijn ontwikkeld om de functionele effecten van endogene tot expressie gebrachte RYR1-varianten te bestuderen in: (a) Epstein Barr-virus vereeuwigde menselijke B-lymfocyten en (b) satellietcellen afgeleid van spierbiopten en gedifferentieerd in myotubes. Veranderingen in de intracellulaire calciumconcentratie veroorzaakt door de toevoeging van een farmacologische RyR1-activatoren worden vervolgens gecontroleerd. Het geselecteerde celtype wordt geladen met een ratiometrische fluorescerende calciumindicator en intracellulaire [Ca2+] veranderingen worden gecontroleerd op het niveau van één cel door fluorescentiemicroscopie of in celpopulaties met behulp van een spectrofluorometer. De rust [Ca2+], agonist dosisresponscurven worden vervolgens vergeleken tussen cellen van gezonde controles en patiënten met RYR1-varianten, wat leidt tot inzicht in het functionele effect van een bepaalde variant.
Inleiding
Tot op heden zijn meer dan 700 RYR1-varianten geïdentificeerd in de menselijke populatie en gekoppeld aan verschillende neuromusculaire aandoeningen, waaronder maligne hyperthermiegevoeligheid (MHS), door inspanning geïnduceerde rabdomyolyse, centrale kernziekte (CCD), multi-minicoreziekte (MmD), centronucleaire myopathie (CNM)1,2,3 ; niettemin blijven studies om hun functionele effecten te karakteriseren achter en slechts ongeveer 10% van de mutaties is functioneel getest. Verschillende experimentele benaderingen kunnen worden gebruikt om de impact van een bepaalde RyR1-vari....
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Protocol
De hieronder beschreven protocollen voldoen aan de ethische richtlijnen van de Ethikkommission Nordwest- und Zentralschweiz EKNZ.
1. Bereiding van Epstein Barr vereeuwigde B-lymfocyten cellijnen11
- Verzamel na geïnformeerde toestemming 30 ml volbloed in met EDTA behandelde steriele buisjes uit de proband met een RYR1-mutatie en van gezonde familieleden zonder mutatie.
OPMERKING: Houd alle oplossingen steriel en werk in een weefselkweekkap. - Isoleer mononucleaire cellen uit volbloed door middel van dichtheidsgradiënt centrifugatiemedia (bijv. Ficoll-Hypaque, .077 g / L).
- Plaats 30 ml steri....
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Resultaten
[Ca2+]i metingen in populaties van EBV-vereeuwigde B-lymfocyten
Primaire B-lymfocyten drukken de RyR1-isovorm uit die functioneert als een Ca2+ afgiftekanaal tijdens B-cel antigeenreceptor gestimuleerde signaleringsprocessen17. Onsterfelijkheid van B-cellen met EBV, een procedure die routinematig door genetici wordt gebruikt om cellijnen te verkrijgen die genomische informatie .......
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Discussie
De protocollen die in dit artikel worden beschreven, zijn met succes gebruikt door verschillende laboratoria om de impact van RYR1-mutaties op calciumhomeostase te bestuderen. De kritische stappen van de benaderingen die in dit artikel worden beschreven, hebben betrekking op steriliteit, celkweekvaardigheden en -technieken en beschikbaarheid van biologisch materiaal. In principe is het gebruik van EBV-vereeuwigde B-lymfocyten eenvoudiger en kan men cellijnen genereren die mutante RyR1-kanalen bevatten. De cellen kunnen v.......
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Openbaarmakingen
De auteurs hebben niets te onthullen.
Dankbetuigingen
Het werk beschreven in dit manuscript werd ondersteund door subsidies van de Swiss National Science Foundation (SNF) en de Swiss Muscle Foundation.
....Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Materialen
| Naam | Bedrijf | Catalogusnummer | Opmerkingen |
|---|---|---|---|
| 4-chloro-m-cresol | Fluka | 24940 | |
| Bloedopnamebuisjes | Sarstedt | 172202 | |
| Bovine serum albumine (BSA) | Sigma-Aldrich | A7906 | |
| cafeïne | Merk | 102584 | |
| Cascade 125+ CCD-camera | Photometrics | ||
| Cascade 128+ CCD | Photometrics | ||
| Creatine | Sigma-Aldrich | C-3630 | |
| DMEM | ThermoFisher Scientific | 11965092 | |
| DMSO | Sigma | 41639 | |
| EGTA | Fluka | 3778 | |
| Epidermale groeifactor (EGF) | Sigma-Aldrich | E9644 | |
| Ficoll Paque | Cytiva | 17144002 | |
| Foetaal runderserum | ThermoFisher Scientific | 26140079 | |
| Fura-2/AM | Invitrogen Life Sciences | F1201 | |
| Glutamax | Thermo Fisher Scientific | 35050061 | |
| HEPES | ThermoFisher Scientific | 15630049 | |
| Paarden serum | Thermo Fisher Scientific | 16050122 | |
| Insulin | ThermoFisher Scientific | A11382II | |
| Ionomycin | Sigma | I0634 | |
| KCl | Sigma-Aldrich | P9333 | |
| Laminine | ThermoFisher Scientific | 23017015 | |
| Lanthaan | Fluka | 61490 | |
| Microperfusiesysteem | ALA-Scientific | DAD VM 12 kleppenpaneel | |
| Origin Software | OriginLab Corp | Software | |
| Pennicilline/Streptomycine | Gibco Life Sciences | 15140-122 | |
| Perfusiekamer POC-R | Pecon | 000000-1116-079 | |
| poly-L-lysine | Sigma-Aldrich | P8920 | |
| RPMI | ThermoFisher Scientific | 21875091 | |
| Spectrofluorimeter | Perkin Elmer | LS50 | |
| Thapsigargin | Calbiochem | 586005 | |
| Weefselkweekschalen | Falcon | 353046 | |
| Weefselkweekflacon | Falcon | 353107 | |
| Weefselkweekinzetstukken | Falcon | 353090 | |
| Trypsine/EDTA-oplossing | ThermoFisher Scientific | 25300054 | |
| Visiview | Visitron Systems GmbH | Software | |
| Zeiss Axiovert S100 TV-microscoop | Carl Zeiss AG | ||
| Zeiss glazen dekglasjes | Carl Zeiss AG | 0727-016 |
Referenties
- Dlamini, N., et al. Mutations in RYR1 are a common cause of exertional myalgia and rhabdomyolysis. Neuromuscular Disorders. 23 (7), 540-548 (2013).
- Klein, A., et al. Clinical and genetic findings i....
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Herprints en machtigingen
