Method Article

Evaluatie en kwantificering van micro-epitheliale openingen in het darmslijmvlies met behulp van immunofluorescentiekleuring

DOI:

10.3791/62204

⸱

June 11th, 2021

 ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Departamento de Fisiología, Biofísica y Neurociencias del Centro de Investigación y de Estudios Avanzados (CINVESTAV), 2Departamento de Biomedicina Molecular, del Centro de Investigación y de Estudios Avanzados (CINVESTAV), 3Unidad de Investigación Epidemiológica en Endocrinología, y Nutrición (UIEEN), Hospital Infantil de México Federico Gomez, 4Laboratorio de Investigación en Inmunología y Proteómica, Hospital Infantil de México Federico Gómez

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Hier beschrijven we een nieuwe methode om de specifieke locatie te visualiseren waar de transcellulaire en paracellulaire permeabiliteit in het ontstoken colonslijmvlies wordt verbeterd. In deze test passen we een fluorescerende kleurstof van 10 kDa toe, geconjugeerd aan een lysinefixeerbaar dextran, om gebieden met hoge permeabiliteit (HPR) in het colonslijmvlies te visualiseren.

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Epitheelcellen die het darmslijmvlies bekleden, vormen een fysieke barrière die de luminale inhoud van het interstitium scheidt. Aantasting van de epitheliale barrière is in verband gebracht met de ontwikkeling van verschillende pathologieën, zoals inflammatoire darmaandoeningen (IBD). In het ontstoken slijmvlies komen oppervlakkige erosies of micro-erosies die epitheliale monolagen aantasten overeen met plaatsen met een hoge permeabiliteit. Er zijn verschillende mechanismen betrokken bij de vorming van micro-erosies, waaronder celafstoting en apoptose. Deze micro-erosies vertegenwoordigen vaak microscopisch kleine epitheelopeningen die willekeurig in de dikke darm zijn verdeeld. Visualisatie en kwantificering van die epitheliale openingen is naar voren gekomen als een belangrijk hulpmiddel om de functie van de darmepitheliale barrière te onderzoeken. Hier beschrijven we een nieuwe methode om de specifieke locatie te visualiseren waar de transcellulaire en paracellulaire permeabiliteit in het ontstoken colonslijmvlies wordt verbeterd. In deze test passen we een fluorescerende kleurstof van 10 kDa toe, geconjugeerd aan een lysinefixeerbaar dextran, om gebieden met hoge permeabiliteit (HPR) in het colonslijmvlies te visualiseren. Aanvullend gebruik van celdoodmarkers toonde aan dat HPR apoptotische brandpunten omvat waar epitheliale extrusie/afstoting plaatsvindt. Het hier beschreven protocol biedt een eenvoudige maar effectieve benadering om micro-erosies in de darm te visualiseren en te kwantificeren, wat een zeer nuttig hulpmiddel is in ziektemodellen, waarbij de darmepitheelbarrière wordt aangetast.

Introduction

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Het gastro-intestinale (GI) slijmvlies vormt een fysieke barrière die de extracellulaire omgeving en het interne gastheermilieu scheidt, en is betrokken bij de opname van voedingsstoffen, water en elektrolyten. De darmbarrière omvat een slijmlaag bestaande uit glycoproteïnen, een monolaag van epitheelcellen, en de onderliggende lamina propria zijn immuun en stromale cellen verblijven. Intestinale epitheelcellen die de fysieke barrière vormen, zijn met elkaar verbonden door verschillende eiwitcomplexen, waaronder de adherens junction (AJ), de tight junction (TJ) en de desmosomen (DM's). Aantasting van de epitheliale barrièrefunctie verhoogt de darmpermeabiliteit en maakt de translocatie van schadelijke stoffen en ziekteverwekkers van het lumen naar het interstitium1 mogelijk. Er is een toenemend aantal ziekten waarbij de epitheelbarrière is aangetast, zoals de inflammatoire darmaandoeningen (IBD) zoals de ziekte van Crohn (CD), colitis ulcerosa (CU) en onbepaalde colitis (IC). De incidentie van IBD neemt wereldwijd toe, met een prevalentie van bijna 0,5% in het Westen. Hoewel de oorzaken van IBD onduidelijk zijn, draagt de overmatige immuun-/ontstekingsreactie die in de darmwand wordt geactiveerd rechtstreeks bij aan de verstoring van de epitheliale barrière door het herstel van de darmepitheliale homeostasete beperken 2,3,4. Bovendien lopen patiënten met langdurige darmontsteking een hoog risico op het ontwikkelen van colorectale kanker (CRC)5. Andere pathologieën die verband houden met verstoring van de darmepitheelbarrière zijn het prikkelbare darmsyndroom, obesitas, coeliakie, niet-coeliakie glutengevoeligheid en voedselallergieën6. Om deze redenen is er dringend behoefte aan de ontwikkeling van experimentele benaderingen die het mogelijk maken de integriteit van de darmepitheelbarrière te analyseren in diermodellen die de pathogenese bij mensen nabootsen.

Hier evalueerden we de gastro-intestinale passieve paracellulaire en de transcellulaire permeabiliteit geassocieerd met een ontstekingsproces in het colonepitheel met behulp van een eenvoudige techniek. Om de transmurale stroming van macromoleculen te onderzoeken, maten we de passieve diffusie van FITC-dextran (4 kDa) en RITC-dextran (10 kDa) in darmzakjes ex vivo. Door een fluorescerend lysinefixeerbaar dextran van 10 kDa in het lumen van de darmzakjes te injecteren, hebben we bovendien specifiek de gebieden met een hoge permeabiliteit in het ontstoken slijmvlies geïdentificeerd. Het gebruik van apoptosemarkers en antilichamen tegen AJ-eiwitten stelde ons in staat om aan te tonen dat gebieden met een hoge permeabiliteit in het ontstoken slijmvlies overeenkomen met specifieke regio's waar epitheelcellen apoptose ondergaan en cel-celverbindingen worden verstoord. Deze nieuwe techniek kan worden gebruikt om de integriteit van het epitheel te evalueren in elk model waarbij de darmepitheelbarrière is aangetast.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Alle procedures zijn beoordeeld en goedgekeurd door het CINVESTAV Institutional Committee for Care and Use of Laboratory Animals (CICUAL).

1. Bereiding van materialen en reagentia

  1. Verwarm Hartmann's oplossing (130 mM NaCl, 28 mM lactaat, 4 mM KCl, 1,5 mM CaCl2) voor tot 37 °C terwijl u borrelt met 95% O2/5% CO2. Handhaaf de fysiologische pH (7,4) voor de oplossing.
  2. Voor het analyseren van de passieve paracellulaire permeabiliteit wordt een werkoplossing bereid door 1 mg/ml FITC-Dextran (4 kDa) en 1 mg/ml RITC-Dextran (10 kDa) op te lossen in voorverwarmde Hartmann-oplossing.
  3. Bereid een 4 μg/ml oplossing van Alexa Fluor647 Fixable-Dextran (10 kDa) in de oplossing van Hartmann. Bewaar werkoplossingen in een conische buis van 15 ml en bescherm deze tegen licht tot gebruik.
    OPMERKING: 300 μL werkoplossing per dikke darm is nodig.
  4. Bereid een chirurgische hechting voor door twee secties van 5 cm voor elke dikke darm af te snijden. Lus de hechtingen in een niet-gesloten knoop.

2. Dissectie en bereiding van de gastro-intestinale trac

  1. Houd vast voedsel 6 uur achter voordat u de muizen euthanaseert. Zorg voor ad libitum drinkwater.
    OPMERKING: Plaats de muizen indien mogelijk op voedingsgelsupplementen (gezuiverd water, melasse, pompoen, glucosestroop, zonnebloempitten, tarwe-eiwit, plantaardige olie, voedingszuur, hydrocolloïden, elektrolyten, maïsvezel, NIH-31M mineralenmix, NIH-31M vitaminemix).
  2. Euthanaseer muizen in een CO2 -kamer gevolgd door cervicale dislocatie in overeenstemming met institutionele ethische protocollen.
  3. Steriliseer de buik en thorax met 70% ethanol.
  4. Maak met een schaar een incisie in het midden van de buik en leg de buikholte bloot.
  5. Ter oriëntatie scheidt en ontleedt u de dikke darm door aan het einde van de dunne darm (eindgedeelte van het ileum) vlak voor de blindedarm en vervolgens bij de anale rand af te snijden. Gebruik een chirurgische tang om het mesenterium voorzichtig te verwijderen en plaats de dikke darm in de oplossing van Hartmann.
  6. Belangrijk is dat, om de consistentie tussen dieren te behouden, vergelijkbare secties moeten worden geïdentificeerd en gebruikt om de permeabiliteit te evalueren. Het gebruik van regio's dicht bij de blindedarm is zeer aan te bevelen.
  7. Gebruik een insulinespuit die is uitgerust met een stompe plastic canule om de luminale inhoud in de dikke darm voorzichtig door te spoelen. Als de ontlasting stevig is, duw dan voorzichtig met behulp van een stompe tang. Nadat de ontlasting is verwijderd, 3 keer wassen met 400 μL Hartmann-oplossing.
  8. Bind het proximale gebied vast (het dichtst bij de blindedarm) en plaats een voorgeknoopte hechtlus in het distale gebied van de dikke darm. Met behulp van een spuit die is uitgerust met een stompe plastic canule, vult u de darmzak met de oplossing met de wenssonde. Verwijder voorzichtig de plastic canule en knoop de lus vast in het distale gebied.
  9. Plaats de darmzak in een conische buis van 15 ml met 6 ml Hartmann-oplossing en incubeer gedurende 1 uur om de passieve paracellulaire stroom van FITC/RITC-Dextran te evalueren of 30 minuten om de stroom van de Alexa Fluor Fixable-Dextran te analyseren.
    1. Houd de conische buisjes met de darmzakjes op 37 °C met 5% CO2 en bescherm ze tegen licht.
  10. Om de passieve permeabiliteit te meten met behulp van FITC/RITC-Dextran. Neem op 0 en 60 minuten een monster van 100 μl uit de conische buis en breng het over naar een plaat met 96 putjes. Voeg 100 μL verse media toe om het verloren volume aan te vullen.
  11. Meet monsters en standaarden voor FITC/RITC op een fluorescerende plaatlezer (FITC-excitatie/emissie: 495 nm/519 nm; RITC excitatie/emissie: 570/595 nm).
  12. Om de passieve permeabiliteit te meten met behulp van Alexa Fluor 647 Fixable-Dextran, verwijdert u de darmen, snijdt u dicht bij de chirurgische dasknoop en snijdt u de darm door om het lumen bloot te leggen om de oplossing met de sonde te verwijderen. Was het lumen van de darm 2 keer met koude Hartmann's oplossing.
  13. Plaats het weefsel in een weefselvorm die vooraf is gevuld met Optimal Cutting Temperature-compound (O.C.T.). Oriënteer het weefsel verticaal of horizontaal, afhankelijk van de kant die moet worden doorgesneden. Bewaar de monsters bij -80 °C.

3. Immunofluorescerende kleuring

  1. Fixeer bevroren delen van 20 micrometer met 3,7% paraformaldehyde (PFA) gedurende 20 minuten bij kamertemperatuur en was vervolgens 3 keer met koude fosfaatgebufferde zoutoplossing (PBS; 37 mM NaCl, 2,7 mM KCl, 10 mM Na2HPO4 en 1,8 mM KH2 PO4).
    OPMERKING: Verticale delen van de darmen hebben de neiging los te komen als de wasbeurten erg sterk zijn.
  2. Permeabiliseren met 0,2% TX-100/PBS gedurende 12 minuten op kamertemperatuur en vervolgens 3 keer wassen met koude PBS.
  3. Blokkeer met 0,2% BSA/PBS gedurende 1 uur bij kamertemperatuur.
  4. Verdun het primaire antilichaam in een blokkeeroplossing en incubeer gedurende 1 uur bij kamertemperatuur. Was 3 keer met koude PBS.
  5. Incubeer gedurende 1 uur met secundaire antilichamen in blokkeeroplossing. Was 3 keer met koude PBS.
  6. Breng montagemiddel aan op de sneden en sluit af met een dekglaasje. De objectglaasjes kunnen tot 3 maanden worden bewaard bij -20 °C.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Results

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

In het ontstoken slijmvlies brengen oppervlakkige erosies of micro-erosies de integriteit van de monolaag van de epitheelcel in gevaar en vertegenwoordigen ze plaatsen met een hoge permeabiliteit 7,8. Om dergelijke mogelijkheden te beoordelen, analyseerden we de passieve permeabiliteit in het ontstoken colonslijmvlies in een dextraan natriumsulfaat colitis muizenmodel. Kortom, gedurende 5 dagen kregen C57BL/6J muizen 2,5% DSS (w/...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Discussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Epitheliale homeostase als gevolg van het balanceren van celproliferatie en epitheliale apoptose handhaaft een goede en functionele darmbarrière. Veel klinische aandoeningen, zoals IBD, gaan gepaard met of worden gekenmerkt door veranderingen in de darmpermeabiliteit, ontsteking van het slijmvlies en verstoring van de epitheliale homeostase1. De wisselwerking tussen die processen is nog steeds zeer controversieel. Daarom is de ontwikkeling van nieuwe onderzoeksben...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Disclosures

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

De auteurs hebben niets te onthullen.

Acknowledgements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Het onderzoek werd gedeeltelijk ondersteund door de SEP-Conacyt-subsidie (nr. 179 aan NV/PND) en ondersteund door de sectorale financiering voor onderzoek en onderwijs via de subsidie voor Basiswetenschappen van Conacyt (nr. A1-S-20887 naar PND). We willen onze dank betuigen aan Norma Trejo, M.V.Z. Raúl Castro Luna, M.C. Leonel Martínez, Felipe Cruz Martínez, Victor Manuel García Gómez en M.V.Z. Ricardo Gaxiola Centeno voor hun hulp en technische bijstand.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Materials

```html

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
Active Caspase-3 antibody (1:1000)Celsignalering9664Cleaved caspase-3 (Asp175)(5AE1) Rabbit mAb
Alexa Fluor 488  anti konijn (1:1000)InvitrogenA21206
Alexa Fluor 594 anti rat (1:1000)InvitrogenA21209
Confocal microscoop (Leica TCS SP8x)LeicaHyD-detectoren  en White Light Laser
E-Cadherin antibody (1:750)SigmaMABT26Rat monoclonal Delma-1 antibody
Ethanol 70%Generic
Fixable-DextranInvitrogenD22914Dextran, Alexa Fluor, 10.000 MW, anionisch, fixeerbaar
FITC DextranSigma46944Fluoresceïne isothiocyanaatje–dextran M. Wt. 4 kDa
Hartmann's OplossingPiSAHT PiSA
Incubator (AutoFlow NU-8500)Nuaire
Microplaatlezer (Tecan Infinite 200 PRO)Tecan
Nunc F96 MicroWell Black and White Polystyrene PlateThermoFisher Scientific
ParaformaldehydeSigmaP6148
Phalloidin (1:1000)InvitrogenA12380Alexa Fluor 568 Phalloidin
RITC DextranSigmaR8881-100MGRodamine B Isothiocyanaat-Dextran. M. Wt. 10 kDa
Secundaire antilichamen (1:10000)Jackson ImmunoResearch LaboratoriesHRP-geconjugeerde secundaire antilichamen
HechtdradenGenericGevlochten zijden en gevlochten polyester chirurgische hechtdraden zijn de voorkeur.
ZO-1 (1:1000)Invitrogen40-2200Rb anti-ZO-1
```

References

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. König, J., et al. Human Intestinal Barrier Function in Health and Disease. Clinical and Translational Gastroenterology. 7 (10), 196(2016).
  2. Gassler, N., et al. Inflammatory bowel disease is associated with changes of enterocytic junctions. American Journal of Physiology-Gastrointestinal and Liver Physiology. 281 (1), 216-228 (2001).
  3. Negroni, A., Cucchiara, S., Stronati, L. Apoptosis, Necrosis, and Necroptosis in the Gut and Intestinal Homeostasis. Mediators of Inflammation. 2015, 250762(2015).
  4. Nava, P., et al. Interferon-γ regulates intestinal epithelial homeostasis through converging β-catenin signaling pathways. Immunity. 32 (3), 392-402 (2010).
  5. Choi, C. -H. R., Bakir, I. A., Hart, A. L., Graham, T. A. Clonal evolution of colorectal cancer in IBD. Nature Reviews Gastroenterology & Hepatology. 14 (4), 218-229 (2017).
  6. González-González, M., Díaz-Zepeda, C., Eyzaguirre-Velásquez, J., González-Arancibia, C., Bravo, J. A., Julio-Pieper, M. Investigating Gut Permeability in Animal Models of Disease. Frontiers in Physiology. 9, (2019).
  7. Poulsen, S. S., Pedersen, N. T., Jarnum, S. "Microerosions" in rectal biopsies in Crohn's disease. Scandinavian Journal of Gastroenterology. 19 (5), 607-612 (1984).
  8. Neumann, H., et al. Assessment of Crohn's disease activity by confocal laser endomicroscopy. Inflammatory Bowel Diseases. 18 (12), 2261-2269 (2012).
  9. Laroui, H., et al. Dextran Sodium Sulfate (DSS) Induces Colitis in Mice by Forming Nano-Lipocomplexes with Medium-Chain-Length Fatty Acids in the Colon. PLoS ONE. 7 (3), (2012).
  10. John, L. J., Fromm, M., Schulzke, J. -D. Epithelial barriers in intestinal inflammation. Antioxidants & Redox Signaling. 15 (5), 1255-1270 (2011).
  11. Su, L., et al. TNFR2 activates MLCK-dependent tight junction dysregulation to cause apoptosis-mediated barrier loss and experimental colitis. Gastroenterology. 145 (2), 407-415 (2013).
  12. Mateer, S. W., Cardona, J., Marks, E., Goggin, B. J., Hua, S., Keely, S. Ex Vivo Intestinal Sacs to Assess Mucosal Permeability in Models of Gastrointestinal Disease. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (108), e53250(2016).
  13. Devraj, K., Guérit, S., Macas, J., Reiss, Y. An In Vivo Blood-brain Barrier Permeability Assay in Mice Using Fluorescently Labeled Tracers. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (132), e57038(2018).
  14. Stamatovic, S. M., Johnson, A. M., Sladojevic, N., Keep, R. F., Andjelkovic, A. V. Endocytosis of tight junction proteins and the regulation of degradation and recycling. Annals of the New York Academy of Sciences. 1397 (1), 54-65 (2017).
  15. Srinivasan, B., et al. TEER Measurement Techniques for In Vitro Barrier Model Systems. Journal of Laboratory Automation. 20 (2), 107-126 (2015).
  16. Pearce, S. C., et al. Marked differences in tight junction composition and macromolecular permeability among different intestinal cell types. BMC Biology. 16 (1), 19(2018).
  17. Laukoetter, M. G., et al. JAM-A regulates permeability and inflammation in the intestine in vivo. The Journal of Experimental Medicine. 204 (13), 3067-3076 (2007).

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Tags

Epithelial GapsColonic MucosaImmunofluorescence StainingEpithelial BarrierMicro ErosionsIntestinal PermeabilityCell SheddingApoptotic FociFluorescent DyeBarrier Function
Video Coming Soon

Related Articles