Methodenartikel

Het formuleren en karakteriseren van lipide nanodeeltjes voor genafgifte met behulp van een microfluïdisch mengplatform

DOI:

10.3791/62226

⸱

25 februari 2021

 ,  ,  ,  , 
1Biologics Drug Product Development & Manufacturing, Sanofi, Framingham, Massachusetts

* These authors contributed equally

In dit artikel

Samenvatting

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Lipide nanodeeltjes worden ontwikkeld met behulp van een microfluïdische mengplatformbenadering voor mRNA- en DNA-inkapseling.

Samenvatting

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Op lipiden gebaseerde medicijndragers zijn gebruikt voor klinisch en commercieel beschikbare toedieningssystemen vanwege hun kleine formaat, biocompatibiliteit en hoge inkapselingsefficiëntie. Het gebruik van lipide nanodeeltjes (LNP's) om nucleïnezuren in te kapselen is voordelig om het RNA of DNA te beschermen tegen afbraak, terwijl het ook de cellulaire opname bevordert. LNP's bevatten vaak meerdere lipidecomponenten, waaronder een ioniseerbare lipide, helperlipide, cholesterol en polyethyleenglycol (PEG) geconjugeerd lipide. LNP's kunnen gemakkelijk nucleïnezuren inkapselen vanwege de ioniseerbare lipideaanwezigheid, die bij lage pH kationisch is en complexatie mogelijk maakt met negatief geladen RNA of DNA. Hier worden LNP's gevormd door het inkapselen van boodschapper-RNA (mRNA) of plasmide-DNA (pDNA) met behulp van snelle menging van de lipidecomponenten in een organische fase en de nucleïnezuurcomponent in een waterige fase. Dit mengen wordt uitgevoerd met behulp van een nauwkeurig microfluïdisch mengplatform, waardoor zelfassemblage van nanodeeltjes mogelijk is met behoud van de laminaire stroom. De hydrodynamische grootte en polydispersiteit worden gemeten met behulp van dynamische lichtverstrooiing (DLS). De effectieve oppervlaktelading op de LNP wordt bepaald door de zetapotentiaal te meten. De inkapselingsefficiëntie wordt gekenmerkt met behulp van een fluorescerende kleurstof om ingesloten nucleïnezuur te kwantificeren. Representatieve resultaten tonen de reproduceerbaarheid van deze methode en de invloed die verschillende formulerings- en procesparameters hebben op de ontwikkelde LNP's.

Inleiding

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Medicijndragers worden gebruikt om een therapeutisch middel te beschermen en af te leveren met typische gunstige eigenschappen, waaronder lage cytotoxiciteit, verhoogde biologische beschikbaarheid en verbeterde stabiliteit1,2,3. Polymere nanodeeltjes, micellen en op lipiden gebaseerde deeltjes zijn eerder onderzocht voor nucleïnezuurinkapseling en -afgifte4,5,6,7. Lipiden zijn gebruikt in verschillende soorten nanodragersystemen, waaronder liposomen....

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Een schema van het totale proces is opgenomen in figuur 1.

1. Voorbereiding van buffers

OPMERKING: Steriele filtering van de buffers wordt hier sterk aanbevolen om deeltjes te verwijderen die de nucleïnezuur- en LNP-kwaliteit kunnen beïnvloeden.

  1. Fosfaat gebufferde zoutoplossing (PBS)
    1. Bereid 1x PBS met 8 mM Na2HPO4,2 mM KH2PO4, 137 mM NaCl en 2,7 mM KCl in nucleasevrij water en stel de pH in op 7,4.
    2. Steriliseer door vacuümfiltratie met behulp van een poriegroot filter van 0,22 μm.
  2. Citraat b....

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Resultaten

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Meerdere batches LNP's met dezelfde lipideformulering en N / P-verhouding van 6 werden op afzonderlijke dagen ontwikkeld om de reproduceerbaarheid van de techniek aan te tonen. Batch 1 en 2 resulteerden in overlappende grootteverdelingen met vergelijkbare polydispersiteit (Figuur 2A) Er werd geen significant verschil waargenomen in de grootte of inkapselingsefficiëntie tussen de twee verschillende batches (figuur 2B). De inkapsel.......

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Discussie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Reproduceerbaarheid, snelheid en screening met een laag volume zijn belangrijke voordelen van het gebruik van microfluïdische menging om LNP's te vormen in vergelijking met andere bestaande methoden (bijv. Lipid film hydratatie en ethanolinjectie). We hebben de reproduceerbaarheid van deze methode aangetoond zonder impact op de inkapselingsefficiëntie of deeltjesgrootte waargenomen met verschillende LNP-batches. Dit is een essentieel criterium voor elk therapeutisch middel, inclusief LNP's, om klinisch beschikbaar te wor.......

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Openbaarmakingen

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Alle auteurs zijn medewerkers van Sanofi. De auteurs verklaren dat ze geen belangenconflict of concurrerende financiële belangen hebben.

Dankbetuigingen

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Dank aan Atul Saluja, Yatin Gokarn, Maria-Teresa Peracchia, Walter Schwenger en Philip Zakas voor hun begeleiding en bijdragen aan de ontwikkeling van LNP.

....

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel
NaamBedrijfCatalogusnummerOpmerkingen
1,2-dimyristoyl-rac-glycero-3-methoxypolyethylene glycol-2000 (C-14 PEG)Avanti Polar Lipids880151P
10 µl Graduated Filter Tips  (RNase-,DNase-, DNA-free)USA Scientific1121-3810
1000 µl Graduated Filter Tips (RNase-,DNase-, DNA-free)USA Scientific1111-2831
20 µl Beveled Filter Tips (RNase-,DNase-, DNA-free)USA Scientific1120-1810
200 µl Graudated Filter Tips (RNase-,DNase-, DNA-free)USA Scientific1120-8810
3β-Hydroxy-5-cholestene, 5-Cholesten-3β-ol (Cholesterol)Sigma-AldrichC8667
BD Slip Tip Sterile Syringes (1 ml syringe)Thermo Fisher Scientific14-823-434
BD Slip Tip Sterile Syringes (3 ml syringe)Thermo Fisher Scientific14-823-436
BD Vacutainer General Use Syringe Needles (BD Blunt Fill Needle 18G)Thermo Fisher Scientific23-021-020
Benchtop CentrifugeBeckman coulter
Black 96 well platesThermo Fisher Scientific14-245-177
BrandTech BRAND BIO-CERT RNase-, DNase-, DNA-free microcentrifuge tubes (1.5mL)Thermo Fisher Scientific14-380-813
Citric AcidFisher Scientific02-002-611
Corning 500ml Vacuum Filter/Storage Bottle System, 0.22 um poreCorning430769
Disposable folded capillary cellsMalvernDTS1070
Ethyl Alcohol, Pure 200 proofSigma-Aldrich459844
Fisher Brand Semi-Micro CuvetteThermo Fisher Scientific14955127
Invitrogen Conical Tubes (15 mL) (DNase-RNase-free)Thermo Fisher ScientificAM12500
MilliporeSigma Amicon Ultra Centrifugal Filter UnitsThermo Fisher ScientificUFC901024
NanoAssemblr BenchtopPrecision Nanyosystems
Nuclease-free waterThermo Fisher ScientificAM9930
Phosphate Buffered Saline (PBS)Thermo Fisher ScientificAM9624
Quant-iT PicoGreen dsDNA Assay KitThermo Fisher Scientific P7589
Quant-iT RiboGreen RNA Assay KitThermo Fisher ScientificR11490
Sodium ChlorideFisher Scientific02-004-036
Sodium Citrate, Dihydrate, granularFisher Scientific02-004-056
SpectraMax i3xMolecular Devices
Zetasizer NanoMalvern

Referenties

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Mitchell, M. J., Billingsley, M. M., Haley, R. M., Wechsler, M. E., Peppas, N. A., Langer, R., et al. Engineering precision nanoparticles for drug delivery. Nature Reviews Drug Discovery. , 1-24 (2020).
  2. Davis, M. E., Chen, Z., Shin, D. M.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Herprints en machtigingen

Toestemming aanvragen om de tekst of afbeeldingen van dit JoVE-artikel te hergebruiken

Toestemming aanvragen

Trefwoorden

Inkapseling van nucle nezurenaflevering van messenger RNAaflevering van plasmide DNAdynamische lichtverstrooiingzetapotentiaalinkapselingseffici ntieniet virale genaflevering

Gerelateerde artikelen