Hier presenteren we een protocol om menselijke cardiomyocyten robuust te genereren en uit te breiden uit perifere mononucleaire bloedcellen van patiënten.
Een abonnement op JoVE is vereist om deze inhoud te bekijken. Log in of start vandaag met uw gratis proefperiode.
Methodenartikel
Generatie en uitbreiding van menselijke cardiomyocyten uit mononucleaire bloedcellen van de patiënt
In dit artikel
Samenvatting
Samenvatting
Het genereren van patiëntspecifieke cardiomyocyten uit een enkele bloedafname heeft enorme belangstelling getrokken voor precisiegeneeskunde bij hart- en vaatziekten. Cardiale differentiatie van door de mens geïnduceerde pluripotente stamcellen (iPSC's) wordt gemoduleerd door gedefinieerde signaalroutes die essentieel zijn voor de embryonale hartontwikkeling. Talrijke cardiale differentiatiemethoden op 2D- en 3D-platforms zijn ontwikkeld met verschillende efficiënties en cardiomyocytenopbrengst. Dit heeft onderzoekers buiten het veld verbaasd, omdat de verscheidenheid van deze methoden moeilijk te volgen kan zijn. Hier presenteren we een uitgebreid protocol dat robuuste generatie en uitbreiding van patiëntspecifieke cardiomyocyten uit perifere mononucleaire bloedcellen (PBMC's) uitwerkt. We beschrijven eerst een zeer efficiënt iPSC-herprogrammeringsprotocol van het bloedmonster van een patiënt met behulp van niet-geïntegreerde Sendai-virusvectoren. Vervolgens beschrijven we een kleine molecuul-gemedieerde monolaagdifferentiatiemethode die robuust kloppende cardiomyocyten kan produceren uit de meeste menselijke iPSC-lijnen. Daarnaast wordt een schaalbaar cardiomyocytenuitbreidingsprotocol geïntroduceerd met behulp van een klein molecuul (CHIR99021) dat patiënt-afgeleide cardiomyocyten snel kan uitbreiden voor industriële en klinische toepassingen. Aan het einde worden gedetailleerde protocollen voor moleculaire identificatie en elektrofysiologische karakterisering van deze iPSC-CM's weergegeven. We verwachten dat dit protocol pragmatisch is voor beginners met beperkte kennis over cardiovasculaire ontwikkeling en stamcelbiologie.
Inleiding
De ontdekking van door de mens geïnduceerde pluripotente stamcellen heeft een revolutie teweeggebracht in de moderne cardiovasculaire geneeskunde1,2. Menselijke iPSC's zijn in staat om zichzelf te vernieuwen en alle celtypen in het hart te genereren, inclusief cardiomyocyten, endotheelcellen, gladde spiercellen en hartfibroblasten. Patiënt iPSC-afgeleide cardiomyocyten (iPSC-CMs) kunnen dienen als onbepaalde bronnen voor het modelleren van genetisch overerfbare hart- en vaatziekten (CVD's) en het testen van de cardiale veiligheid voor nieuwe geneesmiddelen3. In het bijzonder zijn patiën....
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Protocol
De experimentele protocollen en geïnformeerde toestemming voor menselijke proefpersonen werden goedgekeurd door de Institutional Review Board (IRB) in het Nationwide Children's Hospital.
1. Bereiding van celkweekmedia, oplossingen en reagentia
- PBMC-media voorbereiden
- Meng 20 ml basale PBMC-cultuurmedia (1x) en 0,52 ml supplement. Voeg elk 20 μL SCF en FLT3 toe (voorraadconcentratie: 100 μg/ml), 4 μL IL3, IL6 en EPO elk (voorraadconcentratie: 100 μg/ml) en 200 μL L-glutaminealternatief (100x). Meng ze grondig. Filter in een steriele kap met behulp van een filtereenheid van 0,22 μm. Noem dit Complete Blood Media.
- ....
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Resultaten
Menselijke iPSC-herprogrammering van PBMC's
Na prekweek met Complete Blood Media gedurende 7 dagen worden PBMC's groot met zichtbare kernen en cytoplasma(figuur 1B),wat aangeeft dat ze klaar zijn voor virustransfectie. Na transfectie met de sendai virus herprogrammeringsfactoren, zullen PBMC's nog een week een epigenetisch herprogrammeringsproces ondergaan. Meestal krijgen we 30-50 iPSC-kolonies van de transfectie van 1 x 105 PB.......
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Discussie
Tijdens iPSC-herprogrammering is het van cruciaal belang om PBMC's gedurende 1 week te kweken totdat ze zijn vergroot met duidelijke kernen en cytoplasma. Omdat PBMC's zich niet vermenigvuldigen, is een geschikt celnummer voor virale transductie belangrijk voor een succesvolle iPSC-herprogrammering. Het celaantal PBMC's, de multipliciteit van infectie (MOI) en de titer van het virus moeten worden overwogen en aangepast om de optimale transductieresultaten te bereiken. Voor cardiale differentiatie is de initiële zaaidicht.......
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Openbaarmakingen
De auteurs verklaren geen tegenstrijdige financiële belangen te hebben.
Dankbetuigingen
Deze studie werd ondersteund door de American Heart Association (AHA) Career Development Award 18CDA34110293 (M-T.Z.), Additional Ventures AVIF en SVRF awards (M-T.Z.), National Institutes of Health (NIH / NHLBI) subsidies 1R01HL124245, 1R01HL132520 en R01HL096962 (I.D.). Dr. Ming-Tao Zhao werd ook ondersteund door start-upfondsen van het Abigail Wexner Research Institute in het Nationwide Children's Hospital.
....Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Materialen
```html
```
| Naam | Bedrijf | Catalogusnummer | Opmerkingen |
|---|---|---|---|
| ABI 7300 Fast Real-Time PCR System | Thermo Fisher Scientific | ||
| Axon Axopatch 200B Microelectrode Amplifier | Molecular Devices | Microelektrode Versterker | |
| B27 supplement | Thermo Fisher Scientific | 17504044 | |
| B27 supplement minus insulin | Thermo Fisher Scientific | A1895601 | |
| BD Cytofix/Cytoperm Fixation/Permeabilisatie Kit | BD Biosciences | 554714 | Fixatie/Permeabilisatie oplossing, Perm/Wash buffer |
| BD Vacutainer CPT buis | BD Biosciences | 362753 | Bloedcel scheiding buis |
| CHIR99021 | Selleck Chemicals | S2924 | |
| CytoTune-iPS 2.0 Sendai Reprogramming Kit | Thermo Fisher Scientific | A16517 | Sendai virus reprogrammeringskit |
| Digidata 1200B | Axon Instruments | Acquisitiebord | |
| Direct-zol RNA Miniprep kit | Zymo Research | R2050 | RNA extractiekit |
| DMEM/F12 | Thermo Fisher Scientific | 11330057 | |
| Essential 8 medium | Thermo Fisher Scientific | A1517001 | E8 media voor iPSC-kweek |
| GlutaMAX supplement | Thermo Fisher Scientific | 35050061 | L-glutamine alternatief |
| Growth factor reduced Matrigel | Corning | 356231 | Basement membraan matrix |
| iScript cDNA Snythesis Kit | Bio-Rad | 1708891 | cDNA synthese |
| IWR-1-endo | Selleck Chemicals | S7086 | |
| KnockOut Serum Replacement (KSR) | Thermo Fisher Scientific | 10828028 | |
| pCLAMP 7.0 | Molecular Devices | Elektrofysiologie data acquisitie & analyse software | |
| Recombinant human EPO | Thermo Fisher Scientific | PHC9631 | |
| Recombinant human FLT3 | Thermo Fisher Scientific | PHC9414 | |
| Recombinant human IL3 | Peprotech | 200-03 | |
| Recombinant human IL6 | Thermo Fisher Scientific | PHC0065 | |
| Recombinant human SCF | Peprotech | 300-07 | |
| RPMI 1640 medium | Thermo Fisher Scientific | 11875093 | |
| RPMI 1640 medium, geen glucose | Thermo Fisher Scientific | 11879020 | |
| SlowFade Gold Antifade Mountant | Thermo Fisher Scientific | S36936 | Montage medium |
| StemPro-34 SFM | Thermo Fisher Scientific | 10639011 | PBMC kweek medium |
| TaqMan Fast Advanced Master Mix | Thermo Fisher Scientific | 4444964 | qPCR master mix |
| TrypLE Select Enzyme 10x, geen fenol rood | Thermo Fisher Scientific | A1217703 | CM dissociatie oplossing |
| UltraPure 0.5 M EDTA | Thermo Fisher Scientific | 15575020 | iPSC dissociatie oplossing |
| Y-27632 2HCl | Selleck Chemicals | S1049 |
Referenties
- Takahashi, K., et al. Induction of pluripotent stem cells from adult human fibroblasts by defined factors. Cell. 131 (5), 861-872 (2007).
- Yu, J., et al. Induced pluripotent stem cell lines derived from human somatic cells. Science. 318
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Herprints en machtigingen
