Methodenartikel

Het formuleren en karakteriseren van lipide nanodeeltjes voor genafgifte met behulp van een microfluïdisch mengplatform

DOI:

10.3791/62226

⸱

25 februari 2021

 ,  ,  ,  , 
1Biologics Drug Product Development & Manufacturing, Sanofi, Framingham, Massachusetts

* These authors contributed equally

In dit artikel

Samenvatting

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Lipide nanodeeltjes worden ontwikkeld met behulp van een microfluïdische mengplatformbenadering voor mRNA- en DNA-inkapseling.

Samenvatting

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Op lipiden gebaseerde medicijndragers zijn gebruikt voor klinisch en commercieel beschikbare toedieningssystemen vanwege hun kleine formaat, biocompatibiliteit en hoge inkapselingsefficiëntie. Het gebruik van lipide nanodeeltjes (LNP's) om nucleïnezuren in te kapselen is voordelig om het RNA of DNA te beschermen tegen afbraak, terwijl het ook de cellulaire opname bevordert. LNP's bevatten vaak meerdere lipidecomponenten, waaronder een ioniseerbare lipide, helperlipide, cholesterol en polyethyleenglycol (PEG) geconjugeerd lipide. LNP's kunnen gemakkelijk nucleïnezuren inkapselen vanwege de ioniseerbare lipideaanwezigheid, die bij lage pH kationisch is en complexatie mogelijk maakt met negatief geladen RNA of DNA. Hier worden LNP's gevormd door het inkapselen van boodschapper-RNA (mRNA) of plasmide-DNA (pDNA) met behulp van snelle menging van de lipidecomponenten in een organische fase en de nucleïnezuurcomponent in een waterige fase. Dit mengen wordt uitgevoerd met behulp van een nauwkeurig microfluïdisch mengplatform, waardoor zelfassemblage van nanodeeltjes mogelijk is met behoud van de laminaire stroom. De hydrodynamische grootte en polydispersiteit worden gemeten met behulp van dynamische lichtverstrooiing (DLS). De effectieve oppervlaktelading op de LNP wordt bepaald door de zetapotentiaal te meten. De inkapselingsefficiëntie wordt gekenmerkt met behulp van een fluorescerende kleurstof om ingesloten nucleïnezuur te kwantificeren. Representatieve resultaten tonen de reproduceerbaarheid van deze methode en de invloed die verschillende formulerings- en procesparameters hebben op de ontwikkelde LNP's.

Inleiding

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Medicijndragers worden gebruikt om een therapeutisch middel te beschermen en af te leveren met typische gunstige eigenschappen, waaronder lage cytotoxiciteit, verhoogde biologische beschikbaarheid en verbeterde stabiliteit1,2,3. Polymere nanodeeltjes, micellen en op lipiden gebaseerde deeltjes zijn eerder onderzocht voor nucleïnezuurinkapseling en -afgifte4,5,6,7. Lipiden zijn gebruikt in verschillende soorten nanodragersystemen, waaronder liposomen en lipide nanodeeltjes, omdat ze biocompatibel zijn met een hoge stabiliteit8. LNP's kunnen gemakkelijk nucleïnezuren inkapselen voor genafgifte9,10. Ze beschermen het nucleïnezuur tegen afbraak door serumproteasen tijdens systemischecirculatie 11 en kunnen de afgifte op specifieke locaties verbeteren, omdat de oppervlaktetopografie en fysische eigenschappen van LNP's hun biodistributie beïnvloeden12. LNP's verbeteren ook de weefselpenetratie en cellulaire opname9. Eerdere studies hebben het succes aangetoond van siRNA-inkapseling binnen een LNP13, waaronder de eerste commercieel verkrijgbare LNP-bevattende siRNA-therapeutische voor de behandeling polyneuropathie van erfelijke transthyretine-gemedieerde amyloïdose14-behandeling die in 2018 werd goedgekeurd door de Amerikaanse Food and Drug Administration (FDA) en het Europees Geneesmiddelenbureau. Meer recent worden LNP's bestudeerd voor de afgifte van grotere nucleïnezuurmoieties, namelijk mRNA en DNA9. Vanaf 2018 waren er ~ 22 op lipiden gebaseerde nucleïnezuurafgiftesystemen die klinische onderzoeken ondergingen14. Bovendien zijn mRNA-bevattende LNP's momenteel leidende kandidaten en zijn ze gebruikt voor een COVID-19-vaccin15,16. Het potentiële succes voor deze niet-virale gentherapieën vereist het vormen van kleine (~ 100 nm), stabiele en uniforme deeltjes met een hoge inkapseling van het nucleïnezuur.

Het gebruik van een ioniseerbare lipide als hoofdbestanddeel in de LNP-formulering heeft voordelen aangetoond voor complexatie, inkapseling en afgifte-effciciency14. Ioniseerbare lipiden hebben meestal een zuurdissociatieconstante (pKa) < 7; dilinoleylmethyl-4-dimethylaminobutyraat (D-Lin-MC3-DMA), het ioniseerbare lipide dat wordt gebruikt in de door de FDA goedgekeurde LNP-formulering, heeft bijvoorbeeld een pKa van 6,4417. Bij lage pH worden de aminegroepen op het ioniseerbare lipide geprotoneerd en positief geladen, waardoor de assemblage met negatief geladen fosfaatgroepen op mRNA en DNA mogelijk wordt. De verhouding van amine, "N", groepen tot fosfaat, "P", groepen wordt gebruikt om de assemblage te optimaliseren. De N/P-verhouding is afhankelijk van de gebruikte lipiden en nucleïnezuren, die varieert afhankelijk van de formulering18. Na de vorming kan de pH worden aangepast aan een neutrale of fysiologische pH om therapeutische toediening mogelijk te maken. Bij deze pH-waarden wordt het ioniseerbare lipide ook gedeprotoneerd, wat een neutrale oppervlaktelading aan de LNP verleent.

Het ioniseerbare lipide helpt ook bij endosomale ontsnapping19,20. LNP's ondergaan endocytose tijdens cellulaire opname en moeten worden vrijgegeven uit het endosoom om de mRNA-lading in het celcytoplasma of DNA-lading naar de kern af te leveren21. In het endosoom bevindt zich meestal een meer zure omgeving dan het extracellulaire medium, waardoor het ioniseerbare lipide positief geladenis 22,23. Het positief geladen ioniseerbare lipide kan interageren met negatieve ladingen op het endosomale lipidemembraan, wat destabilisatie van het endosoom kan veroorzaken waardoor de LNP en het nucleïnezuur vrijkomen. Verschillende ioniseerbare lipiden worden momenteel bestudeerd voor het verbeteren van de werkzaamheid van zowel LNP-distributie als endosomale ontsnapping14.

Andere typische componenten van een LNP zijn helperlipiden, zoals een fosfatidylcholine (PC) of fosfoethanolamine (PE) lipide. 1,2-Dioleoyl-sn-glycero-3-fosfoethanolamine (DOPE), 1,2-distearoyl-sn-glycero-3-fosfocholine (DSPC) en 1,2-dioleoyl-sn-glycero-3-fosfocholine (DOPC) zijn veelgebruikte helperlipiden24,25. Van DOPE is aangetoond dat het een omgekeerde hexagonale II (HII) fase vormt en de transfectie verbetert door membraanfusie26, terwijl van DSPC wordt gedacht dat het LNP's stabiliseert met zijn cilindrische geometrie27. Cholesterol wordt ook in de formulering opgenomen om de stijfheid van het membraan te verhogen, wat vervolgens helpt bij de stabiliteit van de LNP. Ten slotte is lipide-geconjugeerde polyethyleenglycol (PEG) opgenomen in de formulering om de nodige sterische barrière te bieden om te helpen bij de zelfassemblage van deeltjes27. PEG verbetert ook de opslagstabiliteit van LNP's door aggregatie te voorkomen. Bovendien wordt PEG vaak gebruikt als stealth-component en kan het de circulatietijd voor de LNP's verlengen. Dit attribuut kan echter ook uitdagingen opleveren voor de rekrutering van LNP's voor hepatocyten via een endogene targetingmechanisme aangedreven door apolipoproteïne E (ApoE)28. Studies hebben dus de acylketenlengte onderzocht voor diffusie van PEG uit de LNP, en vonden dat korte lengtes (C8-14) zich distantiëren van de LNP en meer vatbaar zijn voor ApoE-rekrutering in vergelijking met langere acyllengtes28. Verder is aangetoond dat de mate van verzadiging van de lipidestaart waarmee PEG is geconjugeerd, de weefselverdeling van LNP'sbeïnvloedt 29. Onlangs werd aangetoond dat Tween 20, een veelgebruikte oppervlakteactieve stof in biologische geneesmiddelformuleringen en een lange onverzadigde lipidestaart heeft, een hoge transfectie heeft in drainerende lymfeklieren in vergelijking met PEG-DSPE, die de spier op de injectieplaats grotendeels transfecteerde29. Deze parameter kan worden geoptimaliseerd om de gewenste LNP-biodistributie te bereiken.

Conventionele methoden voor het vormen van LNP's omvatten de dunnefilmhydratatiemethode en ethanolinjectiemethode27. Hoewel dit direct beschikbare technieken zijn, zijn ze ook arbeidsintensief, kunnen ze resulteren in een lage inkapselingsefficiëntie en zijn ze een uitdaging om op teschalen 27. Vooruitgang in mengtechnieken heeft geresulteerd in methoden die beter kunnen worden opgeschaald, terwijl meer uniforme deeltjes wordenontwikkeld 27. Deze methoden omvatten T-junctiemenging, gespreide visgraatmenging en microfluïdische hydrodynamische focus27. Elke methode heeft een unieke structuur, maar ze maken allemaal een snelle menging mogelijk van een waterige fase die het nucleïnezuur bevat met een organische fase die de lipidecomponenten bevat, wat resulteert in een hoge inkapseling van het nucleïnezuur27. In dit protocol wordt gebruik gemaakt van snel en gecontroleerd mengen door een microfluïdische cartridge, die het verspringende visgraatmengontwerp gebruikt. Dit protocol schetst de voorbereiding, assemblage en karakterisering van nucleïnezuur dat LNP's bevat.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Een schema van het totale proces is opgenomen in figuur 1.

1. Voorbereiding van buffers

OPMERKING: Steriele filtering van de buffers wordt hier sterk aanbevolen om deeltjes te verwijderen die de nucleïnezuur- en LNP-kwaliteit kunnen beïnvloeden.

  1. Fosfaat gebufferde zoutoplossing (PBS)
    1. Bereid 1x PBS met 8 mM Na2HPO4,2 mM KH2PO4, 137 mM NaCl en 2,7 mM KCl in nucleasevrij water en stel de pH in op 7,4.
    2. Steriliseer door vacuümfiltratie met behulp van een poriegroot filter van 0,22 μm.
  2. Citraat buffer
    1. Bereid citraatbuffer met 5 mM natriumcitraat, 5 mM citroenzuur en 150 mM natriumchloride in nucleasevrij water en pas aan tot pH 4,5.
    2. Steriliseer door vacuümfiltratie met behulp van een poriegroot filter van 0,22 μm.
      OPMERKING: Citraatbuffer hoeft alleen te worden voorbereid als mRNA het nucleïnezuur is dat in de LNP wordt ingekapseld. Als DNA wordt ingekapseld, sla dan 1.2 over en ga verder naar 1.3.
  3. Appelzuurbuffer
    1. Bereid een appelzuurbuffer voor met 20 mM appelzuur en 30 mM natriumchloride in nucleasevrij water en stel deze in op pH 3.0.
    2. Steriliseer door vacuümfiltratie met behulp van een poriegroot filter van 0,22 μm.
      OPMERKING: Appelzuurbuffer hoeft alleen te worden voorbereid als DNA het nucleïnezuur is dat in de LNP wordt ingekapseld. Sla 1,3 over als mRNA moet worden ingekapseld. Citraatbuffer wordt gebruikt voor mRNA-inkapseling, omdat de lagere pH van 3,0 met appelzuurbuffer kan leiden tot een verhoogde kans op mRNA-afbraak. Het protocol kan hier worden gepauzeerd.

2. Bereiding van lipidenmengsel

  1. Als voorraadlipiden in poedervorm zijn, oplos dan op in pure 200-proof ethanol.
  2. Bereken de vereiste mix van lipidecomponenten op basis van de gewenste molaire verhouding. Een molaire verhouding van 50:10:39:1 (ioniseerbare lipide:helper lipid:cholesterol:PEG) zal hier worden gebruikt als voorbeeld voor een totale lipideconcentratie van 10 mM. Tabel 1 toont de concentraties en volumes die nodig zijn voor elk van deze componenten.
    OPMERKING: Bij het berekenen van het volume dat nodig is om de lipidenmixconcentratie in ethanol (EtOH) voor de microfluïdische menger te bereiken, wordt rekening gehouden met het totale volume om ervoor te zorgen dat de toevoeging van EtOH de lipideconcentraties niet beïnvloedt. Een ioniseerbaar lipidevolume van 68,5 μL wordt bijvoorbeeld berekend door de 5 mM-concentratie in ethanol te vermenigvuldigen met een totaal lipidenmengselvolume van 533 μL en vervolgens te delen door de voorraadlipideconcentratie van 38,9 mM.
  3. Voeg de juiste hoeveelheid van elke lipidenvoorraadoplossing toe aan een glazen injectieflacon om componenten te mengen met intermitterende vortexing. Voeg 200 ethanol toe voor een totaal mengsel van 533 μL. Voor het voorbeeld in tabel 1is dit 254 μL ethanol.
    OPMERKING: Voor een enkele run om 1 ml LNP's te produceren, is 342,5 μL lipide-oplossing nodig. Dit komt door een 3:1 mix van waterig nucleïnezuur tot organische lipide-oplossing met wat volume weggegooid voor en na monsterverzameling. Een mix van 533 μL wordt gemaakt om te compenseren als overage.

3. Bereiding van nucleïnezuuroplossing

OPMERKING: De bereiding en hantering van nucleïnezuuroplossingen moet zoveel mogelijk in een steriele en RNase-vrije omgeving worden uitgevoerd. Werk waar mogelijk in een bioveiligheidskast met het nucleïnezuur.

  1. Bereken de N/P-ratio. De N/P-verhouding is het totale aantal ioniseerbare lipide-aminegroepen (N) tot het totale aantal negatief geladen nucleïnezuurfosfaatgroepen (P). N/P-ratio is vaak een parameter die kan worden geoptimaliseerd tijdens LNP-vorming. Volg de onderstaande stappen.
    1. Bereken het aantal N-eenheden met behulp van de onderstaande formule:
      figure-protocol-1
      OPMERKING: De ioniseerbare lipidenconcentratie(tabel 1)is 5 mM, wat overeenkomt met 5 x 10-6 mol / ml. Het vereiste lipide-injectievolume is 0,3425 ml. Als het aantal N-eenheden per molecuul bijvoorbeeld 1 is, met behulp van de bovenstaande vergelijking, zijn er 1,03 x 1018 N-eenheden in het lipidenmengsel.
    2. Bereken de P-eenheden voor de gewenste N/P-verhouding. Hier wordt bijvoorbeeld een N/P = 36 gebruikt.
      figure-protocol-2
  2. Bereken de benodigde nucleïnezuurconcentratie om 2,86 x 1016 P-eenheden te verkrijgen met behulp van de onderstaande vergelijking.
    figure-protocol-3
    Waarbij het aantal P-eenheden per basenpaar voor mRNA 1 is en DNA 2. Voor een mRNA met 1.200 basen is de hoeveelheid mRNA die nodig is voor een N/P = 36 3,96 x 10-11 mol.
  3. Bereken de massaconcentratie van mRNA die nodig is voor N/P = 36 met behulp van de onderstaande vergelijking.
    figure-protocol-4
    Het gemiddelde molecuulgewicht van een ribonucleotide monofosfaat eenheid is 322 g/mol30. Met 1.200 basen mRNA is het molecuulgewicht van het mRNA 386.400 g/mol. Het vereiste injectievolume van nucleïnezuuroplossing is 1,028 ml. De benodigde concentratie mRNA is dus 1,488x10-5 g/ml, wat 14,88 μg/ml is.
  4. Maak 1,5 ml van 14,88 μg/ml mRNA aan in citraatbuffer.
    OPMERKING: Wanneer DNA het nucleïnezuur ingekapseld zal zijn, gebruik dan appelzuurbuffer om de nucleïnezuuroplossing te maken.

4. Priming van de microfluïdische kanalen

OPMERKING: Dit protocol is aangepast aan de richtlijnen van de instrumentfabrikant.

  1. Voer de primingparameters in de instrumentsoftware in door op de juiste velden te klikken(tabel 2).
    OPMERKING: Een stroomverhouding van 3:1 en een debiet van 4-12 ml/min wordt aanbevolen27,31. Dit is optimaal gebleken in de hier gepresenteerde studies, evenals door de fabrikant. Dit kan worden gevarieerd als het van belang is voor de toepassing.
  2. Open het deksel van het instrument en plaats een microfluïdische patroon in het roterende blok.
  3. Trek ten minste 0,5 ml ethanol in een spuit van 1 ml en zorg ervoor dat er geen bellen of luchtspleten aan de punt van de spuit zitten. Plaats deze spuit in de rechteringlaat van de patroon.
  4. Vul een spuit van 3 ml met 1,5 ml waterige buffer (citraat voor RNA en appelzuur voor DNA), zodat er geen luchtbellen of openingen zijn. Plaats deze spuit in de linkerinlaat van de patroon.
  5. Plaats twee conische buizen van 15 ml in de cliphouders om als afvalcontainers te dienen.
  6. Klik op Uitvoeren in de instrumentsoftware om het mixen te starten en zorg ervoor dat de parameters correct worden ingevoerd.
  7. Wanneer het instrument stopt met primen, aangegeven door het onderste blauwe lampje dat wordt uitgeschakeld, opent u het deksel en gooit u de conische buizen en spuiten op de juiste manier weg.

5. LNP-vorming

OPMERKING: Dit protocol is aangepast aan de richtlijnen van de instrumentfabrikant.

  1. Update de software met de formuleringsparameters door op de juiste velden te klikken(tabel 2).
  2. Vul een spuit van 1 ml met het lipidenmengsel (bereid in stap 2). Verwijder eventuele luchtspleten of bubbels aan de punt van de spuit en steek de spuit in de rechterkant van de patroon.
  3. Trek de nucleïnezuuroplossing (bereid in stap 3) in een spuit van 3 ml, zodat er geen belletjes of luchtspleten in de punt van de spuit zitten. Steek de spuit in de linker inlaat van de patroon.
    OPMERKING: Volumes worden verstrekt om een 1 ml-oplossing van LNP's te maken. Dit instrument kan spuitformaten tot 10 ml bevatten en volumes kunnen dienovereenkomstig worden geschaald zonder invloed op het resultaat. Het maximale volume LNP's dat in één preparaat kan worden bereid, is 12 ml.
  4. Label een 15 ml RNase-vrije conische buis met de naam van het monster en steek in de linkerbuisclip. Plaats een conisch afval van 15 ml in de rechter buisclip.
  5. Sluit het deksel van het instrument en klik op Uitvoeren, nadat u de juiste invoer van parameters hebt bevestigd.
  6. Nadat het instrument klaar is met werken, gooit u de afvalcontainer en patroon op de juiste manier weg. Houd de conische buis met het LNP-monster.
  7. Verdun de LNP 5x met PBS om de ethanol te minimaliseren tot <5% (v/v).
    OPMERKING: Het is belangrijk om de LNP's zo snel mogelijk na microfluïdische menging in PBS te verdunnen om afbraak te voorkomen. Voer de verdunning altijd uit in een bioveiligheidskast en blijf werken in de bioveiligheidskast tijdens de bufferuitwisselingen.

6. Bufferuitwisseling

OPMERKING: Protocol voor het gebruik van ultra-centrifugefilters is aanwezig. Hoewel deze methode resulteert in een meer tijdsefficiënte uitwisseling van buffers, kan dialyse hier worden vervangen.

  1. Was een ultracentrifugefilter (poriegrootte van 100 kDa) met 2 ml PBS voor door gedurende 5 minuten te centrifugeren bij 1000 x g. Leeg de PBS in het onderste compartiment.
    OPMERKING: PBS wordt gekozen om de pH te verhogen tot 7,4 ± 0,2, wat fysiologisch relevant is en ertoe zal leiden dat het ioniseerbare lipide een neutrale lading heeft.
  2. Voeg verdunde LNP's toe aan het bovenste compartiment van het voorgewassen ultracentrifugefilter en centrifugeer gedurende 12 minuten bij 1000 x g.
  3. Gooi de doorstroom van het onderste compartiment weg. Voer nog twee wasbeurten uit door elke keer 5 ml PBS aan het ultracentrifugefilter toe te voegen. Centrifugeer op dezelfde parameters. Er is geen maximaal volume dat moet worden gehandhaafd.
    OPMERKING: Als er een opgeschaald volume LNP's is voorbereid, verhoogt u het volume PBS voor elke wasbeurt dienovereenkomstig. Als bijvoorbeeld 2 ml LNP's in één keer zijn bereid, wordt 10 ml PBS per wasbeurt voorgesteld.
  4. Pipetteer de LNP-oplossing een paar keer tegen de wanden van het ultracentrifugefilter om LNP-verlies te minimaliseren. Verwijder de LNP-oplossing uit het ultracentrifugefilter en bewaar in een nucleasevrije injectieflacon. Voeg indien nodig PBS toe om een eindvolume van de LNP-oplossing van 1 ml te bereiken.
  5. Filtreer indien nodig door een voorvochtig spuitfilter van 0,2 μm.
    OPMERKING: Het protocol kan hier worden gepauzeerd.

7. Meet de efficiëntie van de inkapseling

  1. Bereid een standaardcurve door 2-voudige seriële verdunningen van werknucleïnezuuroplossing in PBS te maken, beginnend met een hoogste concentratie van 500 ng/ml, en ten minste vijf verdunningen te maken. Gebruik PBS als een lege ruimte.
  2. Bereid de verdunningen van het LNP-monster voor. Verdun LNP-monsters met PBS om een geschatte theoretische concentratie te bereiken die rond het middelpunt van de standaardcurve ligt (bijv. ~ 250 ng / ml nucleïnezuur geschat op basis van de beginconcentratie).
  3. Bereid een oplossing van het RNA-kwantificeringsreagens (voor mRNA-metingen) voor met TritonX-100 om de LNP's te verstoren en de totale hoeveelheid nucleïnezuur binnen en buiten de LNP te meten. Deze oplossing bevat 0,5% (v/v) RNA-reagens, 0,4% (v/v) TritonX-100 en 99,1% (v/v) PBS.
  4. Bereid een oplossing van het reagens zonder TritonX-100 om de hoeveelheid nucleïnezuur te meten die niet in de LNP's is ingekapseld. Deze oplossing bevat 0,5% (v/v) RNA-reagens en 99,5% (v/v) PBS.
    OPMERKING: Als LNP's dubbelstrengs DNA (dsDNA), zoals plasmide-DNA, inkapselen, gebruik dan in plaats daarvan het dsDNA-reagens in 7.3 en 7.4, volgens dezelfde procedure.
  5. Laad in een 96-well zwarte fluorescentie-geschikte plaat ten minste vier replicaties van elk van de LNP- en nucleïnezuurstandaardoplossingen bereid in 7.1 en 7.2.
  6. Voeg aan de helft van de replicaties van normen en monsters een gelijk volume van het reagens toe dat TritonX-100 bevat. Dit zal de totale hoeveelheid nucleïnezuur kwantificeren.
  7. Voeg aan de resterende putten van normen en monsters een gelijk volume van het reagens toe zonder TritonX-100. Dit zal de hoeveelheid nucleïnezuur kwantificeren die niet is ingekapseld in de LNP.
  8. Schud de plaat gedurende 5 minuten bij kamertemperatuur om een grondige menging van normen en monsters met het toegevoegde reagens te garanderen, waarbij u voorzorgsmaatregelen neemt om blootstelling aan licht te voorkomen.
  9. Meet de fluorescentie met behulp van een microplaatlezer, met een excitatiegolflengte van 480 nm en een emissiegolflengte van 520 nm.
  10. Bereken de concentratie van nucleïnezuur buiten de LNP met behulp van de standaardcurve gemaakt met de toevoeging van het reagens zonder TritonX-100. Vermenigvuldig met de in 7.2 gebruikte verdunningsfactor.
  11. Bereken de concentratie van nucleïnezuur zowel binnen als buiten de LNP met behulp van de standaardcurve gemaakt met de toevoeging van het reagens dat TritonX-100 bevat. Vermenigvuldig met de in 7.2 gebruikte verdunningsfactor.
  12. Bereken de concentratie van nucleïnezuur binnenin door de concentratie nucleïnezuur buiten (berekend vanaf stap 7.10) af te trekken van de totale concentratie nucleïnezuur zowel binnen als buiten (berekend vanaf stap 7.11)
  13. Kwantificeer de inkapselingsefficiëntie uit de verhouding tussen de concentratie nucleïnezuur in de LNP (berekend vanaf stap 7.12) en de totale concentratie nucleïnezuur (berekend vanaf stap 7.11).
    OPMERKING: Het protocol kan hier worden gepauzeerd.

8. Concentratieaanpassingen

  1. Pas indien nodig de nucleïnezuurconcentratie in de LNP-oplossing aan met behulp van de resultaten van de inkapselingsefficiëntie.
  2. Als een minder geconcentreerde oplossing gewenst is, verdunt u de oplossing met PBS om de gewenste concentratie te bereiken.
  3. Als een meer geconcentreerde oplossing gewenst is, voert u extra centrifugatieruns uit met behulp van een ultracentrifugefilter.
    OPMERKING: Het protocol kan hier worden gepauzeerd.

9. Meet LNP hydrodynamische grootte en polydispersiteit

  1. Verdun een aliquot van de LNP-oplossing 40x met PBS om een eindvolume van 1 ml te verkrijgen.
    OPMERKING: Deze verdunning kan indien nodig worden gewijzigd. Deze verdunningswaarde wordt voorgesteld omdat deze een klein volume van de LNP-voorraadoplossing gebruikt en tegelijkertijd kwaliteitsresultaten oplevert.
  2. Meet met behulp van een semi-micro cuvette de hydrodynamische diameter en polydispersiteitsindex. Voeg de LNP-oplossing toe aan de cuvette en plaats deze in het instrument. Stel een bedieningsprocedure in de instrumentsoftware in om het meettype, de monsterdetails (materiaal, dispergeermiddel, temperatuur en celtype) en meetinstructies (aantal runs) op te nemen. Klik op Start wanneer u klaar bent om met de metingsacquisitie te beginnen.

10. Meet LNP zeta potentiaal

  1. Verdun een aliquot van de LNP-oplossing 40x met nucleasevrij water om een eindvolume van 1 ml te verkrijgen.
    OPMERKING: Nucleasevrij water wordt gebruikt als oplosmiddel voor zetapotentiaalmetingen om de invloed van hoge zoutbuffers op de geleidbaarheid te minimaliseren.
  2. Meet met behulp van een gevouwen capillaire zetacel de zetapotentiaal.
    1. Voeg de LNP-oplossing toe aan de cuvette tot aan de vullijn. Steek in het instrument om ervoor te zorgen dat de elektroden contact maken met het instrument.
    2. Stel een bedieningsprocedure in de instrumentsoftware in om het meettype, de monsterdetails (materiaal, dispergeermiddel, temperatuur en celtype) en meetinstructies (aantal runs) op te nemen. Klik op Start wanneer u klaar bent om met de metingsacquisitie te beginnen.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Resultaten

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Meerdere batches LNP's met dezelfde lipideformulering en N / P-verhouding van 6 werden op afzonderlijke dagen ontwikkeld om de reproduceerbaarheid van de techniek aan te tonen. Batch 1 en 2 resulteerden in overlappende grootteverdelingen met vergelijkbare polydispersiteit (Figuur 2A) Er werd geen significant verschil waargenomen in de grootte of inkapselingsefficiëntie tussen de twee verschillende batches (figuur 2B). De inkapsel...

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Discussie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Reproduceerbaarheid, snelheid en screening met een laag volume zijn belangrijke voordelen van het gebruik van microfluïdische menging om LNP's te vormen in vergelijking met andere bestaande methoden (bijv. Lipid film hydratatie en ethanolinjectie). We hebben de reproduceerbaarheid van deze methode aangetoond zonder impact op de inkapselingsefficiëntie of deeltjesgrootte waargenomen met verschillende LNP-batches. Dit is een essentieel criterium voor elk therapeutisch middel, inclusief LNP's, om klinisch beschikbaar te wor...

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Openbaarmakingen

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Alle auteurs zijn medewerkers van Sanofi. De auteurs verklaren dat ze geen belangenconflict of concurrerende financiële belangen hebben.

Dankbetuigingen

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Dank aan Atul Saluja, Yatin Gokarn, Maria-Teresa Peracchia, Walter Schwenger en Philip Zakas voor hun begeleiding en bijdragen aan de ontwikkeling van LNP.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel
NaamBedrijfCatalogusnummerOpmerkingen
1,2-dimyristoyl-rac-glycero-3-methoxypolyethylene glycol-2000 (C-14 PEG)Avanti Polar Lipids880151P
10 µl Graduated Filter Tips  (RNase-,DNase-, DNA-free)USA Scientific1121-3810
1000 µl Graduated Filter Tips (RNase-,DNase-, DNA-free)USA Scientific1111-2831
20 µl Beveled Filter Tips (RNase-,DNase-, DNA-free)USA Scientific1120-1810
200 µl Graudated Filter Tips (RNase-,DNase-, DNA-free)USA Scientific1120-8810
3β-Hydroxy-5-cholestene, 5-Cholesten-3β-ol (Cholesterol)Sigma-AldrichC8667
BD Slip Tip Sterile Syringes (1 ml syringe)Thermo Fisher Scientific14-823-434
BD Slip Tip Sterile Syringes (3 ml syringe)Thermo Fisher Scientific14-823-436
BD Vacutainer General Use Syringe Needles (BD Blunt Fill Needle 18G)Thermo Fisher Scientific23-021-020
Benchtop CentrifugeBeckman coulter
Black 96 well platesThermo Fisher Scientific14-245-177
BrandTech BRAND BIO-CERT RNase-, DNase-, DNA-free microcentrifuge tubes (1.5mL)Thermo Fisher Scientific14-380-813
Citric AcidFisher Scientific02-002-611
Corning 500ml Vacuum Filter/Storage Bottle System, 0.22 um poreCorning430769
Disposable folded capillary cellsMalvernDTS1070
Ethyl Alcohol, Pure 200 proofSigma-Aldrich459844
Fisher Brand Semi-Micro CuvetteThermo Fisher Scientific14955127
Invitrogen Conical Tubes (15 mL) (DNase-RNase-free)Thermo Fisher ScientificAM12500
MilliporeSigma Amicon Ultra Centrifugal Filter UnitsThermo Fisher ScientificUFC901024
NanoAssemblr BenchtopPrecision Nanyosystems
Nuclease-free waterThermo Fisher ScientificAM9930
Phosphate Buffered Saline (PBS)Thermo Fisher ScientificAM9624
Quant-iT PicoGreen dsDNA Assay KitThermo Fisher Scientific P7589
Quant-iT RiboGreen RNA Assay KitThermo Fisher ScientificR11490
Sodium ChlorideFisher Scientific02-004-036
Sodium Citrate, Dihydrate, granularFisher Scientific02-004-056
SpectraMax i3xMolecular Devices
Zetasizer NanoMalvern

Referenties

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Mitchell, M. J., Billingsley, M. M., Haley, R. M., Wechsler, M. E., Peppas, N. A., Langer, R., et al. Engineering precision nanoparticles for drug delivery. Nature Reviews Drug Discovery. , 1-24 (2020).
  2. Davis, M. E., Chen, Z., Shin, D. M. Nanoparticle therapeutics: an emerging treatment modality for cancer. Nanoscience and technology: A collection of reviews from nature journals. (239), 250(2010).
  3. Patra, J. K., Das, G., Fraceto, L. F., et al. Nano based drug delivery systems: recent developments and future prospects. J Nanobiotechnol. 16 (71), (2018).
  4. Rai, R., Alwani, S., Badea, I. Polymeric nanoparticles in gene therapy: New avenues of design and optimization for delivery applications. Polymers. 11 (4), 745(2019).
  5. Bailey, C. M., Nagarajan, R., Camesano, T. A. Designing polymer micelles of controlled size, stability, and functionality for siRNA delivery. ACS Symposium Series. 1271, 35-70 (2017).
  6. Yin, H., et al. Non-viral vectors for gene-based therapy. Nature Reviews Genetics. 15 (8), 541-555 (2014).
  7. Bailey-Hytholt, C. M., Nagarajan, R., Camesano, T. A. Förster resonance energy transfer probing of assembly and disassembly of short interfering RNA/Poly(ethylene glycol)-Poly-L-Lysine polyion complex micelles. Molecular Assemblies: Characterization and Applications. , 47-60 (2020).
  8. Puri, A., Loomis, K., Smith, B. Lipid-based nanoparticles as pharmaceutical drug carriers: from concepts to clinic. Crit Rev Ther Drug Carrier Syst. 26 (6), 523-580 (2009).
  9. Cullis, P. R., Hope, M. J. Lipid nanoparticle systems for enabling gene therapies. Molecular Therapy. 25 (7), 1467-1475 (2017).
  10. Munsell, E. V., Ross, N. L., Sullivan, M. O. Journey to the center of the cell: Current Nanocarrier design strategies targeting biopharmaceuticals to the cytoplasm an nucleus. Current Pharmaceutical Design. 22 (9), 1227-1244 (2016).
  11. Zhao, Y., Huang, L. Lipid nanoparticles for gene delivery. Advances in Genetics. 88, 13-36 (2014).
  12. Chen, S., et al. Influence of particle size on the in vivo potency of lipid nanoparticle formulations of siRNA. Journal of Controlled Release. 235, 236-244 (2016).
  13. Wan, C., Allen, T. M., Cullis, P. R. Lipid nanoparticle delivery systems for siRNA-based therapeutics. Drug Delivery and Translational Research. 4 (1), 74-83 (2014).
  14. Kulkarni, J. A., Cullis, P. R., Van Der Meel, R. Lipid nanoparticles enabling gene therapies: From concepts to clinical utility. Nucleic Acid Therapeutics. 28 (3), 146-157 (2018).
  15. Shin, M. D., et al. COVID-19 vaccine development and a potential nanomaterial path forward. Nature Nanotechnology. 15 (8), 646-655 (2020).
  16. Thanh Le, T., et al. The COVID-19 vaccine development landscape. Nature Reviews. Drug Discovery. 19 (5), 305-306 (2020).
  17. Tam, Y. Y. C., Chen, S., Cullis, P. R. Advances in lipid nanoparticles for siRNA delivery. Pharmaceutics. 5 (3), 498-507 (2013).
  18. Cayabyab, C., Brown, A., Tharmarajah, G., Thomas, A. mRNA lipid nanoparticles. Precision Nanosystems Application Note. , (2019).
  19. Gilleron, J., et al. Image-based analysis of lipid nanoparticle-mediated siRNA delivery, intracellular trafficking and endosomal escape. Nature Biotechnology. 31 (7), 638-646 (2013).
  20. Suzuki, Y., Ishihara, H. Structure, activity and uptake mechanism of siRNA-lipid nanoparticles with an asymmetric ionizable lipid. International Journal of Pharmaceutics. 510 (1), 350-358 (2016).
  21. Kowalski, P. S., Rudra, A., Miao, L., Anderson, D. G. Delivering the messenger: Advances in technologies for therapeutic mRNA delivery. Molecular Therapy. 27 (4), 710-728 (2019).
  22. Schmid, J. A. The acidic environment in endocytic compartments. Biochemical Journal. 303 (2), 679-680 (1994).
  23. Maugeri, M., et al. Linkage between endosomal escape of LNP-mRNA and loading into EVs for transport to other cells. Nature Communications. 10 (1), (2019).
  24. Kulkarni, J. A., Witzigmann, D., Leung, J., Tam, Y., Cullis, P. R. On the role of helper lipids in lipid nanoparticle formulations of siRNA. Nanoscale. (45), (2019).
  25. Hafez, I. M., Maurer, N., Cullis, P. R. On the mechanism whereby cationic lipids promote intracellular delivery of polynucleic acids. Gene Therapy. 8 (15), 1188-1196 (2001).
  26. Hafez, I. M., Culis, P. R. Roles of lipid polymorphism in intracellular delivery. Advanced Drug Delivery Reviews. 47 (2-3), 139-148 (2001).
  27. Evers, M. J. W., et al. State-of-the-art design and rapid-mixing production techniques of lipid nanoparticles for nucleic acid delivery. Small Methods. 2 (9), 1700375(2018).
  28. Mui, B. L., et al. Influence of polyethylene glycol lipid desorption rates on pharmacokinetics and pharmacodynamics of siRNA lipid nanoparticles. Molecular Therapy - Nucleic Acids. 2 (139), (2013).
  29. Zukancic, D., et al. The importance of poly(Ethylene glycol) and lipid structure in targeted gene delivery to lymph nodes by lipid nanoparticles. Pharmaceutics. 12 (11), 1-16 (2020).
  30. NEBioCalculator. New England BioLabs Inc. , Available from: https://nebiocalculator.neb.com/#!/formulas (2020).
  31. Kastner, E., et al. High-throughput manufacturing of size-tuned liposomes by a new microfluidics method using enhanced statistical tools for characterization. International Journal of Pharmaceutics. 477 (1-2), 361-368 (2014).
  32. Zhigaltsev, I. V., et al. Bottom-up design and synthesis of limit size lipid nanoparticle systems with aqueous and triglyceride cores using millisecond microfluidic mixing. Langmuir. 28 (7), 3633-3640 (2012).
  33. Belliveau, N. M., et al. Microfluidic synthesis of highly potent limit-size lipid nanoparticles for in vivo delivery of siRNA. Molecular Therapy - Nucleic Acids. 1 (8), 37(2012).
  34. Hassett, K. J., et al. Optimization of lipid nanoparticles for intramuscular administration of mRNA vaccines. Molecular Therapy - Nucleic Acids. 15, 1-11 (2019).
  35. Tanaka, H., et al. The delivery of mRNA to colon inflammatory lesions by lipid-nano-particles containing environmentally-sensitive lipid-like materials with oleic acid scaffolds. Heliyon. 4 (12), 00959(2018).
  36. Singh, J., et al. Nucleic acid lipid nanoparticles. Precision Nanosystems Application Note. , (2018).

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Herprints en machtigingen

Toestemming aanvragen om de tekst of afbeeldingen van dit JoVE-artikel te hergebruiken

Toestemming aanvragen

Trefwoorden

Inkapseling van nucle nezurenaflevering van messenger RNAaflevering van plasmide DNAdynamische lichtverstrooiingzetapotentiaalinkapselingseffici ntieniet virale genaflevering

Gerelateerde artikelen