Studies met hoge resolutie van eiwitten in natuurlijke membranen door middel van vastestof-NMR

Samenvatting

Dit werk beschrijft robuuste basisroutines voor het bereiden van isotoop-gelabelde membraaneiwitmonsters en het analyseren ervan met hoge resolutie met moderne solid-state NMR-spectroscopiemethoden.

Samenvatting

Membraaneiwitten zijn van vitaal belang voor de celfunctie en vertegenwoordigen dus belangrijke doelwitten voor geneesmiddelen. Solid-state Nuclear Magnetic Resonance (ssNMR) spectroscopie biedt een unieke toegang om de structuur en dynamiek van dergelijke eiwitten te onderzoeken in biologische membranen van toenemende complexiteit. Hier presenteren we moderne solid-state NMR-spectroscopie als een hulpmiddel om de structuur en dynamiek van eiwitten in natuurlijke lipidemembranen en op atomaire schaal te bestuderen. Dergelijke spectroscopische studies profiteren van het gebruik van zeer gevoelige ssNMR-methoden, d.w.z. proton-(¹H)-gedetecteerde ssNMR en DNP (Dynamic Nuclear Polarization) ondersteunde ssNMR. Met behulp van bacterieel buitenmembraan bèta-barrel eiwit BamA en het ionenkanaal KcsA, presenteren we methoden om isotoop-gelabelde membraaneiwitten te bereiden en om structurele en bewegingsinformatie af te leiden door ssNMR.

Inleiding

Structurele en bewegingsstudies van membraaneiwitten in fysiologisch relevante omgevingen vormen een uitdaging voor traditionele structurele biologietechnieken¹. Moderne solid-state nucleaire magnetische resonantiespectroscopie (ssNMR) -methoden bieden een unieke benadering voor de karakterisering van membraaneiwitten ^2,3,4,5,6,7 en worden al lang gebruikt om membraaneiwitten te bestuderen, waaronder in membraan ingebedde eiwitpompen⁸, kanalen ^9,10,11 of receptoren ^12,13,14,15. Technische ontwikkelingen zoals ultrahoge magnetische velden >1.000 MHz, snelle spinfrequenties met magische hoek >100 kHz en hyperpolarisatietechnieken¹⁶ hebben ssNMR tot een krachtige methode gemaakt voor de studie van membraaneiwitten in omgevingen van steeds toenemende complexiteit, van liposomen tot celmembranen en zelfs hele cellen. DNP is bijvoorbeeld een krachtig hulpmiddel geworden voor dergelijke experimenten (zie referentie 17,18,19,20,21,22,23,24,25). Meer recent biedt ¹H-gedetecteerd ssNMR toenemende mogelijkheden om membraaneiwitten te bestuderen met een hoge spectrale resolutie en gevoeligheid 25,26,27,28,29. Dit werk belicht twee bacteriële membraaneiwitten die betrokken zijn bij essentiële functies, namelijk eiwitinsertie en ionentransport. De corresponderende eiwitten, BamA 25,30,31,32,33 en KcsA 23,27,28,34,35,36,37,38,39 (of chimere varianten daarvan ^10,40) zijn onderzocht door ssNMR methoden voor meer dan een decennium.

Een representatief protocol voor de bereiding en ssNMR-karakterisering van bacterieel oorsprong membraaneiwitten wordt hier gepresenteerd. De verschillende stappen van het protocol zijn weergegeven in figuur 1. Eerst wordt de expressie, isotopenlabeling, zuivering en membraanreconstitutie van BamA uitgelegd. Vervolgens wordt een algemene workflow voor de karakterisering van het membraaneiwit door ssNMR gepresenteerd; in het bijzonder, de toewijzing van membraaneiwitruggengraat met behulp van ¹H-gedetecteerde ssNMR bij snelle magische hoekspinning. Ten slotte worden de basisopzet en verwerving van dynamische nucleaire polarisatie-ondersteunde experimenten, die de gevoeligheid van het ssNMR-signaal aanzienlijk verhogen, gedetailleerd.

Protocol

1. Productie van uniform geëtiketteerd ²H, ¹³C, ¹⁵N-gelabeld BamA-P4P5

OPMERKING: Hoewel dit protocol het werken met niet-pathogene Gram-negatieve bacteriën vereist, is het naleven van biologische basisveiligheidsprocedures een must, namelijk het dragen van een veiligheidsbril, laboratoriumjassen, handschoenen en het volgen van institutionele standaardprocedures voor het werken met micro-organismen.

1. Gebruik een enkele kolonie E. coli BL 21 Star (DE3) die het pET11aΔssYaeT-plasmide bevat dat codeert voor E. coli BamA-P4P5 om 50 ml lysogeniebouillon te inoculeren, aangevuld met 50 μg/l ampicilline.
2. Kweek de teelt bij 37 °C bij 200 tpm tot een OD₆₀₀ van 0,6 is bereikt. Centrifugeer gedurende 10 minuten op 2.000 x g . Resuspendeer de pellet in 50 ml M9 (zie tabel 1) tot een maximale OD₆₀₀ van 0,1.
   LET OP: Alle toekomstige teeltstappen vinden plaats onder de hierboven vermelde voorwaarden, tenzij anders vermeld.
3. Laat de cultuur groeien tot OD₆₀₀ van 0,5. Centrifugeer op 2.000 x g gedurende 10 minuten op kamertemperatuur. Resuspendeer de pellet in 50 ml M9 met 90% D₂O (zie tabel 1 voor het recept) tot een maximum OD₆₀₀ van 0,1. Laat de cultuur 's nachts groeien bij 30 °C bij 200 tpm.
4. Draai de cultuur 10 minuten op 2.000 x g op kamertemperatuur. Resuspendeer de pellet in de voorverwarmde 50 ml 90% D₂O M9 tot een maximale OD₆₀₀ van 0,1. Groei tot een OD₆₀₀ van 1.0 is bereikt.
5. Draai de cultuur 10 minuten op 2.000 x g op kamertemperatuur. Bereid 100 ml 100% D₂O M9-medium met met isotoop verrijkte hoeveelheden niet-verrijkte glucose en ammoniumchloride. Resuspendeer in 100% D₂O M9 medium tot een maximale OD₆₀₀ van 0,1. Groei tot een OD₆₀₀ van 0,7 is bereikt.
6. Draai de cultuur 10 minuten op 2.000 x g op kamertemperatuur. Gooi het bovenstaande weg en suspendeer de pellet in 500 ml 100% D₂O M9-medium met isotopen (zie tabel 1) tot een maximale OD₆₀₀ van 0,1.
7. Laat de cultuur groeien tot een OD₆₀₀ van 0,6-0,9 is bereikt. Induceren met 1 mM isopropyl β-D-1-thiogalactopyranoside (IPTG). Kolf gedurende 4 uur en oogst de cellen bij 4.000 x g gedurende 15 minuten bij kamertemperatuur.

2. Zuivering, hervouwing en vorming van BamA-P4P5 proteo-liposoom

NOTITIE: Alle stappen van dit hoofdstuk moeten in een zuurkast worden uitgevoerd. Speciale aandacht moet worden besteed aan het openen van buisjes, nacentrifugatie beperkt schadelijke aerosolen.

1. Ontdooi de pellet op ijs. Resuspendeer de pellet in 20 ml koude Buffer 1. Zie Tabel 2 voor de buffers.
2. Draai de oplossing gedurende 20 minuten bij 4.000 x g bij 4 °C af. Resuspendeer de pellet in 20 ml koud gedistilleerde H₂O. Laat de suspensie 10 minuten op ijs incuberen.
3. Centrifugeer de suspensie op 4.000 x g gedurende 20 minuten bij 4 °C. Resuspendeer in 10 ml koude Buffer 2 en laat 30 minuten op ijs incuberen.
4. Vul het mengsel aan met nog eens 10 ml koudebuffer 2 en incubeer nog 30 minuten op ijs. Voeg 0,5% n-Dodecyl-B-D-Maltoside (DDM) toe en roer voorzichtig.
5. Sonificeer de sample op ijs bij 13 kHz tot vicieus gebruik 10 s lange aan/uit-pulsen. Centrifugeer op 25.000 x g gedurende 20 minuten bij 4 °C. Was driemaal met 20 ml Buffer 3. Centrifugeren bij 25.000 x g gedurende 20 minuten bij 4 °C.
6. Resuspendeer de pellet in 20 ml Buffer 4. Incubeer gedurende 30 minuten bij 37 °C. Sonificeer de sample op ijs bij 13 kHz, tot 10 s lange aan/uit-pulsen voor helder gebruik.
7. Draai het monster gedurende 20 minuten bij 25.000 x g bij 4 °C. Herhaal de stappen 2.4 tot en met 2.6 en laat de toevoeging van de proteaseremmer en de incubatie bij 37 °C achterwege.
8. Was de korrel met 20 ml water en twee keer met Buffer 3. Centrifugeer op 25.000 x g gedurende 20 minuten bij 4 °C. Verdeel de suspensie in microcentrifugebuisjes van 1 ml en draai de microcentrifugebuisjes gedurende 20 minuten op maximale snelheid op een tafelcentrifuge. De opname van de lichaamszuiverheid wordt beoordeeld aan de hand van 10% SDS-Page gel, zie Figuur 2A. De verwachte opbrengst voor gezuiverd BamA-P4P5 drievoudig (²H, ¹³C, ¹⁵N) gelabeld is 30 mg/L.
9. Solubiliseren van inclusielichamen in 200 μL Buffer 5 en 300 μL H₂O. Voeg 6M guanidiumchloride (GdnCl) toe. Stel het volume van de microcentrifugebuis in op 1 ml met H₂O. Draai het mengsel en incubeer gedurende 4 uur bij kamertemperatuur. Draai de microcentrifugebuisjes periodiek (elke 30 minuten) vooruit.
10. Centrifugeer op 100.000 x g gedurende 1 uur bij 4 °C. Gebruik de wet van Beer-Lambert om de eiwitconcentratie te bepalen met 280 nm. De molaire extinctiecoëfficiënt is 117.120 ^{M-1 cm-1}. Als de concentratie >100 μM is, verdun dan met 1x Buffer 5 met 6 M GdnCl. Verdun het eiwit snel 10x in Buffer 6. Incubeer het mengsel een nacht bij kamertemperatuur.
    OPMERKING: Gebruik voor ultracentrifugatie buizen van 1.5 ml van ultracentrifugatiekwaliteit.
11. Bepaal de efficiëntie van het hervouwen met behulp van een semi-native SDS-Page-gel. Neem twee aliquots van 10 μl uit stap 2.10 en voeg 10 μl Lameili-buffer (buffer 8) toe aan elk aliquot. Kook één monster gedurende 10 minuten bij 95 °C; Laat het andere deel op ijs liggen. Laat vervolgens beide monsters op 14 mA draaien op een 10% SDS-Page gel. De stapel- en lopende delen van de gels missen reductiemiddel en SDS. Eiwitkleuring wordt bereikt met behulp van Coomassie-kleurstof. De verwachte resultaten zijn weergegeven in figuur 2B.
12. Draai het monster gedurende 20 minuten bij 4.000 x g bij 4 °C. Concentreer het monster tot een werkvolume van 8 ml met behulp van een centrifugaalfilter van 30 kDa. Draai het monster 20 minuten bij 4.000 x g bij 4 °C. Meet de eiwitabsorptie bij 280 nm. Bepaal net als in stap 2.10 de eiwitconcentratie.
13. Bereken de hoeveelheid lipide die nodig is voor een lipide-eiwitverhouding van 10:1 (LPR-mol/mol). Voeg uit een chloroformvoorraad de benodigde hoeveelheid lipiden, zoals berekend in stap 2.12, toe aan een ronde bodemkolf van 100 ml (RBF). Evacueer de chloroform uit de RBF onder een zachte stroom stikstof. Plaats RBF 3 uur op hoog vacuüm. Hydrateer de lipidenfilm met 1 ml Buffer 7. Incubeer de RBF gedurende 10 minuten bij 37 °C.
14. Voeg het eiwitmengsel (uit stap 2.12) toe aan de RBF.
15. Verdun het eiwit/lipidenmengsel (vanaf stap 2.14) tot het uiteindelijke volume van 50 ml in de RBF. Gebruik Buffer 7 aangevuld met 1x proteaseremmer opgelost in DMSO en incubeer gedurende 30 minuten bij 37 °C.
16. Dialyseer tegen 100 volumes Buffer 7 gedurende 2 weken (gebruik 12-14 kDa dialyseslang met moleculair gewicht). Voer de dialyse de eerste 24 uur uit bij kamertemperatuur met toevoeging van verse Buffer 7 om de 8 uur. Vervang daarna eenmaal daags de buffer en voer de dialyse uit bij 4 °C.

3. Vullen van de ssNMR-rotor

1. Centrifugeer na stap 2.16 30-60 minuten bij 10.000 x g bij 4 °C zodat er een pellet ontstaat. Verwijder het bovenstaande met een pipet.
   OPMERKING: De hieronder besproken techniek is geoptimaliseerd voor een rotor van 3,2 mm, maar is toepasbaar voor bijna elke rotordiameter.
2. Pipetteer het monster in de rotor en draai het voorzichtig naar beneden met een tafelcentrifuge.
   OPMERKING: Afhankelijk van de consistentie van het monster, kan men een verdichtingstool gebruiken om het monster te verdichten, of een spatel in plaats van een pipet om het monster in de rotor te plaatsen.
3. Herhaal dit proces 2-3x totdat de rotor op de juiste hoogte is gevuld en controleer of er voldoende ruimte over is voor de dop, zoals aangegeven door de markeringslijn op het verdichtingsgereedschap. Sluit de rotor met het kappositioneringsgereedschap op een vlakke ondergrond. Markeer de helft van de onderkant van de rotor.
   OPMERKING: Nieuwe generaties ssNMR-rotoren worden geleverd met een duurzame lasermarkering aan de onderkant voor de optische detectie van de rotorrotatiefrequentie. Anders wordt het gebruik van een sharpie-pen voorgesteld; de MAS-detector is namelijk speciaal geoptimaliseerd voor sharpie-inkt.
4. Gebruik een vergrootglas om te controleren of de dop goed zit.

4. Monsterkarakterisering door 2D ¹³C- ¹³C ssNMR-spectroscopie

1. Steek de rotor in de magneet, gebruik de automatische draairoutine van de MAS-eenheid, draai het monster tot de gewenste MAS-frequentie tussen 10 en 20 kHz MAS terwijl het monster wordt afgekoeld tot de ingestelde temperatuur van 270 K. Stem af en match de ¹H- en ¹³C-kanalen.
   OPMERKING: Vermijd bij de keuze van de MAS-frequentie het per ongeluk afstemmen van de chemische verschuivingsafstand tussen het spectrale Cα-gebied en het carbonylkoolstofgebied op de draaifrequentie, d.w.z. vermijd de eerste orde rotatieresonantievoorwaarde⁴¹.
2. Optimaliseer een ^{1 H-13}C cross-polarisatie⁴² (CP) experiment door het rf-vermogen op het protonkanaal te variëren van 25-80 kHz. Typische parameters zijn 45 kHz rf-vermogen op ¹³C, 80-100 kHz heteronucleair ¹H-ontkoppeling⁴³ tijdens acquisitie, 1,8-2,0 s recyclevertraging en 64 scans.
   1. Optimaliseer de CP-contacttijd voor maximale signaalgevoeligheid op de alifatische koolstoffen.
   2. Bepaal de pulslengte van ¹uur 90° in het ¹³C-CP-experiment door de startpuls met vier te vermenigvuldigen, d.w.z. door een puls van 360° te optimaliseren, en varieer de lengte totdat het signaal is verdwenen. Voeg een rechthoekige puls toe direct na de CP-overdracht en optimaliseer de ^{pulslengte van 13}C 90° analoog.
3. Voer een 2D ^{13 C-13}C proton-driven spin diffusion (PDSD)-type experiment uit, zoals PARIS met een magnetisatieoverdrachtstijd van 30 ms om intra-residuele correlaties te detecteren en de monsterkwaliteit te meten. Overdracht van de vermogensniveaus, de contacttijd en 90° pulslengtes van het eerder geoptimaliseerde ¹³C-CP-experiment. Gebruik een acquisitietijd van 4-6 ms in de indirecte dimensie. Verwerk het spectrum met kwadratische sin bell-functies (QSIN) of, voor ongevoelige monsters, exponentiële lijnverbreding in beide dimensies.
4. Extraheer plakjes van geïsoleerde dwarspieken en bepaal de lijnbreedte op halve hoogtes. Een lijnbreedte tussen ~0,3-1,0 ¹³C ppm is een indicatie van een goed geordende steekproef, ideaal voor ssNMR-karakterisering, terwijl een lijnbreedte boven 1,0 ¹³C ppm een indicatie is van conformationele heterogeniteit die de ssNMR-karakterisering in gevaar kan brengen. Het 2D CC PARIJS-spectrum van BamA dat in figuur 3A wordt getoond, is een voorbeeld van een goed geordend eiwit dat spectra van hoge kwaliteit geeft.

5. Backbone-toewijzing door ¹H-gedetecteerde 3D ssNMR-spectroscopie

1. Acquisitie van 2D NH spectrale vingerafdrukken
   1. Vul het monster in een rotor van 1,3 mm, zoals hierboven beschreven. Plaats de rotor in de magneet, draai het monster tot 10-20 kHz MAS en koel het monster af tot een ingestelde temperatuur van 240-250 K of lager, afhankelijk van de specificaties van de ssNMR-sondekop. Gebruik de MAS-unitinterface om de MAS-frequentie geleidelijk te verhogen in stappen van 5 kHz tot 60 kHz MAS.
   2. Optimaliseer de CP-amplitudes, contacttijden en 90°-pulslengtes in ¹³C- en ¹⁵N CP-experimenten. Gebruik amplitudes rond 30-50 of 70-100 kHz op de heteronucleaire kanalen en varieer de amplitude op het ¹H-kanaal van 80-180 kHz. Gebruik een recyclingvertraging van 0,7-1,2 s, samen met 15 kHz low-power heteronucleaire protonontkoppeling⁴⁴. Zie ook referentie⁴⁵ voor meer praktische details over het opzetten van CP ssNMR-experimenten.
   3. Verkrijg een 2D NH-experiment om de ¹H-resolutie te meten. Draag de ¹⁵N-CP-parameters over en gebruik ongeveer 15 en 25 ms acquisitietijd in de directe en indirecte dimensies. Gebruik voor de eerste overdracht van ¹H tot ¹⁵N CP de eerder geoptimaliseerde contacttijd. Gebruik voor de terugoverdracht van ¹⁵N tot ¹uur een contacttijd van 0,7-1,0 ms om de overdracht van interresterende magnetisatie te minimaliseren.
   4. Gebruik 50-250 ms water MISSISSIPPI-onderdrukking⁴⁶, afhankelijk van het watergehalte van het monster. Verwerk het spectrum met kwadraat zonde bel functies (QSIN) in beide dimensies. Extraheer plakjes van geïsoleerde dwarspieken en bepaal de lijnbreedte op halve hoogtes. Een voorbeeld voor een hoogwaardig 2D NH-spectrum²⁵ wordt getoond voor in membraan ingebedde BamA-P4P5 in figuur 3B.
2. Backbone opdrachten
   1. Optimaliseer een 1D ¹⁵N tot ¹³Cα specifiek CP-experiment⁴⁷. Plaats de ¹³C draaggolf in het midden van het Cα-gebied rond 55 ppm. Gebruik een ¹³C rf amplitude van 20 kHz en varieer de ¹⁵N amplitude van 35 tot 45 kHz voor maximale overdracht naar de Cα-signalen en minimale overdracht naar de carbonylsignalen. Optimaliseer de contacttijd van 3 tot 10 ms in stappen van 1 ms.
   2. Voer een 3D CαNH-experiment uit. Draag alle CP-amplitudes, contacttijden en pulslengtes van de eerder geoptimaliseerde stappen over. Gebruik ongeveer 10 ms en 30 ms in de dimensies indirecte en directe acquisitie. Verwerk het spectrum met kwadraat zonde bel functies (QSIN) in alle drie de dimensies.
   3. Optimaliseer een 1D Cα naar CO DREAM magnetisatieoverdracht⁴⁸. Begin met een specifieke CP-overdracht van ¹⁵N tot ¹³Cα. Breng vervolgens de magnetisatie over van Cα naar CO met behulp van een spinvergrendeling op het ¹³C-kanaal. Varieer de rf-amplitude van 20 tot 35 kHz voor een optimale overdracht. Optimaliseer de overdrachtstijd van 4 tot 10 ms.
   4. Voer een 3D Cα(CO)NH-experiment uit. Draag alle rf-amplitudes, contacttijden en pulslengtes van de eerder geoptimaliseerde stappen over. Gebruik ongeveer 10 ms en 30 ms in de dimensies indirecte en directe acquisitie. Verwerk het spectrum met kwadraat zonde bel functies (QSIN) in alle drie de dimensies.
   5. Herhaal en pas stap 1-4 aan voor de analoge 3D CORH- en CO(Cα)NH-experimenten. Gebruik dit kwartet van 3D-experimenten voor sequentiële Cα- en CO-wandelingen om de eiwitruggengraat toe te wijzen, zoals weergegeven in het voorbeeld van KcsA in Figuur 4²⁸.

6. Eiwitdynamica door ¹H-gedetecteerde ssNMR-spectroscopie

1. Gebruik voor ¹⁵N T_{1-onderzoeken} het eerder geoptimaliseerde 2D NH-experiment bij 60 kHz MAS en neem een vertraging op na de eerste kruispolarisatiestap van ¹uur tot ¹⁵N. Verkrijg een reeks 2D NH-experimenten en varieer de vertraging van 0 tot 16 s met behulp van stappen van bijvoorbeeld 0, 2, 4, 8 en 16 s.
2. Plot de genormaliseerde intensiteiten voor opgeloste signalen als functie van de toenemende vertragingstijd. Pas het T_1-verval aan op enkele exponentiële getallen volgens y = exp^(-x/T1), waarbij y de signaalintensiteit is op vervaltijd x.
3. Analoog neemt u voor ¹⁵N_{T 1rho-onderzoeken} een spin-lock-puls op in het pulsprogramma op het ¹⁵N-kanaal met een rf-amplitude tussen 15-20 kHz na de eerste ¹H tot ¹⁵N kruispolarisatiestap^26,49. Verkrijg een reeks 2D NH-experimenten en varieer de vertraging van 0 tot 150 ms en pas het T_1rho-verval van opgeloste signalen aan op enkele exponentialen. Illustratieve ¹⁵N T_{1rho-gegevens} worden getoond voor in membraan ingebedde K⁺-kanalen in figuur 5^27,28.

7. Dynamische nucleaire polarisatie

OPMERKING: De volgende voorbereidende stappen hebben betrekking op het gebruik van een commerciële DNP-opstelling met behulp van 3.2 mm saffier MAS-rotoren (Figuur 6)²⁰. Het gebruik van de zirkoniumoxiderotoren of andere DNP-apparatuur kan leiden tot lagere DNP-signaalverbeteringen.

1. Resuspendeer de membraaneiwitpellet (vanaf stap 3.1) in 50 μl gedeutereerde DNP-buffer (60% (v/v) gedeutereerd d8- en glycerol, en 15 mM AMUPol⁵⁰. Voor experimenten op 800 MHz raden we aan om 10 mM NATriPOL-3⁵¹ te gebruiken. Zie ook referentie⁵² voor verdere praktische aspecten van DNP ssNMR-experimenten.
2. Centrifugeer gedurende 10-20 minuten bij 100.000 x g bij 4 °C zodat er een pellet ontstaat. Verwijder het bovenstaande met een pipet.
3. Koel de centrifugaaladapter en de 3,2 mm saffier MAS-rotorcomponenten voor tot <4 °C. De volgende stappen (7.4-7.7) moeten zo snel mogelijk worden uitgevoerd om te voorkomen dat de DNP-agents worden verminderd.
4. Plaats de 3,2 mm saffierrotor in de centrifuge-adapter en vul deze met de suspensie van proteo-liposomen uit stap 7.2.
5. Pipetteer het geresuspendeerde membraaneiwitmonster voorzichtig tegen de binnenwand van de rotor met behulp van een pipetpunt van 200 μl. Laat de oplossing naar de bodem van de rotor glijden. Zorg ervoor dat er geen luchtbellen worden gevormd.
6. Draai het monster 5-10 minuten in de rotor bij 4.500 x g bij 4 °C. Verwijder het bovenstaande dat overtollig DNP-sap bevat door het voorzichtig uit te pipetteren zonder de celpellet te verstoren. Herhaal stap 6.4-6.6 totdat de rotor vol is.
7. Plaats het afstandsstuk van polytetrafluorethyleen (PTFE) voorzichtig met behulp van de afstandsschroef bovenop de rotor.
8. Plaats de rotor met de dop naar beneden in een rotorplunjer⁵³ en dompel de rotor onder in vloeibare stikstof. Wacht ten minste 30-60 s totdat de rotor en het monster zijn bevroren.
9. Start de warmtewisselaar op en laat de DNP-sonde afkoelen tot ~90K.
10. Zet de MAS-unit in de handmatige modus en stel de variabele temperatuur (VT) in op 135 l/u en de lager- en aandrijfgasstromen op ~6 l/u.
11. Schakel Eject in op de MAS-console .
12. Breng het bevroren monster uit stap 7.8 over van de vloeibare N2 in de monstervanger en plaats het in de sonde (zie ook referentie⁵³).
13. Verhoog de lagerdruk van de sonde (Bp) handmatig tot ~500 mbar voordat u de "Insert" inschakelt. Dit is aan te raden voor een stabiele en veilige rotatie van de rotor.
14. Verhoog de MAS-snelheid tot de gewenste waarde met behulp van de procedure beschreven in referentie⁵³.
15. Controleer op DNP-verbeteringen met en zonder microgolven met behulp van standaard 1D CP-experimenten (zie ook bijv. referentie^51,54) (Figuur 7) voordat u doorgaat met multidimensionale experimenten, bijv. 2D CC-experimenten beschreven in sectie 3 van dit artikel.

Resultaten

Figuur 2 toont representatieve gels voor de zuiverheid van het inclusielichaam (Paneel A) en het hervouwen van inclusielichamen (Paneel B3). Figuur 2 bevestigt de succesvolle zuivering van ^{13 C,15}N-gelabeld BamA-P4P5.

Figuur 3A toont een typisch 2D ^{13 C-13}C-spectrum van een goed geordend membraaneiwit, en Fi...

Discussie

Membraaneiwitten zijn belangrijke spelers bij de regulatie van vitale cellulaire functies, zowel in prokaryote als in eukaryote organismen; Het is dus van vitaal belang om hun werkingsmechanismen op atomaire resolutieniveaus te begrijpen. De bestaande structurele biologietechnieken hebben het wetenschappelijke begrip van membraaneiwitten vrij ver gebracht, maar zijn sterk afhankelijk van experimentele gegevens die zijn verzameld uit in vitro systemen zonder membranen. In dit artikel word...

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel

Naam	Bedrijf	Catalogusnummer	Opmerkingen
Ammonium molybdate	Merck	277908
Ammonium-15N Chloride	Cortecnet	CN80P50
Ampicillin	Sigma Aldrich	A9518
AMUpol	Cortecnet	C010P005
Benzonase	EMD Millipore Corp	70746-3
Boric acid	Merck	B6768
bromophenol blue	Sigma	B0126
calcium dichloride	Merck	499609
Choline chloride	Sigma	C-1879
Cobalt chloride	Merck	449776
Copper sulphate	Merck	C1297
D-Biotin	Merck	8512090025
Deuterium Oxide	Cortecnet	CD5251P1000
Dimethyl sulfoxide	Merck	D9170
Ethylenediaminetetraacetic acid	Sigma Aldrich	L6876
Folic acid	Sigma	F-7876
Glucose 13C + 2H	Cortecnet	CCD860P50
Glycerol	Honeywell	G7757
Glycerol (12C3, 99.95% D8, 98%)	Eurisotope	CDLM-8660-PK
glycerol (non-enriched)	Honeywell	G7757-1L
Glycine	Sigma Aldrich	50046
Guanidine hydrochloride	Roth Carl	NR.0037.1
Iron sulphate	Merck	307718
isopropyl β-D-1-thiogalactopyranoside	Thermofisher	R0392
Lysogeny Broth	Merck	L3022
Lysozyme	Sigma Aldrich	L6876
Magnesium chloride - hexahydrate	Fluka	63064
magnesium sulphate	Merck	M5921
monopotassium phosphate	Merck	1051080050
Myoinositol	Sigma	I-5125
n-Dodecyl-B-D-maltoside	Acros Organics	3293702509
N,N-Dimethyldodecylamine N-oxide	Merck	40236
Nicatinamide	Sigma	N-3376
Panthotenic acid	Sigma	21210-25G-F
protease inhibitor	Sigma	P8849
Pyridoxal-HCl	Sigma Aldrich	P9130
Riboflavin	Aldrich	R170-6
Sodium Chloride	Merck	K51107104914
Sodium dihydrogen phospahte - monohydrate	Sigma Aldrich	1,06,34,61,000
Sodium dodecyl sulfate	Thermo-scientific	28365
Sodium hydroxide	Merck	1,06,49,81,000
Sucrose	Sigma Life Science	S9378
Thiamine-HCl	Merck	5871
Tris-HCl	Sigma Aldrich	10,70,89,76,001
Zinc chloride	Merck	208086
E.coli BL21 DE3*	New England Biolabs	C2527
1.5 mL Ultra-tubes	Beckman Coulter	357448
30 kDa centrifugal filter	Amicon	UFC903024
3.2 mm sapphire DNP rotor with caps	Cortecnet	H13861
3.2 mm teflon insert	Cortecnet	B6628
3.2 mm sample packer/unpacker	Cortecnet	B6988
3.2 mm Regular Wall MAS Rotor	Cortecnet	HZ16913
3.2 mm Regular Wall MAS rotor	Cortecnet	HZ09244
Tool Kit for 3.2 mm Thin Wall rotor	Cortecnet	B136904
1.3 mm MAS rotor + caps	Cortecnet	HZ14752
1.3 mm filling tool	Cortecnet	HZ14714
1.3 mm sample packer	Cortecnet	HZ14716
1.3 mm cap remover	Cortecnet	HZ14706
1.3 mm cap set tool	Cortecnet	HZ14744
Dialysis tubing 12-14 kDa	Spectra/Por	132703
Sharpie - Black	Merck	HS15094