Differentiatie van door varkens geïnduceerde pluripotente stamcellen (piPSC's) tot neurale voorlopercellen (NPC's)

Samenvatting

Dit protocol beschrijft een methode voor chemische differentiatie en kweek van neurale voorlopercellen afgeleid van door varkens geïnduceerde pluripotente stamcellen (piPSC's).

Samenvatting

iPSC-afgeleide neuronen zijn aantrekkelijke in vitro modellen om neurogenese en vroege fenotypische veranderingen bij psychische aandoeningen te bestuderen, vooral wanneer de meeste diermodellen die in preklinisch onderzoek worden gebruikt, zoals knaagdieren, niet kunnen voldoen aan de criteria om de bevindingen naar de kliniek te vertalen. Niet-menselijke primaten, hoektanden en varkens worden beschouwd als geschiktere modellen voor biomedisch onderzoek en de ontwikkeling van geneesmiddelen, voornamelijk vanwege hun fysiologische, genetische en anatomische overeenkomsten met mensen. Het varkensmodel heeft bijzondere belangstelling gekregen voor translationele neurowetenschappen, waardoor veiligheids- en allotransplantatietesten mogelijk zijn. Hierin wordt de generatie van iPSC's bij varkens beschreven, samen met de verdere differentiatie ervan tot neurale voorlopercellen (NPC's). De gegenereerde cellen brachten NPC-markers Nestin en GFAP tot expressie, bevestigd door RT-qPCR, en waren positief voor Nestin, b-Tubuline III en Vimentin door immunofluorescentie. Deze resultaten tonen het bewijs voor het genereren van NPC-achtige cellen na in vitro inductie met chemische remmers uit een groot diermodel, een interessant en adequaat model voor onderzoek naar regeneratieve en translationele geneeskunde.

Inleiding

Hoewel veel onderzoekers ernaar streven de cellulaire mechanismen en pathologische ontwikkeling van neurologische aandoeningen bij mensen beter te begrijpen, zijn er veel beperkingen aan het gebruik van niet-invasieve technieken bij mensen, zoals magnetische resonantiebeeldvorming (MRI), en de onmogelijkheid, in de meeste gevallen, om invasieve technieken zoals tract-tracing en intracellulaire registratie toe te passen¹. Het is ook een uitdaging om postmortaal hersenweefsel van goede kwaliteit te verkrijgen, aangezien langdurige agonale toestanden van donoren de hersenen kunnen aantasten en de onderzoeken kunnen verstoren². Daarom is het noodzakelijk dat diermodellen, die al tientallen jaren worden gebruikt in translationeel onderzoek, tot op de dag van vandaag zowel relevant als twijfelachtig zijn. De keuze van een bepaald diermodel wordt een centrale vraag in de recente experimentele opzet en planning, waarbij duidelijk wordt dat om consistente resultaten te verkrijgen, de selectie van het meest geschikte model een grondige kennis vereist, niet alleen van de fysiologie van de verschillende soorten, maar ook, wat belangrijk is, van de specifieke doelstellingen van het onderzoek³.

Diermodellen vertonen echter vaak beperkingen bij het capituleren van de structuur en ontwikkeling van het menselijk brein, omdat het een aantal unieke ontwikkelings-, anatomische, moleculaire en genetische kenmerken heeft. Daarom is het enigszins moeilijk om gegevens te interpreteren en te extrapoleren die zijn verzameld van dieren die in onderzoek zijn gebruikt, zoals gegevens van knaagdieren¹.

Onder de grote verscheidenheid aan diermodellen die tegenwoordig beschikbaar zijn, waaronder transgene modellen, worden sommige grote dieren als zeer waardevol beschouwd, zoals niet-menselijke primaten, hoektanden en varkens⁴. De fysiologische, genetische en anatomische overeenkomsten tussen mensen en varkens met betrekking tot orgaangrootte benadrukken het belang van deze modellen bij het ontwikkelen van diagnostische en therapeutische benaderingen. Vooral het varkensmodel heeft bijzondere belangstelling gekregen voor translationele neurowetenschappen, waardoor veiligheids- en allotransplantatietesten mogelijk zijn. Het is gebruikt in onderzoek met betrekking tot cardiovasculaire, pulmonale en gastro-intestinale aandoeningen, en in het bijzonder voor het testen van nieuwe therapieën (bijv. in onderzoeken naar regeneratieve geneeskunde met stamcellen^{5, 6}).

In deze context zijn in vitro modellen, en meer specifiek geïnduceerde pluripotente stamcellen (iPSC's)-afgeleide neuronen, aantrekkelijke modellen om de studie van neurogenese en vroege fenotypische veranderingen bij psychische aandoeningen mogelijk te maken, vooral wanneer de meeste diermodellen die in preklinisch onderzoek worden gebruikt, zoals knaagdieren, niet in staat zijn om te voldoen aan de criteria om de bevindingen naar de kliniek te vertalen.

Het gebruik van iPSC's heeft de neurowetenschappen enorm geprofiteerd door ziektemodellering in vitro mogelijk te maken, met name door gebruik te maken van iPSC's-afgeleide neurale voorlopercellen (NPC), aangezien NPC's een interessant hulpmiddel zijn gebleken voor in vitro ziektemodellering ^7,8,9. iPSC's zijn met succes gegenereerd bij patiënten met de ziekte van Alzheimer¹⁰, schizofrenie¹¹ en vele andere ziekten zoals de ziekte van Parkinson, het syndroom van Rett, spinale musculaire atrofie, het syndroom van Down en amyotrofische laterale sclerose, zoals samengesteld door Mungenast en medewerkers². Er zijn ook preklinische diermodelsystemen gerapporteerd die gebruik maken van iPSC-afgeleide NPC's als functionele wervelkolomtransplantaten met minimale of geen gedetecteerde immuunrespons 12,13,14.

Hierin wordt het genereren van iPSC's bij varkens en verdere chemische differentiatie tot vermeende neurale voorlopercellen beschreven (Figuur 1 en Figuur 2). De gegenereerde cellen brachten NPC-markers Nestin en GFAP tot expressie, bevestigd door RT-qPCR, en waren positief voor Nestin, β-Tubuline III en Vimentin door immunofluorescentie. Deze resultaten tonen het bewijs van het genereren van NPC-achtige cellen na in vitro inductie met chemische remmers uit een groot diermodel, een belangrijk en adequaat model voor onderzoek naar regeneratieve en translationele geneeskunde.

Protocol

Deze experimenten werden goedgekeurd door de Ethische Commissie voor Dierproeven van de Faculteit Dierwetenschappen en Voedingstechnologie, Universiteit van São Paulo (vergunningsnummers: nr. 5130110517 en nr. 4134290716).

OPMERKING: Alle procedures met cellulaire cultuur en incubaties worden uitgevoerd in een gecontroleerde atmosfeer (38,5 °C en 20% CO₂ in lucht, maximale vochtigheid). Cellulaire passage werd uitgevoerd door 5 minuten incubatie met dissociatiereagens en cellen werden teruggevonden na centrifugatie (300 x g).

1. Herprogrammering van varkensfibroblasten tot iPSC

1. Voorbereiding van het experiment
   1. Bereid fibroblast en 293 kweekmedia bestaande uit Iscove's Modified Dulbecco's Medium (IMDM) aangevuld met 10% foetaal runderserum (FBS), 0,1 mM niet-essentiële aminozuren en 1% antibiotica (penicilline/streptomycine), tenzij anders vermeld.
   2. Bereid iPSC-kweekmedium (herprogrammeringsmedium) bestaande uit DMEM/F12 met een lage osmolaliteit (geoptimaliseerd voor de groei van menselijke embryonale en geïnduceerde pluripotente stamcellen) aangevuld met 20% serumvervanging, 0,1 mM niet-essentiële aminozuren, 1 mM glutamine, 3,85 μM β-mercaptoethanol, 10 ng/ml bFGF en 1% antibiotica.
   3. Zaai indien nodig embryonale fibroblasten (MEF's) van muizen in een T75-kolf (10 ml) om de volgende dag 70-80% confluentie te verkrijgen (ongeveer 6 x 10⁵ per T75). De volgende dag inactiveren door een incubatie van 2 uur en 30 minuten met 200 μl 0,5 mg/ml mitomycine C (voeg mitomycine toe aan de T75 bevattende MEF's zonder voorafgaande mediawisseling).
   4. Na de incubatieperiode worden de cellen na incubatie gedurende 5 minuten met een dissociatieoplossing teruggewonnen en gezaaid in putjes die eerder met gelatine zijn bedekt in een plaat met 6 putjes in een concentratie van 1x10⁵ .
   5. Bestrijk de putjes door ze gedurende 20 minuten bij 37 °C te incuberen met een gelatineoplossing van 0,1 % (ongeveer 1 ml gelatineoplossing per putje om het hele putje te bedekken) en zuig ze onmiddellijk op. Verwijder vervolgens de oplossing en vervang deze door kweekmedium (2 ml per putje).
2. Transfectie en lentivirale productie
   1. Kweek 293 cellen in T75-kweekkolven totdat het een samenvloeiing van ongeveer 90% bereikt.
   2. Dissocieer cellen en zaad 5 x 10⁶ cellen per nieuwe T75-kolf zonder antibiotica.
   3. De volgende dag, bereid twee oplossingen per kolf (T75) voor transfectie: 1: 1,5 ml IMDM (geen antibiotica, geen serum) met de juiste concentratie van elke vector (12 μg OSKM; 1,2 μg TAT; 1,2 μg REV; 1,2 μg hgpm2 en 2,4 μg VSVG_{2°generation);} en 2: 1,5 ml IMDM (geen antibiotica, geen serum) plus 36 μl lipofectiereagens (of zoals aanbevolen door de fabrikant) ¹⁵.
   4. Meng de oplossingen en incubeer gedurende 15 minuten.
   5. Vervang ondertussen het medium van de 293 cellen en voeg slechts 7 ml IMDM toe, aangevuld met 10% FBS per kolf.
   6. Voeg na de incubatietijd 3 ml van het lipofectiereagens + plasmiden toe aan elke kolf. Vervang het medium na 6 uur door IMDM 10% FBS (optioneel).
   7. Verzamelmedium (volledig volume - 10 ml per T75) op de tijdstippen van 24, 48 en 72 uur. Filter het met een PVDF-filter van 0,45 mm en weeg het voor balancering vóór ultracentrifugatie.
   8. Centrifugeer gedurende 1 uur en 30 minuten op 48.960 x g.
   9. Gooi het bovenstaande weg door het te gieten en incubeer de resterende inhoud (ongeveer 200 μl) gedurende 1 uur bij 4 °C.
   10. Resuspendeer de virale pellet door voorzichtig meerdere keren op en neer te pipetteren en aliquot virale oplossing.
3. Transductie
   1. Zaai 2x10⁴ fibroblasten per putje van een plaat met 6 putjes. Voeg putten toe voor moleculaire analyse (bijv. PCR) en transductiecontroles (bijv. GFP-analyses) (optioneel).
   2. Verwijder de volgende dag 1 ml medium en voeg 1 μl hexadimetrinebromide (8 μg/ml) en 50 μl van de virale oplossing toe.
   3. Incubeer gedurende 3 tot 4 uur, gevolgd door een volledige mediumwissel (2 ml) (dag 0).
   4. Kweek cellen gedurende 5 dagen, vervang het medium om de 2 dagen.
   5. Bereid vooraf 0,1% met gelatine beklede en MEF-platen voor zoals beschreven in punt 1.1.3.
   6. Om cellen te dissociëren en cellen opnieuw te platen in herprogrammeringsmedium, wast u putjes met 1 ml fosfaatgebufferde zoutoplossing (PBS). PBS verwijderen.
   7. Voeg 1 ml dissociatiereagens per putje toe en incubeer de cellen gedurende 5 minuten bij 37 °C.
   8. Breng de cellen over in een conische buis en centrifugeer de cellen gedurende 5 minuten bij 300 x g en suspendeer ze opnieuw in 1-3 ml iPSC-kweekmedium.
   9. Tel de cellen met behulp van een Neubauer-kamer of een celtellerapparatuur en zaai ze in een concentratie van 1-2 x 10⁴ in eerder 0,1% met gelatine beklede en met MEF's bedekte putjes.
   10. Vervang het iPSC-kweekmedium elke 2 dagen.
   11. iPSC-kolonies (bij passage 0, P0) verschijnen ongeveer 10 dagen van de herprogrammeringsperiode. Pluk handmatig morfologisch typische kolonies (ronde randen en cellen met een hoge nucleair-cytoplasmaverhouding) met behulp van een naald van 26 G om de kolonie en de omliggende MEF's los te maken.
   12. Breng 1 kolonie per nieuwe put over, individueel, met behulp van een pipetpunt van 10 of 100 μL, voor klonale kweek en karakterisering van vermeende iPSC-cellijnen.
4. Varkens iPSC passeren
   1. Handmatig passeren en kolonie plukken
      1. Reinig en breng een omgekeerde microscoop over in een laminaire stromingskap.
      2. Steriliseer de microscoop gedurende 15 minuten met ultraviolet (UV) licht.
      3. Was eerder gelatine en MEF gecoate putjes met PBS voorafgaand aan de kolonieoverdracht. PBS verwijderen.
      4. Voeg 2 ml iPSC-medium toe.
      5. Zoek de interessante kolonie in de put die zal worden gebruikt.
      6. Gebruik de afschuining van een insulinespuitnaald om de kolonie te scheiden van de omliggende cellen.
      7. Als de kolonie klein is, maakt u deze los van de put door het medium op en neer te pipetteren met een pipet van 10 μl.
      8. Als het een grotere kolonie is, knip deze dan met de naald in een paar kleinere segmenten.
      9. Zuig de kolonie of de fragmenten van de kolonie op met een pipet van 10 μL.
      10. Breng het over naar de nieuwe put.
   2. Enzymatische passage van klonale lijnen
      1. Was putten met PBS. PBS verwijderen.
      2. Voeg 1 ml dissociatiereagens per putje toe en incubeer de cellen gedurende 5 minuten bij 37 °C.
      3. Breng ongeveer 100 μL cellen over naar een nieuw putje. Dit bedrag kan variëren tussen verschillende cellijnen; Daarom wordt dagelijkse visuele analyse van de samenvloeiing ten zeerste aanbevolen.

2. Inductie van iPSC's bij varkens in NPC's

1. Voorbereiding van het experiment
   1. Bereid Neural Induction Medium (NIM) samengesteld uit 50% Neurobasaal medium en 50% DMEM/F-12 aangevuld met B27-Minus Vitamine A (20 μL/ml), N2 (10 μL/ml), 1 mM glutamine (10 μL/ml), penicilline-streptomycine (1 μL/ml). Filtreer de oplossing in een filter van 0,22 μm en voeg BMP-signaleringsremmer LDN193189 en ALK-remmer SB431542 toe in een eindconcentratie van respectievelijk 0,1 μM en 10 μM.
   2. Smeer de putjes van een plaat met 6 putjes in met 1 ml matrixoplossing en incubeer deze gedurende ten minste 30 minuten bij 37 °C. Verwijder de matrixoplossing en voeg E8-medium toe voor iPSC-cultuur.
   3. Bereid op dag 13 van het inductieprotocol Neural Expansion Medium (NEM) voor, samengesteld uit 50% neurobasaal medium en 50% DMEM/F-12 aangevuld met B27-Minus vitamine A (20 μl/ml), N2 (10 μl/ml), NEAA (10 μl/ml), 1 mM glutamine (10 μl/ml), penicilline-streptomycine (1 μl/ml). Filtreer de oplossing in een filter van 0,22 μm en voeg FGF2 en EGF toe tot een eindconcentratie van 10 ng/ml.
2. Inductie protocol
   1. De dag voordat de iPSC's 100% samenvloeiing bereiken, brengt u cellen over naar een nieuwe put (1:1-splitsing). Was het goed door 1 ml PBS toe te voegen. PBS verwijderen.
   2. Voeg 1 ml 0,5 mM EDTA toe en incubeer de cellen gedurende 5 minuten bij 37 °C.
   3. Verwijder EDTA en voeg 1 ml E8-kweekmedium toe.
   4. Was de cellen voorzichtig van het putje en breng de inhoud over in een nieuw putje dat eerder is bedekt met matrixoplossing.
   5. Was de volgende dag de putjes met PBS. Verwijder PBS en voeg 2 ml NIM toe.
   6. Vervang het inductiemedium elke dag gedurende 14 dagen.
   7. Was op dag 14 putjes met PBS. PBS verwijderen.
   8. Voeg 1 ml celdissociatiereagens per putje toe en incubeer de cellen gedurende 5 minuten bij 37 °C.
   9. Breng de cellen over in een conische buis en centrifugeer de cellen gedurende 5 minuten bij 300 x g en suspendeer ze opnieuw in 6 ml NEM-medium.
   10. Voeg 60 μl (10 μl/ml) van een terugwinningsoplossing na ontdooiing toe en breng 2 ml van de oplossing over in elk met matrix bekleed putje.
   11. Vervang het NEM-medium de volgende dag en vervolgens om de twee dagen.
       OPMERKING: Elke put die het inductieprotocol heeft doorlopen, wordt beschouwd als aanleiding gevend tot een nieuwe NPC-lijn. Daarom mogen hun respectievelijke cellen niet worden gemengd.

3. NPC passeren

1. Goed wassen met 1 ml PBS. PBS verwijderen.
2. Voeg 1 ml celdissociatiereagens toe en incubeer de cellen gedurende 5 minuten bij 37 °C.
3. Was de cellen van het putje voorzichtig en doe de inhoud in een conische buis.
4. Centrifugeer de oplossing gedurende 5 minuten bij 300 x g. Verwijder het bovenstaande en voeg 6 ml NEM toe.
5. Homogeniseer de pellet voorzichtig en breng 2 ml van de oplossing over naar een nieuw putje dat eerder is bedekt met matrixoplossing.

Resultaten

Karakterisering van piPSC
De karakterisering was gericht op het bepalen van de verwerving van pluripotentie van de geherprogrammeerde cellen. Voor dat doel werden embryoïde vorming, immunofluorescentiekleuring voor pluripotentiemarkers en genexpressie en spontane differentiatie in embryoïde lichamen (EB's) uitgevoerd.

Gegenereerde celkolonies vertoonden een platte, compacte morfologie in celclusters met goed gedefinieerde grenzen, zoals ver...

Discussie

Via dit protocol werden fibroblasten in vitro geherprogrammeerd met behulp van de exogene expressie van OCT4, SOX2, c-MYC en KLF4. De geherprogrammeerde cellen werden gedurende meer dan 20 passages in vitro gehouden. Toen deze lijnen werden onderworpen aan de neuronale differentiatie met behulp van chemische remmers, brachten ze de markers Nestin en GFAP van de neuronale voorlopercellen tot expressie, bevestigd door RT-qPCR, en waren ze positief voor N...

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel

Naam	Bedrijf	Catalogusnummer	Opmerkingen
293FT	Invitrogen	# R70007
6 well plates	Costar	# 3516
anti-B-Tubulin III	abcam	# ab7751
anti-NANOG	abcam	# ab77095
anti-NESTIN	Millipore	# ABD69
anti-OCT4	Santa Cruz biotechnology	# SC8628
anti-SOX2	abcam	# ab97959
anti-SSEA1	Millipore	# MAB4301
anti-TRA1-60	Millipore	# MAB4360
anti-VIMENTIN	abcam	# ab8069
B27-Minus Vitamin A	Life Technologies	# 12587010
DMEM/F-12	Life Technologies	# 11960
donkey anti-goat 488	Invitrogen	#  A11055
EGF	Sigma	# E9644
Fetal Bovine Serum	Gibco	# 10099
FGF2	Peprotech	# 100-18B
GlutaMAX	Gibco	# 35050-061
Glutamine	Gibco	# 25030-081
goat anti-mouse 594	Invitrogen	#  A21044
goat anti-rabbit 488	Invitrogen	# A11008
Hexadimethrine bromide	Sigma Aldrich	# 107689
HighCapacity  kit	Life Technologies	# 4368814
IMDM	Gibco	# 12200-036
KnockOut DMEM/F-12	Gibco	# 12660-012
Knockout serum replacement	Gibco	# 10828-028
LDN-193189	Sigma-Aldrich	# SML0559
Leukocyte Alkaline Phosphatase kit	Sigma Aldrich	# 86R
Lipofectamine P3000™	Invitrogen	# L3000-015
Matrigel	Corning	# 354277
Mitomycin C	Sigma Aldrich	# M4287-2MG
N2	Life Technologies	# 17502048
Nanodrop ND-1000	Nanodrop Technologies, Inc.
Neurobasal medium	Life Technologies	# 21103049
Non-essential amino-acids	Gibco	# 11140-050
Penicillin-Streptomycin	Gibco	# 15140-122
Revita Cell	Gibco	# A2644501
Rnase out	Life Technologies	# 10777019
SB431542	Stemgent	# 72232
StemPro Accutase	Gibco	# A11105-01
SW28 rotor	Beckman Coulter	# 342207
Trizol	Life Technologies	# 15596026
TrypLE Express	Gibco	# 12604-021
β-mercaptoethanol	Gibco	# 21985-023