Een abonnement op JoVE is vereist om deze inhoud te bekijken. Log in of start vandaag met uw gratis proefperiode.

Methodenartikel

Generatie en uitbreiding van menselijke cardiomyocyten uit mononucleaire bloedcellen van de patiënt

4K weergaven

⸱

DOI:

10.3791/62206

⸱

12 februari 2021

 ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Center for Cardiovascular Research, The Abigail Wexner Research Institute, Nationwide Children’s Hospital, 2The Heart Center, Nationwide Children’s Hospital, 3Department of Physiology and Cell Biology, The Ohio State University College of Medicine, 4Department of Anatomy, The Ohio State University College of Medicine, 5MCDB Graduate Program, The Ohio State University, 6Department of Pediatrics, The Ohio State University College of Medicine

In dit artikel

Samenvatting

Hier presenteren we een protocol om menselijke cardiomyocyten robuust te genereren en uit te breiden uit perifere mononucleaire bloedcellen van patiënten.

Samenvatting

Het genereren van patiëntspecifieke cardiomyocyten uit een enkele bloedafname heeft enorme belangstelling getrokken voor precisiegeneeskunde bij hart- en vaatziekten. Cardiale differentiatie van door de mens geïnduceerde pluripotente stamcellen (iPSC's) wordt gemoduleerd door gedefinieerde signaalroutes die essentieel zijn voor de embryonale hartontwikkeling. Talrijke cardiale differentiatiemethoden op 2D- en 3D-platforms zijn ontwikkeld met verschillende efficiënties en cardiomyocytenopbrengst. Dit heeft onderzoekers buiten het veld verbaasd, omdat de verscheidenheid van deze methoden moeilijk te volgen kan zijn. Hier presenteren we een uitgebreid protocol dat robuuste generatie en uitbreiding van patiëntspecifieke cardiomyocyten uit perifere mononucleaire bloedcellen (PBMC's) uitwerkt. We beschrijven eerst een zeer efficiënt iPSC-herprogrammeringsprotocol van het bloedmonster van een patiënt met behulp van niet-geïntegreerde Sendai-virusvectoren. Vervolgens beschrijven we een kleine molecuul-gemedieerde monolaagdifferentiatiemethode die robuust kloppende cardiomyocyten kan produceren uit de meeste menselijke iPSC-lijnen. Daarnaast wordt een schaalbaar cardiomyocytenuitbreidingsprotocol geïntroduceerd met behulp van een klein molecuul (CHIR99021) dat patiënt-afgeleide cardiomyocyten snel kan uitbreiden voor industriële en klinische toepassingen. Aan het einde worden gedetailleerde protocollen voor moleculaire identificatie en elektrofysiologische karakterisering van deze iPSC-CM's weergegeven. We verwachten dat dit protocol pragmatisch is voor beginners met beperkte kennis over cardiovasculaire ontwikkeling en stamcelbiologie.

Inleiding

De ontdekking van door de mens geïnduceerde pluripotente stamcellen heeft een revolutie teweeggebracht in de moderne cardiovasculaire geneeskunde1,2. Menselijke iPSC's zijn in staat om zichzelf te vernieuwen en alle celtypen in het hart te genereren, inclusief cardiomyocyten, endotheelcellen, gladde spiercellen en hartfibroblasten. Patiënt iPSC-afgeleide cardiomyocyten (iPSC-CMs) kunnen dienen als onbepaalde bronnen voor het modelleren van genetisch overerfbare hart- en vaatziekten (CVD's) en het testen van de cardiale veiligheid voor nieuwe geneesmiddelen3. In het bijzonder zijn patiënt iPSC-CMs goed voorbereid om genetische en moleculaire etiologieën van CVD's te onderzoeken die zijn afgeleid van defecten in cardiomyocyten, zoals lang QT-syndroom4 en gedilateerde cardiomyopathie (DCM)5. In combinatie met CRISPR/ Cas9-gemedieerde genoombewerking hebben patiënt-iPSC-CM's een ongekende weg geopend om de complexe genetische basis van CVD's te begrijpen, waaronder aangeboren hartafwijkingen (CHD's)6,7,8. Menselijke iPSC-CM's hebben ook mogelijkheden getoond om te dienen als autologe celbronnen voor het aanvullen van het beschadigde myocard tijdens een hartaanval9. In de afgelopen jaren is het van het grootste belang geworden om hoogwaardige menselijke iPSC-CMs te genereren met gedefinieerde subtypen (atriale, ventriculaire en nodale) voor hartregeneratie en geneesmiddelentests10.

Cardiale differentiatie van menselijke iPSC's is het afgelopen decennium sterk verbeterd. Differentiatiemethoden zijn gegaan van op embryoïde lichamen (EB) gebaseerde spontane differentiatie naar chemisch gedefinieerde en gerichte cardiale differentiatie11. Belangrijke signaalmoleculen die essentieel zijn voor de embryonale hartontwikkeling, zoals Wnt, BMP, Nodal en FGF, worden gemanipuleerd om de differentiatie van cardiomyocyten van menselijke iPSC's10,12te verbeteren. Belangrijke vooruitgang omvat sequentiële modulatie van Wnt-signalering (activering gevolgd door remming) voor robuuste generatie van cardiomyocyten uit menselijke iPSC's13,14. Chemisch gedefinieerde hartdifferentiatierecepten zijn onderzocht om grootschalige productie van kloppende cardiomyocyten15,16tevergemakkelijken, die het potentieel hebben om te worden opgewaardeerd tot productie op industrieel en klinisch niveau. Bovendien wordt een robuuste uitbreiding van vroege menselijke iPSC-CM's bereikt door blootstelling aan constitutieve Wnt-activering met behulp van een kleine chemische stof (CHIR99021)17. Meest recent worden subtypespecifieke cardiomyocyten gegenereerd door manipulatie van retinoïnezuur (RA) en Wnt-signaalroutes bij specifieke differentiatievensters tijdens cardiomyocytenlijnverbintenis van menselijke iPSC's18,19,20,21,22.

In dit protocol beschrijven we een werkprocedure voor robuuste generatie en proliferatie van menselijke CM's afkomstig van perifere mononucleaire bloedcellen van patiënten. We presenteren protocollen voor 1) het herprogrammeren van menselijke PBMC's naar iPSC's, 2) robuuste generatie van kloppende cardiomyocyten van menselijke iPSC's, 3) snelle uitbreiding van vroege iPSC-CMs, 4) moleculaire karakterisering van menselijke iPSC-CMs, en 5) elektrofysiologische meting van menselijke iPSC-CMs op het niveau van eencellige door patchklem. Dit protocol omvat de gedetailleerde experimentele procedures voor het omzetten van bloedcellen van patiënten in kloppende cardiomyocyten.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Protocol

De experimentele protocollen en geïnformeerde toestemming voor menselijke proefpersonen werden goedgekeurd door de Institutional Review Board (IRB) in het Nationwide Children's Hospital.

1. Bereiding van celkweekmedia, oplossingen en reagentia

  1. PBMC-media voorbereiden
    1. Meng 20 ml basale PBMC-cultuurmedia (1x) en 0,52 ml supplement. Voeg elk 20 μL SCF en FLT3 toe (voorraadconcentratie: 100 μg/ml), 4 μL IL3, IL6 en EPO elk (voorraadconcentratie: 100 μg/ml) en 200 μL L-glutaminealternatief (100x). Meng ze grondig. Filter in een steriele kap met behulp van een filtereenheid van 0,22 μm. Noem dit Complete Blood Media.
    2. Meng 20 ml basale PBMC-cultuurmedia (1x) en 0,52 ml van het supplement. Voeg 200 μL L-glutamine alternatief (100x) toe. Meng ze grondig. Filter met een filtereenheid van 0,22 μm. Noem dit als Supplement Bloedmedia.
  2. Bereid complete E8-media voor
    1. Meng 500 ml E8 basale media en 10 ml E8-supplement ('s nachts ontdooid bij 4 °C) om complete E8-media te maken. Voor gebruik in evenwicht brengen tot kamertemperatuur (RT).
  3. iPSC passaging media voorbereiden
    1. Voeg 40 μL Y-27632 Rock inhibitor (1:5.000 verdunning, voorraadconcentratie: 10 mM) toe aan 200 ml complete E8 media. Meng het grondig. Voor gebruik in evenwicht brengen met RT.
  4. Bereid cardiomyocytendifferentiatiemedia voor
    1. Media I: Meng 500 ml RPMI1640 met 10 ml B27 minus insulinesupplement (50x).
    2. Media II: Voeg een geschikt volume CHIR99021 (GSK3-remmer) toe aan Media I (CHIR99021 eindconcentratie van 6 μM). Meng.
    3. Media III: Voeg een geschikt volume IWR-1 (Wnt-remmer) toe aan Media I (IWR-1 eindconcentratie van 5 μM). Meng.
    4. Media IV: Meng 500 ml RPMI1640 met 10 ml B27-supplement (50x). Meng.
    5. Media V: Meng 500 ml RPMI1640 (geen glucose) met 10 ml B27-supplement (50x). Meng.
    6. Media VI: Voeg een geschikt volume CHIR99021-voorraad toe aan Media IV (CHIR99021 eindconcentratie van 2 μM). Meng.
  5. Bereid iPSC-CM passaging media voor
    1. Voeg 10 ml knock-out serumvervanging (KSR) toe aan 90 ml Media IV (KSR-eindconcentratie: 10%). Meng goed.
  6. iPSC-CM-vriesmedia voorbereiden
    1. Voeg 1 ml DMSO toe aan 9 ml KSR (eindconcentraties: 10% DMSO/90% KSR) en meng goed.
  7. Bereid keldermembraanmatrix medium-gecoate platen voor
    1. Ontdooi het membraanmatrixmedium van de kelder bij 4 °C 's nachts en aliquot in buizen van 1,5 ml. Voeg 1 ml van dit medium toe aan 250 ml DMEM/F12 media (1:250 verdunning) en meng ze grondig. Breng 2 ml van de verdunde oplossing per put aan in een 6-well plaat en incubeer in 5% CO2 bij 37 °C gedurende 30 minuten voor gebruik.

2. iPSC herprogrammering van PBMC's

  1. Scheid PBMC's van bloedmonsters.
    1. Verzamel bloedmonsters van patiënten (~ 5 ml) en breng over in bloedcelscheidingsbuizen (zie Materiaaltabel). Meng door 10x om te keren.
    2. Centrifugeer bij 1.500 x g gedurende 30 minuten bij kamertemperatuur.
    3. Haal de buisjes er voorzichtig uit en spuit met 70% ethanol. Verwijder onder een bioveiligheidskap de doppen zonder de mononucleaire cellen te verstoren (buffy layer). PBMC's bevinden zich in een witachtige laag net onder de plasmalaag(figuur 1A). Verzamel de hele buffy laag met een pipet van 1000 μL en breng over op een conische buis van 15 ml.
    4. Tel het celnummer met behulp van een geautomatiseerde celteller. Draai de buis op 300 x g gedurende 25 minuten bij RT.
    5. Gooi het supernatant weg. Wassen met 10 ml DPBS (Ca2+/Mg2+ vrij).
    6. Draai de buis op 300 x g gedurende 15 minuten bij RT.
    7. Verwijder het supernatant. Resuspend celkorrels in 1 ml van de vriesmedia (KSR plus 10% DMSO). Pas de celdichtheid aan om 1 x 106 cellen per injectieflacon te maken.
    8. Plaats PBMC cryovialen in een celbevriezingscontainer en houd deze 's nachts op -80 °C. Breng over naar een tank met vloeibare stikstof voor langdurige opslag de volgende dag.
  2. iPSC herprogrammering.
    1. Voeg 3 ml supplementbloedmedia toe in een conische buis van 15 ml. Ontdooi PBMC's in een waterbad van 37 °C en breng ze over in een conische buis. Draai op 300 x g gedurende 7 minuten bij RT.
    2. Gooi het supernatant weg. Resuspend PBMC's met complete bloedmedia. Zaai ze in twee putten van een 24 put weefselkweekplaten (geen keldermembraanmatrix).
    3. Incubeer 's nachts 5% CO2 bij 37 °C. Verwijder de volgende dag voorzichtig de helft van de oude media (0,5 ml) en voeg 0,5 ml verse Complete Blood Media toe.
    4. Verander media om de dag door de helft van de oude media te vernieuwen.
    5. Was na een week de put agressief met 1 ml supplementbloedmedia en breng cellen over in een centrifugebuis van 15 ml.
    6. Tel het celnummer. Neem 2 x 105 cellen en centrifugeer bij 300 x g gedurende 7 minuten.
    7. Gooi het supernatant weg. Resuspend cellen met 300 μL complete bloedmedia. Voer transfectie uit door het juiste volume Sendai-virusherprogrammeringsvectoren toe te voegen volgens de instructies van de fabrikant. Breng ze over in één put van een 24-putplaat (geen keldermembraanmatrix). Incubeer 's nachts 5% CO2 bij 37 °C.
    8. Draai de volgende dag 7 min op 300 x g. Verwijder het supernatant en resuspend in 2 ml complete bloedmedia. Breng over in één put van een 6 putplaat voorgecoat met keldermembraanmatrix. Dit is dag 1 (D1).
    9. Raak het bord de volgende dag niet aan.
    10. Verwijder op D3 1 ml van de oude media. Voeg 1 ml supplement bloedmedia toe.
    11. Herhaal stap 2.2.10 op D5.
    12. Verwijder op D7 1 ml van de oude media. Voeg 1 ml complete E8-media toe.
    13. Herhaal stap 2.2.12 op D8.
    14. Verwijder op D9 de oude media. Voeg 2 ml complete E8-media toe. Volledig geherprogrammeerde cellen zullen zich naar verwachting hechten en kolonies gaan vormen.
    15. Ververs elke dag met 2 ml complete E8-media.
    16. Ongeveer 2 weken na de overdracht van het Sendai-virus verschijnen grote iPSC-kolonies die klaar zijn om te worden geplukt.
    17. Knip iPSC-kolonies onder een stereomicroscoop in de kap en breng individuele kolonies over naar een keldermembraanmatrix-gecoate 24-well plaat vooraf geladen met 0,5 ml iPSC passaging media.
    18. Ververs elke dag met 0,5 ml complete E8-media totdat iPSC-kolonies groot genoeg worden om door te gaan in een nieuwe keldermembraanmatrix-gecoate 6-well plaat.

3. Menselijk iPSC-onderhoud en passaging

  1. Wanneer menselijke iPSC's meer dan 90% samenvloeiing bereiken, verwijder dan oude media. Spoel eenmaal af met 3 ml DPBS.
  2. Voeg 1 ml 0,5 mM EDTA toe in dpbs-oplossing. Incubeer in 5% CO2 bij 37 °C gedurende 5-8 min.
  3. Verwijder EDTA door aspiratie. Voeg 1 ml iPSC passaging media toe. Maak iPSC's handmatig los.
  4. Neem 600-900 μL eencellige suspensie en plaats ze opnieuw op een keldermembraanmatrix-gecoate 6-well plaat (verdunning: 1:6 tot 1:10). Incubeer 's nachts 5% CO2 bij 37 °C.
  5. Ververs elke dag met 2 ml complete E8-media. De iPSC-culturen bereiken meestal confluentie na 3-4 dagen.

4. Chemisch gedefinieerde cardiomyocytendifferentiatie

  1. Kweek menselijke iPSC's in volledige E8-media tot 95% confluent (3-4 dagen).
  2. Verwijder de oude media. Voeg 2 ml CM-differentiatie Media II (6 μM CHIR in RPMI1640 plus B27 minus insulinesupplement) toe aan elke put van een 6-putplaat. Dit is D0. Raak D1 niet aan.
  3. Op D2, vervang door 2 ml CM-differentiatie Media I (RPMI1640 plus B27 minus insulinesupplement).
  4. Op D3, vervang door 2 ml CM-differentiatie Media III (5 μM IWR-1 in RPMI1640 plus B27 minus insulinesupplement). Raak D4 niet aan.
  5. Op D5, vervang door 2 ml CM differentiatie Media I.
  6. Op D7, vervangen door 2 ml CM differentiatie Media IV (RPMI1640 plus B27 supplement). Ververs daarna om de dag de media.
  7. Op D11 wanneer samentrekkende cellen worden waargenomen, vervangt u door 2 ml CM-differentiatie Media V (geen glucose).
  8. Op D13, vervangen door 2 ml CM differentiatie Media V.
  9. Op D15, vervangen door 2 ml CM differentiatie Media IV.
  10. Vervang op D17-D21 om de dag door 2 ml CM-differentiatie Media IV.

5. Passage menselijke iPSC-CM's

  1. Verwijder oude media en spoelcellen eenmaal met 3 ml DPBS.
  2. Breng 1 ml CM-dissociatieoplossing (zie materiaaltabel)aan op elke put van een 6-putplaat. Incubeer in 5% CO2 bij 37 °C gedurende 5-8 min.
  3. Dissociëren iPSC-CM's mechanisch in afzonderlijke cellen door krachtig pipetteren.
  4. Breng cellen over in een conische buis van 15 ml. Voeg 2 ml CM passaging media toe (10% KSR in RMPI1640 plus B27 supplement) om CM dissociatie oplossing te neutraliseren.
  5. Draai 5 min op 300 x g bij RT.
  6. Gooi het supernatant weg. Resuspend cellen met een gewenst volume CM passaging media. Zaai ze in een met keldermembraanmatrix gecoate plaat / schaal. Menselijke iPSC-CM's hervatten het kloppen 1-3 dagen na het passeren.

6. Uitbreiding van menselijke iPSC-CM's

  1. Spoel D10-12 één keer af met iPSC-CMs met 3 ml DPBS voor elke put van een 6-well plaat. Voeg 1 ml CM-dissociatieoplossing toe (stap 5.2). Incubeer in 5% CO2 bij 37 °C gedurende 7-10 min.
  2. Dissociëren iPSC-CM's mechanisch in afzonderlijke cellen door krachtig pipetteren.
  3. Breng cellen over in een conische buis van 15 ml. Voeg 2 ml CM passaging media toe om cm-dissociatieoplossing te neutraliseren.
  4. Draai 5 min op 300 x g bij RT.
  5. Gooi het supernatant weg. Resuspend cellen met een geschikt volume CM passaging media. Pipetteer op en neer om eencellige suspensie te maken. Zaai een miljoen iPSC-CMs in een keldermembraan matrix-gecoate 10 cm schaal.
  6. De volgende dag oude media verwijderen. Voeg 10 ml cardiomyocytenproliferatiemedia toe (Media VI: 2 μM CHIR99021). Verander de media om de dag.
  7. Wanneer iPSC-CMs na 7-9 dagen cultuur confluent worden, herhaal dan de voorbijgaande stap voor verdere uitbreiding van iPSC-CMs.

7. Immunofluorescentie

  1. Vóór immunofluorescentiekleuring, zaai iPSC-CMs op keldermembraanmatrix-gecoate coverslips die in een 24-putplaat worden geplaatst (zaaidichtheid: 0,5-1 x 106 cellen / ml). Houd iPSC-CM's minstens 4 dagen in cultuur.
  2. Was de cellen eenmaal met 1 ml DPBS.
  3. Voeg 0,5 ml 4% paraformaldehyde (PFA) toe en incubeer gedurende 15 minuten bij RT.
  4. Was de cellen met 1 ml DPBS. Herhaal dit één keer.
  5. Voeg 0,5 ml van 0,1% Triton X-100 toe en incubeer gedurende 20 minuten bij RT.
  6. Was tweemaal met 1 ml DPBS.
  7. Voeg 0,5 ml 0,2% BSA toe in DPBS (blokkeringsoplossing). Incubeer bij RT gedurende 1 uur.
  8. Voeg 200 μL primair antilichaam verdund met blokkerende oplossing toe (verdunning: 1:400-1:1000). Incubeer 's nachts bij 4 °C.
  9. Was cellen met behulp van 0,5 ml blokkerende oplossing gedurende 3 minuten met schudden. Herhaal dit twee keer.
  10. Voeg 200 μL secundair antilichaam verdund toe in de blokkerende oplossing. Incubeer bij RT gedurende 1 uur.
  11. Spoel cellen drie keer met 0,5 ml DPBS, elk gedurende 3 minuten met schudden.
  12. Counterstain kernen met DAPI (1:2000 verdunning) en incubeer gedurende 5 min bij RT.
  13. Spoel cellen drie keer met 0,5 ml DPBS.
  14. Monteer cellen op de coverslips op een microscoopglaasje met behulp van 5 μl bevestigingsmedia. Bewaren bij 4 °C en beschermen tegen licht.

8. Voorbereiding van flowcytometriemonsters

  1. Was menselijke iPSC-CM's eenmaal met 3 ml DPBS.
  2. Voeg 1 ml CM-dissociatieoplossing toe en incubeer in 5% CO2 bij 37 °C gedurende 7-10 minuten.
  3. Verwijder cellen met behulp van een pipet van 1.000 μL. Breng de celsuspensie over naar een ronde FACS-buis via een zeefdop. De FACS-buis is voorgevuld met 1 ml iPSC-CM passaging media (10% KSR) om de enzymactiviteit te neutraliseren.
  4. Draai op 300 x g gedurende 5 min.
  5. Verwijder supernatant zonder de celkorrel te storen. Voeg 250 μL fixatie-/permeabilisatieoplossing toe (zie materiaaltabel). Incubeer gedurende 20 min bij 4 °C.
  6. Voeg 1 ml Perm/Wasbuffer toe. Vortex kort en draai op 300 x g gedurende 4 min.
  7. Gooi het supernatant weg. Voeg 100 μL verdunde primaire antilichamen (1:200-1:500) toe in 1x Perm/Wasbuffer. Vortex kort en incubeer een nacht bij 4 °C.
  8. Was de cellen door 1 ml Perm/Wasbuffer toe te voegen. Vortex kort en draai op 300 x g gedurende 4 min.
  9. Gooi het supernatant weg. Voeg 100 μL verdunde secundaire antilichamen toe (1:500-1:1.000). Vortex kort en incubeer bij RT gedurende 1 uur. Bescherm tegen licht als secundaire antilichamen worden geconjugeerd met lichtgevoelige fluorescentie.
  10. Was de cellen door 1 ml Perm/wasbuffer toe te voegen. Vortex kort en draai op 300g gedurende 4 min.
  11. Gooi het supernatant weg. Resuspend cellen met 400 μL FACS-kleuringsbuffer (PBS/4% FBS). Bewaren bij 4 °C totdat het op een FACS-instrument wordt geladen.

9. Real-time qPCR

  1. Verwijder oude media in de menselijke iPSC-CM-cultuur. Voeg 500-700 μL lysisbuffer toe aan lysaatcellen. Incubeer gedurende 3 minuten bij RT. Scape-cellysaat en breng over op een RNase-vrije buis van 1,5 ml. Ga onmiddellijk over tot totale RNA-extractie of bewaar bij -80 °C.
  2. Isoleer totaal RNA met behulp van een RNA-extractiekit volgens de instructies van de fabrikant.
  3. Meet de RNA-concentratie en beoordeel de kwaliteit van het totale RNA met een spectrofotometer.
  4. Voer een omgekeerde transcriptiereactie uit met behulp van een cDNA-synthesekit. Het totale volume rt-reactie is 20 μl inclusief 4 μl reactiemix (5x), 1 μl reverse transcriptase, 1 μg totaal RNA en RNase-vrij water.
  5. Incubeer het volledige RT-reactiemengsel in een thermische cycler met behulp van het volgende protocol: 25 °C gedurende 5 minuten; 46 °C gedurende 20 min; 95 °C gedurende 1 min; houd bij 4 °C.
  6. Verdun cDNA met 1:10 met nucleasevrij water. Stel real-time qPCR-reactie in door 1 μL cDNA-sjabloon, 1 μL primers /probe, 10 μL qPCR-mastermix en 8 μL nucleasevrij water te mengen.
  7. Voer uit in een real-time PCR-systeem. Het fietsprotocol is 50 °C 2 min (vasthouden), 95 °C 10 min (vasthouden), 95 °C 15 sec, 60 °C 1 min, herhaal gedurende 40 cycli.
  8. Verzamel CT-waarden voor elk gen in elk monster. Relatieve mRNA-abundantie wordt berekend door de CT-waarde van het doelgen af te trekken van de CT-waarde van een huishoudgen. Relatieve genexpressie wordt geanalyseerd met behulp van de 2-ΔΔCT-methode.

10. Opname van patchklem voor hele cellen

  1. Dissocieer iPSC-CM's in afzonderlijke cellen met behulp van CM-dissociatieoplossing zoals eerder beschreven.
  2. Zaadcellen met een lage dichtheid op keldermembraanmatrix-gecoate coverslips. Kweek ze gedurende 3-4 dagen in Media IV.
  3. Trek pipetten (weerstand 0,9-1,5 MΩ) uit borosilicaatglascapillairen met behulp van een horizontale micro-elektrodetrekker.
  4. Incubateer cellen in de oplossing van Tyrode (pH=7,35).
  5. Vul pipetten met elektrodeoplossing (pH=7,3) bestaande uit de volgende chemicaliën: 120 mM asparaginezuur, 20 mM KCl, 2 mM MgCl2, 5 mM HEPES, 10 mM NaCl, 5 mM EGTA, 0,3 mM Na-GTP, 14 mM fosfocreatine, 4 mM K-ATP en 2mM creatinefosfokinase.
  6. Plaats cellen in de huidige klemmodus met behulp van een 1,5-2 diastolische drempel van 5 ms stroompuls bij 1 Hz.
  7. Record action potentials (AP's) met behulp van een micro-elektrodeversterker en een softwaregestuurd acquisitiebord.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Resultaten

Menselijke iPSC-herprogrammering van PBMC's
Na prekweek met Complete Blood Media gedurende 7 dagen worden PBMC's groot met zichtbare kernen en cytoplasma(figuur 1B),wat aangeeft dat ze klaar zijn voor virustransfectie. Na transfectie met de sendai virus herprogrammeringsfactoren, zullen PBMC's nog een week een epigenetisch herprogrammeringsproces ondergaan. Meestal krijgen we 30-50 iPSC-kolonies van de transfectie van 1 x 105 PB...

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Discussie

Tijdens iPSC-herprogrammering is het van cruciaal belang om PBMC's gedurende 1 week te kweken totdat ze zijn vergroot met duidelijke kernen en cytoplasma. Omdat PBMC's zich niet vermenigvuldigen, is een geschikt celnummer voor virale transductie belangrijk voor een succesvolle iPSC-herprogrammering. Het celaantal PBMC's, de multipliciteit van infectie (MOI) en de titer van het virus moeten worden overwogen en aangepast om de optimale transductieresultaten te bereiken. Voor cardiale differentiatie is de initiële zaaidicht...

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Openbaarmakingen

De auteurs verklaren geen tegenstrijdige financiële belangen te hebben.

Dankbetuigingen

Deze studie werd ondersteund door de American Heart Association (AHA) Career Development Award 18CDA34110293 (M-T.Z.), Additional Ventures AVIF en SVRF awards (M-T.Z.), National Institutes of Health (NIH / NHLBI) subsidies 1R01HL124245, 1R01HL132520 en R01HL096962 (I.D.). Dr. Ming-Tao Zhao werd ook ondersteund door start-upfondsen van het Abigail Wexner Research Institute in het Nationwide Children's Hospital.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Materialen

```html
Lijst van materialen gebruikt in dit artikel
NaamBedrijfCatalogusnummerOpmerkingen
ABI 7300 Fast Real-Time PCR SystemThermo Fisher Scientific
Axon Axopatch 200B Microelectrode AmplifierMolecular DevicesMicroelektrode Versterker
B27 supplementThermo Fisher Scientific17504044
B27 supplement minus insulinThermo Fisher ScientificA1895601
BD Cytofix/Cytoperm Fixation/Permeabilisatie KitBD Biosciences554714Fixatie/Permeabilisatie oplossing, Perm/Wash buffer
BD Vacutainer CPT buisBD Biosciences362753Bloedcel scheiding buis
CHIR99021Selleck ChemicalsS2924
CytoTune-iPS 2.0 Sendai Reprogramming KitThermo Fisher ScientificA16517Sendai virus reprogrammeringskit
Digidata 1200BAxon InstrumentsAcquisitiebord
Direct-zol RNA Miniprep kitZymo ResearchR2050RNA extractiekit
DMEM/F12Thermo Fisher Scientific11330057
Essential 8 mediumThermo Fisher ScientificA1517001E8 media voor iPSC-kweek
GlutaMAX supplementThermo Fisher Scientific35050061L-glutamine alternatief
Growth factor reduced MatrigelCorning356231Basement membraan matrix
iScript cDNA Snythesis KitBio-Rad1708891cDNA synthese
IWR-1-endoSelleck ChemicalsS7086
KnockOut Serum Replacement (KSR)Thermo Fisher Scientific10828028
pCLAMP 7.0Molecular DevicesElektrofysiologie data acquisitie & analyse software
Recombinant human EPOThermo Fisher ScientificPHC9631
Recombinant human FLT3Thermo Fisher ScientificPHC9414
Recombinant human IL3Peprotech200-03
Recombinant human IL6Thermo Fisher ScientificPHC0065
Recombinant human SCFPeprotech300-07
RPMI 1640 mediumThermo Fisher Scientific11875093
RPMI 1640 medium, geen glucoseThermo Fisher Scientific11879020
SlowFade Gold Antifade MountantThermo Fisher ScientificS36936Montage medium
StemPro-34 SFMThermo Fisher Scientific10639011PBMC kweek medium
TaqMan Fast Advanced Master MixThermo Fisher Scientific4444964qPCR master mix
TrypLE Select Enzyme 10x, geen fenol roodThermo Fisher ScientificA1217703CM dissociatie oplossing
UltraPure 0.5 M EDTAThermo Fisher Scientific15575020iPSC dissociatie oplossing
Y-27632 2HClSelleck ChemicalsS1049
```

Referenties

  1. Takahashi, K., et al. Induction of pluripotent stem cells from adult human fibroblasts by defined factors. Cell. 131 (5), 861-872 (2007).
  2. Yu, J., et al. Induced pluripotent stem cell lines derived from human somatic cells. Science. 318 (5858), 1917-1920 (2007).
  3. Sayed, N., Liu, C., Wu, J. C. Translation of Human-Induced Pluripotent Stem Cells: From Clinical Trial in a Dish to Precision Medicine. Journal of American College of Cardiology. 67 (18), 2161-2176 (2016).
  4. Itzhaki, I., et al. Modelling the long QT syndrome with induced pluripotent stem cells. Nature. 471 (7337), 225-229 (2011).
  5. Hinson, J. T., et al. Titin mutations in iPS cells define sarcomere insufficiency as a cause of dilated cardiomyopathy. Science. 349 (6251), 982-986 (2015).
  6. Deacon, D. C., et al. Combinatorial interactions of genetic variants in human cardiomyopathy. Nature Biomedical Engineering. 3 (2), 147-157 (2019).
  7. Gifford, C. A., et al. Oligogenic inheritance of a human heart disease involving a genetic modifier. Science. 364 (6443), 865-870 (2019).
  8. Lo Sardo, V., et al. Unveiling the role of the most impactful cardiovascular risk locus through haplotype editing. Cell. 175 (7), 1796-1810 (2018).
  9. Liu, Y. W., et al. Human embryonic stem cell-derived cardiomyocytes restore function in infarcted hearts of non-human primates. Nature Biotechnology. 36 (7), 597-605 (2018).
  10. Zhao, M. T., Shao, N. Y., Garg, V. Subtype-specific cardiomyocytes for precision medicine: where are we now. Stem Cells. 38, 822-833 (2020).
  11. Burridge, P. W., Keller, G., Gold, J. D., Wu, J. C. Production of de novo cardiomyocytes: human pluripotent stem cell differentiation and direct reprogramming. Cell Stem Cell. 10 (1), 16-28 (2012).
  12. Protze, S. I., Lee, J. H., Keller, G. M. Human pluripotent stem cell-derived cardiovascular cells: from developmental biology to therapeutic applications. Cell Stem Cell. 25 (3), 311-327 (2019).
  13. Lian, X., et al. Robust cardiomyocyte differentiation from human pluripotent stem cells via temporal modulation of canonical Wnt signaling. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 109 (27), 1848-1857 (2012).
  14. Zhao, M. T., et al. Molecular and functional resemblance of differentiated cells derived from isogenic human iPSCs and SCNT-derived ESCs. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 114 (52), 11111-11120 (2017).
  15. Burridge, P. W., et al. Chemically defined generation of human cardiomyocytes. Nature Methods. 11 (8), 855-860 (2014).
  16. Lian, X., et al. Chemically defined, albumin-free human cardiomyocyte generation. Nature Methods. 12 (7), 595-596 (2015).
  17. Buikema, J. W., et al. Wnt activation and reduced cell-cell contact synergistically induce massive expansion of functional human ipsc-derived cardiomyocytes. Cell Stem Cell. 27 (1), 50-63 (2020).
  18. Lee, J. H., Protze, S. I., Laksman, Z., Backx, P. H., Keller, G. M. Human pluripotent stem cell-derived atrial and ventricular cardiomyocytes develop from distinct mesoderm populations. Cell Stem Cell. 21 (2), 179-194 (2017).
  19. Liang, W., et al. Canonical Wnt signaling promotes pacemaker cell specification of cardiac mesodermal cells derived from mouse and human embryonic stem cells. Stem Cells. 38 (3), 352-368 (2020).
  20. Protze, S. I., et al. Sinoatrial node cardiomyocytes derived from human pluripotent cells function as a biological pacemaker. Nature Biotechnology. 35 (1), 56-68 (2017).
  21. Ren, J., et al. Canonical Wnt5b signaling directs outlying Nkx2.5+ mesoderm into pacemaker cardiomyocytes. Developmental Cell. 50 (6), 729-743 (2019).
  22. Zhang, Q., et al. Direct differentiation of atrial and ventricular myocytes from human embryonic stem cells by alternating retinoid signals. Cell Research. 21 (4), 579-587 (2011).
  23. Fusaki, N., Ban, H., Nishiyama, A., Saeki, K., Hasegawa, M. Efficient induction of transgene-free human pluripotent stem cells using a vector based on Sendai virus, an RNA virus that does not integrate into the host genome. Proceedings of the Japan Academy, Seriers B, Physical and Biological Sciences. 85 (8), 348-362 (2009).
  24. Stacey, G. N., Crook, J. M., Hei, D., Ludwig, T. Banking human induced pluripotent stem cells: lessons learned from embryonic stem cells. Cell Stem Cell. 13 (4), 385-388 (2013).
  25. Karbassi, E., et al. Cardiomyocyte maturation: advances in knowledge and implications for regenerative medicine. Nature Reviews Cardiology. 17 (6), 341-359 (2020).
  26. Zhao, L., Ben-Yair, R., Burns, C. E., Burns, C. G. Endocardial notch signaling promotes cardiomyocyte proliferation in the regenerating zebrafish heart through Wnt pathway antagonism. Cell Reports. 26 (3), 546-554 (2019).
  27. Heallen, T. R., Kadow, Z. A., Wang, J., Martin, J. F. Determinants of cardiac growth and size. Cold Spring Harbor Perspectives in Biology. 12 (3), 037150(2020).
  28. Campa, V. M., et al. Notch activates cell cycle reentry and progression in quiescent cardiomyocytes. Journal of Cell Biology. 183 (1), 129-141 (2008).
  29. Collesi, C., Zentilin, L., Sinagra, G., Giacca, M. Notch1 signaling stimulates proliferation of immature cardiomyocytes. Journal of Cell Biology. 183 (1), 117-128 (2008).
  30. Heallen, T., et al. Hippo pathway inhibits Wnt signaling to restrain cardiomyocyte proliferation and heart size. Science. 332 (6028), 458-461 (2011).

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Herprints en machtigingen

Tags

Generatie van cardiomyocyteniPSC-reprogrammeringSendai-virusreprogrammeringcardiale differentiatiemonolayer-differentiatieexpansie van cardiomyocytenpatchclamptroponine T-expressieWnt-activatie
Generatie en uitbreiding van menselijke cardiomyocyten uit mononucleaire bloedcellen van de patiënt
Neem contact met ons op
Aanbevelen aan de bibliotheek

Privacy

Gebruiksvoorwaarden

Beleidsoverzicht

Copyright © 2026 MyJoVE Corporation. Alle rechten voorbehouden.