Workflow en tools voor kristallografische fragmentscreening in het Helmholtz-Zentrum Berlin

Samenvatting

Kristallografische fragmentscreening in het Helmholtz-Zentrum Berlin wordt uitgevoerd met behulp van een workflow met speciale samengestelde bibliotheken, tools voor kristalverwerking, snelle faciliteiten voor het verzamelen van gegevens en grotendeels geautomatiseerde gegevensanalyse. Het gepresenteerde protocol is bedoeld om de output van dergelijke experimenten te maximaliseren om veelbelovende uitgangspunten te bieden voor downstream structuurgebaseerd ligandontwerp.

Samenvatting

Fragmentscreening is een techniek die helpt bij het identificeren van veelbelovende uitgangspunten voor ligandontwerp. Aangezien kristallen van het doeleiwit beschikbaar zijn en reproduceerbaar hoge resolutie röntgendiffractie-eigenschappen vertonen, is kristallografie vanwege de gevoeligheid een van de meest geprefereerde methoden voor fragmentscreening. Bovendien is het de enige methode die gedetailleerde 3D-informatie biedt over de bindingsmodus van het fragment, wat essentieel is voor de daaropvolgende rationele samengestelde evolutie. Het routinematige gebruik van de methode hangt af van de beschikbaarheid van geschikte fragmentbibliotheken, speciale middelen om grote aantallen monsters te verwerken, state-of-the-art synchrotron-bundellijnen voor snelle diffractiemetingen en grotendeels geautomatiseerde oplossingen voor de analyse van de resultaten.

Hier worden de volledige praktische workflow en de meegeleverde tools gepresenteerd over het uitvoeren van kristallografische fragmentscreening (CVS) in het Helmholtz-Zentrum Berlin (HZB). Voorafgaand aan deze workflow zijn kristalweekomstandigheden en strategieën voor gegevensverzameling geoptimaliseerd voor reproduceerbare kristallografische experimenten. Vervolgens wordt, meestal in een procedure van één tot twee dagen, een 96-lids CFS-gerichte bibliotheek die wordt geleverd als gedroogde kant-en-klare platen gebruikt om 192 kristallen te weken, die vervolgens afzonderlijk worden geflitst. De laatste diffractie-experimenten kunnen binnen één dag worden uitgevoerd op de robotmontage ondersteunde straallijnen BL14.1 en BL14.2 op de BESSY II elektronenopslagring van de HZB in Berlijn-Adlershof (Duitsland). De verwerking van de kristallografische gegevens, verfijning van de eiwitstructuren en hitidentificatie is snel en grotendeels geautomatiseerd met behulp van gespecialiseerde softwarepijplijnen op dedicated servers, waarvoor weinig gebruikersinvoer nodig is.

Het gebruik van de CFS-workflow bij de HZB maakt routinematige screeningsexperimenten mogelijk. Het vergroot de kans op succesvolle identificatie van fragmenttreffers als uitgangspunten voor de ontwikkeling van krachtigere bindmiddelen, nuttig voor farmacologische of biochemische toepassingen.

Inleiding

De eerste stap in de ontwikkeling van geneesmiddelen is het screenen van verbindingen tegen een doel van belang. Traditioneel worden grote samengestelde bibliotheken in de orde van grootte van 100.000-1.000.000 ingangen gebruikt in biochemische assays met hoge doorvoer in de farmaceutische industrie. Deze strategie werd aangevuld met fragment-based drug design (FBDD), een nieuwere methode die de afgelopen 20 jaar sterk is gestegen en een mainstream strategie werd om hoogwaardige leadkandidaten te genereren vanwege verschillende inherente voordelen van de methode¹. De term "fragment" verwijst naar een klein organisch molecuul dat doorgaans minder dan 20 niet-waterstof of zware atomen (HAs) bevat. Een fragment is dus aanzienlijk kleiner dan de drug- of loodachtige moleculen (meestal minder dan 30 HAs) die worden onderzocht in conventionele screening met hoge doorvoer. Fragmenten zijn bindmiddelen met een zwakke affiniteit. In vergelijking met grotere moleculen zijn fragmenten echter veelzijdiger, omdat zelfs een kleine verzameling ervan de respectieve chemische ruimte van moleculen van dezelfde grootte beter kan vertegenwoordigen². Ook is het ontwikkelen van fragmentscreening hits in loodmoleculen aanzienlijk effectiever dan het optimaliseren van reeds grotere moleculen^2,3,4,5. Dat betekent dat, in afwachting van voldoende gevoeligheid van de detectie, screening van fragmenten efficiënt kan worden gebruikt en hoogwaardige uitgangspunten oplevert voor verdere samengestelde evolutie. Verschillende biofysische methoden kunnen worden toegepast voor fragmentscreening, de meest populaire zijn nucleaire magnetische resonantie, röntgenkristallografie, oppervlakteplasmonresonantie en thermische verschuivingstesten. Deze methoden worden parallel of op een sequentiële manier gebruikt, met als doel het vertrouwen in de hits te vergroten en het aantal valse positieven of valse negatieven te verminderen. Een recent uitgevoerde vergelijkende studie⁶ suggereerde echter dat sequentiële screeningcascades moeten worden vermeden vanwege de lage overlapping tussen de verschillende methoden.

Röntgenkristallografie is een gevestigde methode voor structuurbepaling bij atomaire details , maar is onlangs ook ontwikkeld als instrument voor screeningdoeleinden^7,8. Aangezien eiwitkristallen hoge fragmentconcentraties verdragen (bv. 100 mM), kan kristallografische fragmentscreening (CVS) concurreren met andere biofysische methoden voor het screenen van fragmenten of zelfs beter presteren dan een eerstestaps screeningsmethode^6,9. Een essentiële voorwaarde voor CVS is echter een gevalideerd kristallisatiesysteem van het doeleiwit dat reproduceerbaar kristallen levert met diffractie-eigenschappen tot een aanzienlijk hoge resolutie, meestal beter dan 2 Å.

Een exclusief voordeel van CVS in vergelijking met alle andere methoden voor fragmentscreening is het verstrekken van gedetailleerde 3D-informatie over de bindingsmodus van de geïdentificeerde fragmenten. Deze structurele informatie is absoluut cruciaal voor de rationele optimalisatie van de fragmenthits naar bindmiddelen met een hogere affiniteit. Gevestigde uitwerkingsstrategieën groeien, fuseren en koppelen fragment hits⁵. Daardoor wordt vanaf het begin een relatief hoge ligandefficiëntie geboden en kan de introductie van onnodige of ruimtelijk niet geschikte groepen worden vermeden, waardoor de kosten voor chemische synthese worden verlaagd. Al met al heeft CVS ongeëvenaarde voordelen als startstrategie voor medicijnontwerp.

Gezien het feit dat een bepaald biologisch doel voldoet aan de hoge eisen van CVS met betrekking tot kristalkwaliteit, zijn er enkele belangrijke factoren die de kansen op een succesvol resultaat van dergelijke screeningcampagnes maximaliseren. Het hangt af van de kwaliteit van de gebruikte fragmentbibliotheek, van een efficiënte workflow om de experimenten vóór het diffractie-experiment uit te voeren, van synchrotronstraallijnen met voldoende automatisering en gegevensverzamelingssnelheid, evenals van manieren en middelen voor grotendeels geautomatiseerde gegevensverwerking en -analyse. Hier wordt de volledige workflow van de kristalweekexperimenten tot de hitidentificatie gepresenteerd, op de manier waarop deze met succes is vastgesteld op de macromoleculaire kristallografiestraallijnen bij BESSY II (figuur 1). De faciliteit staat open voor academische en industriële gebruikers voor samenwerking. Daarnaast kunnen academische gebruikers van EU-landen buiten Duitsland eenvoudig financiering aanvragen via het iNEXT Discovery-project.

Er zijn onmisbare voorwaarden om een CVS-campagne te kunnen starten en het in dit werk beschreven protocol uit te voeren: er zijn goed verspreidende kristallen van het doeleiwit beschikbaar die reproduceerbaar in grote aantallen kunnen worden gekweekt, die stabiel zijn bij omgevingstemperatuur en die zijn gekweekt met behulp van een kristallisatiecocktail zonder zeer vluchtige ingrediënten. Een andere voorwaarde is de geschiktheid van het kristalrooster voor het experiment. In een geschikt rooster moeten de interessante plaatsen van het doeleiwit worden blootgesteld aan de oplosmiddelkanalen en dus toegankelijk zijn. Een andere voorgaande stap die optioneel is, maar toch sterk wordt aanbevolen om succes in de workflow van de CFS-campagne te garanderen, is de optimalisatie van de soaking-voorwaarde voor het experiment. Essentiële benchmarkstatistieken hier zijn de diffractiekracht van het kristal en de relevante gegevenskwaliteitsindicatoren, die worden bepaald tijdens de gegevensschaalprocedure. Typische factoren om te optimaliseren zijn DMSO-tolerantie, bufferconcentratie en cryo-protectant. Hoewel het geen strikte voorwaarde is zoals hieronder verder wordt beschreven, kan DMSO als co-oplosmiddel helpen om de fragmentoplosbaarheid te verhogen. Typische tests moeten het weken van 0, 3, 6 of 10% (v/v) DMSO 's nachts omvatten. Een verhoging van de bufferconcentratie tot 200 of 300 mM helpt verlies in diffractiekwaliteit te voorkomen als gevolg van incidentele pH-verschuivende effecten als gevolg van de hoge fragmentconcentraties die moeten worden gebruikt. Tot slot is het beslissend om uit te zoeken of en welke extra cryoprotectant nodig is en of deze al in de weekconditie kan worden opgenomen. In veel gevallen is echter geen extra cryo-protectant nodig, omdat DMSO zelf als cryo-protectant kan fungeren. Als dat het zo is, bespaart dit één verwerkingsstap in het uiteindelijke experiment. De meeste kristallen hebben minder cryo-protectant nodig als ze op de juiste grootte worden gekoeld, waardoor de omringende moederlikeur zoveel mogelijk wordt geminimaliseerd of vermeden. In zeldzame gevallen is echter een laag moederlikeur inderdaad nodig om schade aan het kristal bij flitskoeling te voorkomen.

Het aantal hits verkregen in een CVS-campagne is niet alleen afhankelijk van de druggability van het doeleiwit en de geschiktheid van het kristalrooster (zie hierboven), maar het is ook afhankelijk van de kwaliteit van de bibliotheek. De kwaliteit van de bibliotheek omvat twee aspecten: de selectie van de verbindingen voor de bibliotheek en het confectiewerk van de verbindingen (d.w.z. in welke fysieke vorm ze voor het experiment worden gepresenteerd). Voor samengestelde selectie kunnen verschillende strategieën worden gebruikt. De meeste bibliotheekontwerpen omvatten de maximalisatie van de chemische diversiteit van de fragmenten. Een strategische focus zou kunnen zijn om de chemische tractabiliteit van de fragmenten voor vervolgontwerp op te nemen, die bijvoorbeeld is toegepast in de Diamond-SGC-iNEXT-bibliotheek¹⁰. Nog een andere strategische focus voor bibliotheekontwerp zou kunnen zijn om de vertegenwoordiging van commercieel beschikbare chemische ruimte van fragmenten te maximaliseren door middel van op vorm en farmacofoor gebaseerde clustering, zoals is geïllustreerd door de F2X-bibliotheken die zijn ontwikkeld op HZB¹¹. Meer specifiek zijn de 1103-lid F2X-Universal Library en representatieve 96-compound subset voor initiële CFS-campagnes, die F2X-Entry Screen wordt genoemd, ontwikkeld en is het F2X-Entry Screen met succes gevalideerd¹¹. Het F2X-Entry Screen is de primaire keuze voor CFS campagnes bij HZB. Vervolgens kunnen grotere campagnes worden uitgevoerd met behulp van de F2X-Universal Library of de 1056-lid EU-OPENSCREEN-fragmentbibliotheek¹² die ook bij HZB wordt aangeboden. Momenteel zijn deze bibliotheken gratis beschikbaar voor gebruikers van de macromoleculaire kristallografiestraallijnen van het BESSY II synchrotron in Berlijn op basis van een samenwerkingscontract. Dat geldt ook voor gebruikers via iNEXT Discovery-voorstellen. Bovendien is het F2X-Entry Screen beschikbaar voor alle geïnteresseerde wetenschappers op basis van een overeenkomst voor materiaaloverdracht.

Met betrekking tot de fysieke presentatie van een bibliotheek worden twee benaderingen vaak toegepast: de fragmenten worden gebruikt als DMSO-voorraadoplossingen of de fragmenten worden gedroogd en geïmmobiliseerd op kant-en-klare platen. Bij HZB worden zowel het F2X-Entry Screen als de niet-vluchtige verbindingen van de F2X-Universal Library gepresenteerd als gedroogde verbindingen in een 3-lens 96-well MRC low profile kristallisatieplaat. De presentatie van de fragmenten geïmmobiliseerd in kristallisatieplaten heeft twee essentiële voordelen: ten eerste maakt het transport van de zeefplaten naar het thuislab van de gebruiker mogelijk. Daarom kunnen de wekende en kristalbehandelingsstappen van de hier gepresenteerde workflow (stap 1-3) overal worden uitgevoerd. Ten tweede kan dmso-vrije oplossing worden gebruikt. DMSO-gevoelige doelen kunnen dus gemakkelijk worden gescreend, grotendeels met behoud van verwachte hitpercentages¹¹. DMSO verhoogt echter de oplosbaarheid van fragmenten, daarom is het de moeite waard om de DMSO-tolerantie van een kristalsysteem naar keuze vooraf te controleren, zoals hierboven beschreven.

Het onderstaande protocol beschrijft een typisch experiment met een scherm met 96 verbindingen, zoals het F2X-invoerscherm. Daarvoor moeten ongeveer 250 kristallen op tijd worden bereid om vers te worden gebruikt. Het is zeer raadzaam om de weken voor alle 96 verbindingen in tweevoud voor te bereiden. Het wordt aanbevolen, maar optioneel, om extra mock-soaks voor te bereiden die later zullen helpen bij gegevensanalyse met behulp van de Pan-Data Density Analysis (PanDDA) -benadering voor hitidentificatie¹³. Mock-soaks worden gedefinieerd als soaking experimenten op eiwitkristallen met dezelfde weekoplossing als het fragment weken voor dezelfde incubatietijd, maar er zijn geen fragmenten aanwezig. Als de weekoplossing gelijk is aan de kristallisatieconditie, kunnen de kristallen rechtstreeks uit de kristallisatieplaat worden geoogst.

Afhankelijk van de mogelijkheden van de robotmonsterwisselaar moeten mogelijk verschillende puckformaten worden gebruikt. Op dit moment moeten monsters voor de DOOR HZB bediende beamline BL14.1 in Unipuck-formaat worden bereid, monsters voor de HZB-gestuurde beamline BL14.2 moeten worden bereid in SPINE puck-formaat. In dit protocol wordt de voorbereiding in Unipuck-indeling verondersteld.

Protocol

1.Soaking kristallen

1. Neem de zeefplaat (hier een F2X-Entry Screen plate, figuur 2)uit de vriezer van -20 °C en plaats deze ongeveer 30 minuten op de bank/tafel om deze voor te verwarmen tot kamertemperatuur, waardoor condensatievocht wordt vermeden.
2. Rangschik de werkplek met twee nauwkeurig gerangschikte microscopen en alle benodigde gereedschappen (figuur 3A). De materialen worden vermeld in de tabel met materialen.
3. Kies 3-4 lussen van de juiste grootte voor overdracht van de te weken kristallen en plaats ze dicht bij de microscopen.
4. Vul de glasvlekplaatholtes met gedeïoniseerd of gedestilleerd water.
5. Bereid 5 ml weekoplossing voor.
6. Snijd de zak van de voorverwarmde zeefplaat open tot kamertemperatuur.
7. Verwijder het deksel en de folie van de zeefplaat, terwijl u de plaat op de bank/tafel houdt.
8. Decanteer de 5 ml weekoplossing in het reagensreservoir.
9. Vul elk van de 96 reservoirs met 40 μL weekoplossing met behulp van de 12-kanaals pipet.
10. Plaats het EasyAccess Frame op de zeefplaat en zet het vast met de meegeleverde klemmen door ze op de linker- en rechterkant van het apparaat te schuiven.
    OPMERKING: Het EasyAccess Frame is een speciaal apparaat voor het hanteren van meerdere kristallen, dat is ontwikkeld op de HZB¹⁴. Het biedt gemakkelijke toegang tot elke put door de beweegbare tegels te verschuiven en tegelijkertijd de andere putten te beschermen tegen verdamping.
11. Plaats de zeefplaat (incl. het EasyAccess Frame) onder de eerste microscoop en de kristallisatieplaat inclusief de kristallen die onder de tweede microscoop moeten worden gedrenkt.
12. Schuif de waterplaat goed open A1 door de betreffende acrylglastegel van het EasyAccess Frame met een vinger of het meegeleverde pengereedschap te verplaatsen.
13. Voeg 0,4 μL weekoplossing uit het reservoir toe aan het fragment dat goed bevat (lens linksboven) met behulp van een verse pipetpunt. Controleer door de microscoop of de druppel het opgedroogde fragment bedekt, zodat het kan oplossen.
    OPMERKING: Als alternatief kan deze stap worden uitgevoerd met behulp van een pipetteerrobot vóór de montage van het EasyAccess Frame. Op deze manier kunnen de inweekdruppels van alle putten in één automatische procedure worden geplaatst. De auteurs raden echter aan om de weekoplossing direct voor de weekstap toe te voegen, zoals beschreven om ervoor te zorgen dat het fragment langzaam en in aanwezigheid van het kristal oplosbaar wordt. Dit voorkomt dat het kristal een plotselinge schok ervaart bij overdracht naar een druppel met een hoge fragmentconcentratie.
14. Snijd onder de tweede microscoop de afdichtingsfolie van de kristallisatieplaat open bij een van de putten die de doelkristallen bevat.
15. Breng twee kristallen met behulp van een lus van de juiste grootte die op de kristallen toverstaf is gemonteerd, over naar de put A1 van de zeefplaat onder de eerste microscoop.
16. Was de lus in de voorbereide glazen spotplaat en droog deze door het weefsel voorzichtig aan te raken. Doe dit na elke overdracht om kruisbesmetting te voorkomen met fragmenten die weekoplossingen bevatten.
17. Gebruik de microscoop om te controleren of de kristallen goed geplaatst zijn.
18. Ga verder naar de volgende put (bijv. B1).
19. Herhaal stap 1.13-1.18 met alle 96 putten van de zeefplaat totdat elke weekdruppel twee kristallen bevat.
20. Verwijder de zeefplaat (incl. het EasyAccess Frame) onder de microscoop en plaats deze op de bank/tafel.
21. Verwijder het EasyAccess Frame van de zeefplaat.
22. Verzegel de zeefplaat met afdichtingsfolie en plaats deze in respectievelijk de kristallisatie-incubator of kast waar de kristallen zijn gekweekt.
23. Incubeer voor de optimale weektijd. Overnachten is meestal handig.
24. (optioneel) Bereiding van ongeveer 40 apokristallen (d.w.z. mock soaking)
    1. Neem een MRC 3-lens 96-well low-profile kristallisatieplaat en vul twee kolommen met 40 μL weekoplossing per put met behulp van de 12-kanaals pipet.
    2. Plaats het EasyAccess Frame bovenop de kristallisatieplaat en zet het vast met de meegeleverde klemmen door ze op de linker- en rechterkant van het apparaat te schuiven.
    3. Schuif de acrylglastegel van put A1 open.
    4. Plaats 0,4 μL weekoplossing in elk van de twee linkerlenzen van de put.
    5. Breng 2-3 kristallen over op elke druppel. Was na elke overdracht de lus in de voorbereide glazen spotplaat en droog door het weefsel voorzichtig aan te raken.
    6. Ga naar de volgende put (bijv. B1).
    7. Herhaal stap 1.24.4-1.24.6 totdat ongeveer 40 kristallen klaar zijn voor incubatie.
    8. Verwijder de kristallisatieplaat (incl. EasyAccess Frame) onder de microscoop op de bank/tafel en verwijder het EasyAccess Frame.
    9. Verzegel de kristallisatieplaat met afdichtingsfolie en plaats deze in de eerder genoemde kristallisatie incubator of kast.
    10. Incubeer voor dezelfde tijd als de zeefplaat.

2.Harvesting kristallen

1. Haal de incubatieplaat(en) respectievelijk uit de incubator of kast.
2. Plaats de werkplek met één microscoop en alle benodigde gereedschappen (figuur 3B). De materialen staan vermeld in de Tabel met materialen.
3. Bereid een Unipuck schuimdewar voor met 3 Unipuck deksels (d.w.z. monsterbehuizingen) en vul deze met vloeibare stikstof (LN₂).
   OPMERKING: Neem de juiste veiligheidsmaatregelen in acht voor het werken met LN₂ (d.w.z. draag een veiligheidsbril en gebruik geschikte beschermingsmiddelen). Het is het beste om tijdens de sessie meerdere keren verse LN₂ te krijgen om watercondensatie in de LN_2-opslagblik te voorkomen. Zorg er tijdens de hele volgende procedure voor dat het LN_2-niveau in de schuimdewar altijd de bovenrand van de dewar bereikt. Zorg er ook voor dat de LN₂ ijsvrij is; vervang de LN₂ regelmatig (bijv. eens in de 45 minuten), of uiterlijk als er ijs begint op te hopen. Vul vervolgens de tweede schuimdewar en breng Unipucks eroverheen. Leeg het ijzige schuim dewar en verwijder restijs en vocht met de föhn.
4. Verwijder de folie van de zeefplaat en plaats het EasyAccess Frame erop.
5. Schuif goed open A1.
6. Oogst twee kristallen uit de druppel en flash-cool ze in LN₂ (één voor één) door met een snelle verticale beweging in de LN₂ te duiken en vervolgens het monster in de juiste puckpositie te plaatsen. Maak relevante notities op het voorbeeldvolgblad.
7. Cryoprotectiestap (indien nodig voor de doelkristallen). Voer in dat geval deze stap uit in plaats van 2.6.
   1. Plaats 0,4 μL weekoplossing inclusief cryo-protectant op de linkerbenedenglas van de put.
   2. Trek de lus met een kristal gemonteerd van de druppel in de linkerbovenlens langzaam door de oplossing in de linkerbenedenhoek terwijl u het kristal in de lus houdt en flitskoel in LN₂. Oogst op deze manier twee kristallen.
      OPMERKING: Zorg er in stap 2.6 en 2.7 voor dat de tijd dat het kristal in de lus zit en aan lucht wordt blootgesteld, zeer kort wordt gehouden. Het storten (d.w.z. de verticale druppel van het monster in de LN_2-gevuldedewar) moet zo snel mogelijk worden uitgevoerd. Dit zorgt voor een hoge monsterkwaliteit en preventie van ijsringen in de gegevens. Volg de monsters (d.w.z. let op of kristallen schade hebben, enz.) om een van beide duplicaten te prioriteren voor de volgende röntgenmetingen, gebruik daarvoor de sjabloon. Zelfs als kristallen scheuren, "haren" of andere defecten hebben als gevolg van het weken, kunnen ze nog steeds worden gebruikt en moeten ze altijd worden geoogst. In het geval dat kristallen in verschillende stukken breken, moeten twee van de grootste / best uitziende stukken worden geoogst. Figuur 5 toont enkele voorbeelden van hoe dergelijke kristallen eruit kunnen zien. Alle getoonde kristallen gaven nog steeds nuttige datasets in de respectieve campagne¹¹, wat onderstreept dat het de moeite waard is om kristallen te oogsten na het weken van de behandeling, zelfs als er aanzienlijke morfologische veranderingen plaatsvonden.
8. Ga naar de volgende put en herhaal stap 2.5 - 2.6./2.7 totdat alle drie de pucks gevuld zijn.
9. Voeg de Unipuck-basissen toe aan de deksels na voorkoeling in LN₂.
10. Bewaar de Unipucks in opslagrekken in een transportdewar of storage dewar.
11. Herhaal de voorgaande stappen totdat alle putten van de zeefplaat zijn verwerkt.
12. (optioneel) Als met nep doordrenkte kristallen worden bereid, oogst ze dan op een vergelijkbare manier als van tevoren is beschreven.
    OPMERKING: Als twee kristallen voor elk van de 96 omstandigheden van de zeefplaat kunnen worden geflitst, is er ruimte voor 32 mock-soaked apo-kristallen, om de 14 Unipucks te vullen.
13. Bewaar de Unipucks in LN₂ tot de meting.

3.Gegevensverzameling

1. Breng de Unipucks over naar beamline BL14.1. Als SPINE pucks zijn gebruikt in stap 2, breng ze dan over naar beamline BL14.2.
2. Voer standaardmetingen uit op de straallijn met behulp van de onderstaande specifieke aanbevelingen. Details over de faciliteit en het experimenteerprogramma MXCuBE2 zijn eerder gepresenteerd^15,16. Figuur 4 toont het interieur van de experimentele hutten van beamlines BL14.1 en BL14.2, evenals een voorbeeld screenshot van de MXCuBE2 besturingssoftware bij beamline BL14.1.
   1. Sla de verzameling testafbeeldingen over om de tijdsefficiëntie en doorvoer te maximaliseren. De sample-to-detector afstand wordt vastgesteld op een waarde die geschikt is voor de bovenresolutiegrens van het kristalsysteem die in eerdere experimenten is bepaald. Als de strategie voor het verzamelen van gegevens vooraf niet is geoptimaliseerd, verzamelt u 1800 afbeeldingen van elk 0,2 graden met een belichtingstijd van 0,1 s per afbeelding.
   2. Test idealiter de strategie voor het verzamelen van gegevens in eerdere experimenten met mock-soaked apo-kristallen. Voor ruimtegroepen met een hogere symmetrie geven 1200 afbeeldingen of zelfs 900 afbeeldingen (respectievelijk 240° of 180°) al volledige datasets met goede statistieken, onafhankelijk van de beginhoek van gegevensverzameling.
      OPMERKING: Hogere redundantie en fijner snijden kunnen superieure gegevenskwaliteit opleveren¹⁷. Het gebruik van deze hier voorgestelde "genoeg maar niet meer" strategie is echter een uitstekende afweging tussen kwaliteit, tijd voor het verzamelen van gegevens en rekenvereisten voor analyse later. Op de beschreven manier zijn 200 gegevensverzamelingen in 24 uur goed mogelijk op de lijnen BL14.1 en BL14.2. Niettemin moeten monsters prioriteit krijgen.
   3. Verzamel eerst diffractiegegevenssets voor één monster per fragmentvoorwaarde, op basis van de prioritering in stap 2.6./2.7 (d.w.z. verzamel de gegevens voor het dubbele met hogere prioriteit).
   4. Voor de experimenten in 3.2.3 waarbij het verzamelen van gegevens is mislukt, diffractie verloren is gegaan of ernstige ijsringen hebben plaatsgevonden, gegevens verzamelen voor het tweede duplicaatmonster van de respectieve fragmentconditie.
   5. Verzamel diffractiegegevenssets van apokristallen (indien voorbereid volgens stap 1.24 en 2.12).
   6. Verzamel diffractiegegevenssets van de resterende duplicaten van elke fragmentvoorwaarde.
   7. Stem in het MXCuBE2-programma de dataset-id's van een CVS-campagne af op het volgende patroon: --[ABCDEFGH][01][0123456789][ab] (bijv. MyProtein-F2XEntry-B05a, waarbij "B05" staat voor de put (d.w.z. de fragmentvoorwaarde in het scherm) en de volgende "a"

4.Data behandeling

1. Gebruik fragMAXapp, een webgebaseerde oplossing voor het beheren van een multiplexanalyse voor het verwerken van automatische verfijning en PanDDA-hitevaluatie van CFS-gegevens¹⁸ (Lima et al. FragMAXapp, niet-gepubliceerde gegevens) voor gegevensanalyse voor gegevensanalyse van CVS. In de FragMAXapp-versie die bij HZB wordt geïmplementeerd, zijn de volgende programma's/pijpleidingen beschikbaar: XDSAPP¹⁹, Xia2-DIALS en Xia2-XDS²⁰, fspipeline⁷, DIMPLE²¹, Phenix LigFit²², PanDDA^13,23. Gebruik een goed verfijnd invoermodel van het doeleiwit als input voor automatische verfijning; voer anders nauwgezette verfijning uit van een met hoge resolutie geseweekt kristal dat tijdens de campagne werd verzameld.
   OPMERKING: Een belangrijk element voor hitidentificatie is PanDDA. Nadere bijzonderheden worden toegelicht in de respectieve publicaties^13,23. Kortom, PanDDA berekent automatisch elektronendichtheidskaarten van een set datasets in een CFS-campagne. Deze worden vervolgens verondersteld als niet-bindende fragmentvoorwaarden en gemiddeld om het zogenaamde grondtoestandsmodel te genereren. Het grondtoestandsmodel wordt vervolgens gebruikt om lokale verschillen af te leiden tussen elke elektronendichtheidskaart en de grondtoestandskaart, met behulp van voxel-geassocieerde Z-scores. Vervolgens wordt voor gebieden met hoge Z-scores een zogenaamde PanDDA-kaart gemaakt door de grondtoestandsdichtheid van de betreffende kaart nauwkeurig af te trekken. Dit verbetert grotendeels de zichtbaarheid van fragmentbindende gebeurtenissen.
2. Gebruik een aanpak in twee stappen om het resultaat van PanDDA te maximaliseren. Ten eerste, het uitvoeren van een PanDDA-uitvoering (pandda.analyse) met standaardinstellingen. Zelfs als door mock-soaked kristallen zijn verzameld, zal hun identiteit niet worden opgenomen als een parameter (wat toch mogelijk is) om een onbevooroordeelde generatie van het grondtoestandsmodel door PanDDA mogelijk te maken op basis van alle beschikbare gegevens. Daarna worden de outputgegevens door de gebruiker geëvalueerd via een zogenaamde PanDDA-inspectie in Coot²⁴. Hier moeten treffers met relatief veel vertrouwen worden opgemerkt, waarmee de eerste stap wordt afgesloten.
3. Ten tweede voert u de stap pandda.analyse opnieuw uit, met uitzondering van de voorlopige hits (bepaald in de eerste stap) van het grondstatusmodel via de opdrachtregeloptie --exclude_from_characterisation="". Meer informatie wordt beschreven op de PanDDA-helppagina's (https://pandda.bitbucket.io/). Op deze manier worden gegevenssets die duidelijke hits zijn en dus het grondstatusmodel zouden verduisteren als ze worden opgenomen, genegeerd. Dit leidt tot een verbeterd grondtoestandsmodel en dus tot betere resultaten in het algemeen. Ten slotte wordt een grondige PanDDA-inspectie uitgevoerd om de hitidentificatie te voltooien.
   OPMERKING: FragMAXapp bevat ook een uitvoeroptie om de gemodelleerde gebonden statussen op te slaan of gegevens voor te bereiden voor PDB-indiening, zie FragMAX-webpagina's (https://fragmax.github.io/) voor meer informatie.

Resultaten

Als onderdeel van de eerder gerapporteerde validatiecampagnes van het F2X-Entry Screen¹¹werden drie campagnes uitgevoerd op de BioMAX-beamline bij MAX IV en één campagne op beamline BL14.1 bij HZB. In de laatste campagne werd een bepaalde set F2X-Entry Screen-omstandigheden met behulp van een soaking-conditie die geen DMSO bevatte, gescreend op het eiwit-eiwitcomplex van gist Aar2 en het RNaseH-achtige domein van gist Prp8 (AR). De geselecteerde set voorwaarden omvat de hits die werden gevonden in een eerdere campagne van het F2X-Entry Screen tegen AR in een soaking conditie met DMSO¹¹, (d.w.z. in de campagne uitgevoerd bij HZB werden die hits opnieuw gescreend bij afwezigheid van DMSO). Figuur 7 toont een overzicht van de hits verkregen na het analyseren van de gegevens met de FragMAXapp combinatie van XDSAPP voor verwerking, fspipeline voor automatische verfijning en daaropvolgende hit finding met behulp van PanDDA.

Figuur 1: Schematische weergave van de workflow van een kristallografisch fragmentscreening (CVS) experiment met een focus op de bijzondere omgeving in het Helmholtz-Zentrum Berlin. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Figuur 2: Formulering en verpakking van het F2X-entry scherm. Het 96-compound scherm is verkrijgbaar op een 3-lens 96-well MRC low-profile plaat, afgedicht met folie en vacuüm verpakt. De 96 verbindingen van het scherm worden gedroogd uit DMSO-oplossingen in twee van de drie lenzen van elke put. Klik hier om een grotere versie van deze afbeelding te bekijken.

Figuur 3: Fotografie van de CVS werkbank in het HZB voorbereidingslab. Samenstellingen van de benodigde gereedschappen voor A) weken en voor B) kristaloogst worden weergegeven. Klik hier om een grotere versie van deze afbeelding te bekijken.

Figuur 4: Eindstations voor gegevensverzameling en besturingssoftware. A) Foto van het experimentele hok van HZB-MX-beamlines BL14.1 (links) en BL14.2 (rechts)¹⁵. B) Schermafbeelding van de MXCuBE2 experiment control interface¹⁶ gebruikt bij BL14.1 voor het verzamelen van diffractiegegevens. Bij BL14.2 wordt een zeer vergelijkbare interface gebruikt. Klik hier om een grotere versie van deze afbeelding te bekijken.  

Figuur 5: Fotografische snapshots van enkele kristallijne monsters in cryogene omgeving vóór het verzamelen van gegevens. Dit illustreert de variabiliteit van morfologieën van de kristallen na het uitvoeren van het fragment weken en kristal oogsten. De foto's zijn genomen op de BioMAX-beamline (MAX IV synchrotron, Lund, Zweden) voor AR-monsters die daar zijn verzameld als onderdeel van de F2X-Entry Screen-validatie¹¹. Klik hier om een grotere versie van deze afbeelding te bekijken.

Figuur 6: Screenshot van de FragMaxApp¹⁸ geïnstalleerd op de HZB voor handige data-analyse. Meer details in Lima et al., FragMAXapp, niet-gepubliceerde gegevens. Klik hier om een grotere versie van deze afbeelding te bekijken.

Figuur 7: Overzicht van de resultaten van de CFS campagne F2X-Entry vs. AR (zonder DMSO). Het AR-eiwitcomplex wordt getoond in cartoonweergave, met Aar2 in grijs gekleurd en het RNaseH-achtige domein van Prp8 blauw gekleurd. De fragmenthits van de campagne zijn gekleurd in elementkleuren (C - geel, O - rood, N - blauw, S - oranje, Cl - licht cyaan). Klik hier om een grotere versie van deze afbeelding te bekijken.

Aanvullende informatie. Klik hier om dit bestand te downloaden. 

Discussie

Voor een succesvolle CVS-campagne is het van vitaal belang om te voldoen aan de beschreven vereisten (zie Inleiding). Een betrouwbaar kristallisatiesysteem is nodig voor de reproduceerbare groei van veel goed-diffracting kristallen, en een goed verfijnde structuur is nodig als het input apo model voor geautomatiseerde verfijning. Het is ook belangrijk om te controleren of de doellocatie op het eiwit (actieve site of interfacegebied) toegankelijk is voor fragmenten in het kristalrooster. Het is van cruciaal belang om de weekomstandigheden vooraf te optimaliseren om ervoor te zorgen dat het weken de kristalkwaliteit niet aanzienlijk verslechtert. Het verwaarlozen van deze aspecten zal zeer waarschijnlijk leiden tot een suboptimaal experiment, dat van beperkt nut zal zijn en in het ergste geval een herhaling van het hele experiment zal vereisen.

Het hierboven beschreven protocol beschrijft de procedures die worden gevolgd tijdens een standaard CFS-campagne. Als aan alle voorwaarden is voldaan, moet ten minste 90% van alle geweekte kristallen diffractie tot hoge resolutie weergeven in een diffractie-experiment. Als dit niet het geval is, kunnen de inweektijden worden verkort tot een paar uur of zelfs minuten. Vanwege de goede oplosbaarheid van de meeste fragmenten zou dit voldoende moeten zijn om fatsoenlijke bezettingswaarden te verkrijgen. Ook zal een typische CVS-campagne resulteren in een hitpercentage van ongeveer 10% of hoger. Voor de F2X-Entry Screen validatiecampagnes¹¹ en lopende gebruikerscampagnes met dezelfde bibliotheek zijn nog hogere hitpercentages waargenomen (20% en hoger, gegevens niet weergegeven).

Een algemeen voorbehoud van kristallografische fragmentscreening is de aanwezigheid van kristallografische contactplaatsen. Deze kunnen a priori bekende actieve sites afsluiten (te controleren voor de screening, zie hierboven), of deze contactsites bieden ook vaak zakken en hotspots waar fragmenten kunnen binden. Dergelijke fragmenttreffers zullen artefacten van het kristallisatierooster zijn en zullen zich waarschijnlijk niet binden aan het eiwit in oplossing. Deze voorvallen komen vaker voor in wekende experimenten dan in cokristallisatie-experimenten (waarschijnlijk als gevolg van de hogere fragmentconcentraties die worden gebruikt bij wekende experimenten). Volgens eerdere ervaringen vormen ze echter over het algemeen slechts een klein deel van de verkregen hits. Bijvoorbeeld, in de F2X-Entry Screen validatiecampagne met endothiapepsine (EP) en het spliceosomaal eiwit-eiwitcomplex van Prp^8RNaseH en Aar2 (AR), kwamen de meeste hits voor op veelbelovende sites¹¹. Voor EP bevonden zich 27 van de 37 waargenomen bindingsgebeurtenissen op de actieve plaats (d.w.z. de peptidesplitsing van dit protease). De 10 bindingsgebeurtenissen op afstand omvatten twee oplosmiddelbloeende bindingsgebeurtenissen en acht kristalcontactbindingsgebeurtenissen (overeenkomend met vijf unieke hits). Het uitsluiten van die crystal contact hits zou nog steeds een totaal percentage van 24% unieke hits voor de EP-campagne weerspiegelen. Het is ook belangrijk op te merken dat bindingsgebeurtenissen op afstand van een bekende actieve locatie (behalve kristalcontactbinders) ook interessant kunnen zijn (bijvoorbeeld het onthullen van nieuwe hotspots of allosterische sites van het eiwit). Voor de AR-campagne (in dezelfde publicatie) bevonden zich van de 23 waargenomen bindingsgebeurtenissen er zeven bij kristalcontacten, één op de directe interface van de twee eiwitten, zeven op bekende eiwit-eiwitinteracties met andere bindingspartners van de grotere biologische context (vandaar verschillende assemblagestadia van het spliceosome), acht bindingsgebeurtenissen onthulden twee hotspots op AR met een nog onbekende functie en één op een oplosmiddel blootgesteld oppervlak van Prp8^RnaseH. Daarom, met uitzondering van de gebeurtenissen bij kristalcontacten en de Prp8^RnaseH singleton, is het aantal potentieel nuttige bindende gebeurtenissen 15 (overeenkomend met 14 unieke hits), dus een hitpercentage van 15,6%. Deze hits kunnen uitgangspunten zijn voor het ontwerp van eiwit-eiwit interactiemodulatoren of voor gereedschapsverbindingen die gericht zijn op het verkennen van de twee ontdekte Aar2-hotspots. Samen, ook in lijn met uitgevoerde gebruikerscampagnes, moet vaak slechts een klein deel van de hits in kristallografische fragmentscreening worden genegeerd als artefacten. Dit zal echter ook grotendeels afhankelijk zijn van het doel.

Als de hit rate aanzienlijk lager is, kan dit wijzen op een van de volgende problemen met betrekking tot het doeleiwit. In een CVS-campagne tegen een viraal cysteïne protease werd bijvoorbeeld een hitpercentage van slechts 3% waargenomen (gegevens niet getoond). Het bleek dat het gebruikte eiwit waarschijnlijk chemisch was gewijzigd in zijn actieve site. In een dergelijk geval kan een ander eiwitpreparaat het probleem oplossen. Als kristallen zeer DMSO-intolerant zijn, kan het F2X-Entry Screen ook zonder DMSO worden gebruikt, hoewel de resultaten tot op zekere hoogte kunnen verschillen. De meeste hits verkregen in aanwezigheid van DMSO zullen ook verschijnen in zijn afwezigheid. Er zullen ook enkele treffers zijn die niet kunnen worden waargenomen bij afwezigheid van DMSO, ook al kunnen ze in zijn aanwezigheid worden waargenomen. En tot slot zullen er enkele zijn die alleen verschijnen bij afwezigheid van DMSO.

De ernstigste moeilijkheid treedt op als het eiwit een geïnduceerde beweging ondergaat bij binding van de stof. Hoogstwaarschijnlijk zal het kristalrooster de eiwitbeweging niet verdragen en zullen de kristallen uiteenvallen. In een dergelijk geval is de enige keuze om hun toevlucht te nemen tot co-kristallisatie van het eiwit en de fragmenten. Dit kan echter leiden tot nieuwe kristalvormen. Daarom zal een groot deel van de automatisering van het hele proces niet meer efficiënt werken. Gelukkig is dit soort problemen tot nu toe in de meeste CVS-campagnes bij de HZB niet aangetroffen. Het kan zijn dat de zwakke binding van een fragment niet genoeg energie levert om een eiwitbeweging te induceren, met name als de gekristalliseerde conformatie wordt gestabiliseerd door kristalverpakkingskrachten.

Een andere ernstige beperking van de methode die de auteurs tot nu toe zijn tegengekomen, is wanneer de kristallisatiecocktail (en dus de wekende oplossing) vluchtige stoffen bevat. Dan wordt het bijna onmogelijk om alle kristalbehandeling op een zinvolle manier uit te voeren.

Verschillende eiwitten kunnen in meer of mindere mate druggable sites bevatten. Eiwit-eiwitinteracties worden bijvoorbeeld meestal gemedieerd door verlengde vlakke oppervlakken die moeilijker te targeten zijn. De fragmentbindende hitsnelheid zal daarom waarschijnlijk afhangen van de structuur van het moleculaire oppervlak van het eiwit. In een extreem geval bevat een eiwit mogelijk geen geschikte oppervlaktehaarden die dienen als doellocaties voor fragmentbinding. Dus, ondanks een zorgvuldig uitgevoerd experiment, zullen er geen fragmenthits het gevolg zijn van de screening. De auteurs zijn echter tot nu toe niet in een dergelijke situatie terechtgekomen.

In principe kan het kristalweek- en oogstgedeelte van een CVS-campagne worden uitgevoerd met behulp van het hierboven beschreven protocol in elk laboratorium dat is uitgerust voor kristalbehandeling. Dit onderscheidt de methodologie bij HZB van andere CFS-faciliteiten en kan in sommige gevallen een voordeel zijn. Als de kristallen bijvoorbeeld niet gemakkelijk opnieuw kunnen worden geproduceerd op een andere locatie of als het reizen van de experimenteerders beperkt is (bijvoorbeeld in een wereldwijde pandemiesituatie), krijgen gebruikers bij HZB daarom de volledige apparatuur (pucks, gereedschap, EasyAccess Frame, monsterhouders, enz.) als draagbare set.

Aan de eisen voor grote aantallen monsterhouders en cryogene opslagcapaciteiten wordt echter nog gemakkelijker voldaan in speciale CFS-faciliteiten. Bovendien pleit de noodzaak van het verzamelen van veel diffractiegegevenssets sterk voor het lokaliseren van deze faciliteiten in de buurt van straallijnen die zijn gericht op een hoge monsterdoorvoer. Voorbeelden hiervan zijn de straallijnen I04-1 bij de Diamond Light Source en de bijbehorende XChem-faciliteit in UK^8,25, de MASSIF-straallijnen bij het ESRF in Frankrijk²⁶ of de FragMAX-faciliteit bij de BioMAX-beamline bij MAX IV in Zweden¹⁸.

In de toekomst zou het kunnen worden voorgesteld om CVS-experimenten te ontwerpen zonder dat kristalbehandeling helemaal nodig is. De eerste vorderingen in deze richting zijn gemeld. Bijvoorbeeld door akoestische vloeistofoverdracht waardoor zowel de kristalhoudende oplossingen als de fragmentoplossingen rechtstreeks op monsterhouders van het meshtype kunnen worden^{gemengd 27}. Een andere aanpak werd gebruikt voor XFEL-gebaseerde ligandscreening. In een proof-of-principle experiment werd een kristal slurry in batch bereid, en soaking en diffraction dataverzameling werden uitgevoerd op een silicium vaste doelchip²⁸. Deze benaderingen zijn echter nog in ontwikkeling en zijn verre van toepasbaar op een breed scala aan eiwitdoelstellingen of haalbaar voor CVS-faciliteiten als routine.

Met het protocol in dit werk zijn gedetailleerde instructies gegeven om CFS-campagnes direct uit te voeren bij HZB (en elders) en zijn algemene richtlijnen en nuttige praktische tips gegeven bij het voorbereiden en uitvoeren van dergelijke experimenten met hogere kansen op succes. Uiteindelijk dragen betere kansen en slagingspercentages in CVS-screening grotendeels bij aan het efficiënt bieden van startpunten voor downstreamontwikkeling van gereedschapsverbindingen of medicijnkandidaten.

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel

Naam	Bedrijf	Catalogusnummer	Opmerkingen
1 µL pipet	Eppendorf	EP3123000012
12 kanaals pipet, 100 µL	Eppendorf	EP4861000791
Haardroger	TH-Geyer	9.106 788
Kristalle bevattende kristallisatie platen			Bevat kristallen die geweekt moeten worden
Kristallisatie incubator			Zorgt voor constante temperatuur voor kristallisatie-experiment, bij HZB: 20°C
Dual Thickness MicroLoops (LD) van verschillende apertuurgrootten	MiTeGen	various, e.g. M5-L18SP-75LD	250 loops in de juiste grootte die nodig zijn voor het protocol, kan worden geleverd door HZB
EasyAccess Frame	HZB		De EasyAccess Frame is een speciaal apparaat voor het hanteren van meerdere kristallen, dat is ontwikkeld bij de HZB (Barthel et al., 2021).
F2X-Entry Screen plaat	HZB		Ontwikkelde F2X-Entry Screen (Wollenhaupt et al., 2020)
Glas spot plaat	VWR	MARI1406506
Vloeibare stikstof			Minimaal een gevulde 5 L bus
Vloeibare stikstofopslagbus	n.v.t.	n.v.t.
Magneetkristallenstaaf	MiTeGen	M-R-1013198
Microscopen	Leica	n.v.t.
MRC 3-lens 96-well low profile kristallisatieplaat	SwissCI	3W96TLP-UVP	Voor mock-geweekte kristallen (optioneel)
Reagens reservoir	Carl Roth	EKT6.1	25 ml volume
Sample tracking template			https://www.jove.com/files/ftp_upload/62208/TemplateCFSHZBSampleTracking. xlsx
Schaar	B. Braun	BA825SU
Afdichtfolie voor microtiterplaten	GreinerBioOne	676070
Gestelde puckverzendbussen (voor Unipucks)	MiTeGen	M-CP-111-065	2 bussen gemaakt van aluminium; kan worden geleverd door de HZB
Weekoplossing			Minimaal 5 ml is nodig
Weekoplossing inclusief cryo-protectant, 150µL			Alleen nodig als weekoplossing nog geen cryo-protectant is
Doekjes	Roth (Kimberly Clark Professional)	AA64.1
Transport dewar (Whartington dry shipper)	MiTeGen	TW-CX100	2 Reisdewars voor opslag van de 2 unipuck bussen, alternatief kan een opslagdewar van type VHC35 of vergelijkbaar worden gebruikt.
Unipuck schuim dewars met deksel	MiTeGen	M-CP-111-022	twee schuimdewaars speciaal geschikt voor unipuck-hantering zoals beschreven in het protocol als SPINE pucks worden gebruikt, kunnen verschillende schuim dewars moeten worden toegepast.
Unipuck startset	MiTeGen	M-CP-UPSK001	Kan worden geleverd door de HZB
Unipucks	MiTeGen	M-CP-111-021	14 unipucks; kan worden geleverd door de HZB