Dit protocol biedt gedetailleerde richtlijnen voor de initiële en voortgezette generatie allotransplantatie van Drosophila-tumoren in de buik van volwassen gastheren voor het bestuderen van verschillende aspecten van neoplasie. Met behulp van een auto-injectorapparaat kunnen onderzoekers verbeterde efficiëntie en tumoropbrengsten bereiken in vergelijking met die bereikt door traditionele, handmatige methoden.
Een abonnement op JoVE is vereist om deze inhoud te bekijken. Log in of start vandaag met uw gratis proefperiode.
Methodenartikel
Tumor allotransplantatie in Drosophila melanogaster met een programmeerbare Auto-Nanoliter Injector
* These authors contributed equally
In dit artikel
Samenvatting
Samenvatting
Dit protocol beschrijft de allotransplantatie van tumoren in Drosophila melanogaster met behulp van een auto-nanoliter injectieapparaat. Met het gebruik van een autoinjectorapparaat kunnen getrainde operators efficiëntere en consistentere transplantatieresultaten bereiken in vergelijking met die verkregen met behulp van een handmatige injector. Hier behandelen we onderwerpen op een chronologische manier: van het kruisen van Drosophila-lijnen tot de inductie en dissectie van de primaire tumor, transplantatie van de primaire tumor in een nieuwe volwassen gastheer en voortgezette generatietransplantatie van de tumor voor uitgebreide studies. Als demonstratie gebruiken we hier Notch intracellulair domein (NICD) overexpressie geïnduceerde speekselklier imaginaire ringtumoren voor generatietransplantatie. Deze tumoren kunnen eerst betrouwbaar worden geïnduceerd in een micro-omgeving van de overgangszone binnen larvale speekselklier imaginaire ringen, vervolgens allografeerd en gekweekt in vivo om verdere tumorgroei, evolutie en metastase te bestuderen. Deze allotransplantatiemethode kan nuttig zijn in potentiële screeningsprogramma's voor geneesmiddelen, evenals voor het bestuderen van tumor-gastheerinteracties.
Inleiding
Dit protocol biedt een stapsgewijze begeleiding voor allotransplantatie van Drosophila larvale speekselklier (SG) imaginaire ringtumoren in buiken van volwassen gastheren met behulp van een auto-nanoliter injectieapparaat (bijv. Nanoject). Dit protocol geeft ook aanwijzingen voor de daaropvolgende re-allografatie van tumoren in nieuwe generaties volwassen gastheren, wat mogelijkheden biedt voor voortdurende longitudinale studie van tumorkenmerken, zoals tumorevolutie en tumor-gastheerinteracties. Het protocol kan ook worden toegepast op experimenten met het screenen van geneesmiddelen.
Deze methode is ontwikkeld om de werkzaamheid van het uitvoeren van tumor allotransplantatie in Drosophila te verbeteren met behulp van handmatige injectoren1, die vaak inconsistent zijn in hun zuig- en injectiekrachten, wat leidt tot suboptimale resultaten voor tumor allotransplantatie. Een autoinjectorapparaat zorgt voor een betere controle en kan resulteren in lagere vliegsterfte na allograft. Een getrainde operator kon een gastheeroverleving van meer dan 90% bereiken met de autoinjector, vergeleken met ongeveer 80% wanneer de handmatige injector werd gebruikt1. Het totale tumoracquisitiepercentage is 60% -80% op dag 8-12 post-allograft. De gemiddelde injectietijd is ook verbeterd van 30-40 s per vlieg met behulp van een handmatige injector tot 20-25 s per vlieg met behulp van de autoinjector.
Dit protocol is een van de eerste protocollen om het autoinjectorapparaat te gebruiken bij Drosophila tumor allotransplantatie. Een recente studie gebruikte ook de autoinjector voor allotransplantatie van tumorachtige neurale stamcellen2. Eerder werd het autoinjectorapparaat gebruikt in Drosophila om bacteriële virulentie3, parasitaire infecties en gastheerverdediging4 te bestuderen, evenals screening op bioactiviteit van verschillende verbindingen5. Ons protocol past het autoinjectorapparaat aan voor het gebruik van tumorinjecties en probeert Drosophila-onderzoekers een hogere kwaliteit en consistentere resultaten te bieden, terwijl ze veel tijd besparen. Dit protocol kan niet alleen worden gebruikt voor de allotransplantatie van tumoren, maar kan ook worden afgestemd op de allotransplantatie van wildtype en mutante weefsels van vergelijkbaar kaliber6.
De Drosophila NICD-tumor die in dit protocol wordt gebruikt, werd voor het eerst geïntroduceerd door Yang et al.7 in de SG imaginaire ringovergangszone, een "tumorhotspot" die hoge niveaus van endogene Janus Kinase / Signaaltransducer en Activators van Transcriptie (JAK-STAT) vertoont, en c-Jun N-terminal Kinase (JNK) activiteit. Bovendien heeft de overgangszone hoge niveaus van matrix metalloproteinase-1 (MMP1)7, waardoor dit gebied bijzonder bevorderlijk is voor tumorigenese. Notch pathway activatie door NICD overexpressie alleen is voldoende om consequent tumorvorming te initiëren. Deze tumoren kunnen vervolgens worden allotransplanteerd om onderzoek van een breed scala aan onderwerpen mogelijk te maken, waaronder tumorceldeling, invasie en tumor-gastheerinteracties.
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Protocol
1. Voorbereiding van SG imaginaire ringtumor
- Kruis volwassen vliegen met genotypen van UAS-NICD (Mannetje: 10-15 vliegen) en Act-Gal4, UAS-GFP / CyO; tub-Gal80ts (Virgin female: 10-15 vliegen) en laat ze 1 dag broeden bij 18 ° C. De geselecteerde volwassen vliegen moeten 5-9 dagen oud zijn om een hoge vruchtbaarheid te garanderen.
- Laat de volwassen vliegen eieren leggen in het vliegenvoer in injectieflacons gedurende 24 uur bij 18 °C en verwijder vervolgens de volwassen vliegen.
OPMERKING: Vliegenvoer wordt bereid met behulp van het standaard maïsmeelvoedselrecept van Drosophila Stock Center8. Elke injectieflacon moet ongeveer 10 ml vliegenvoer bevatten. - Laat de eieren 6 dagen uitbroeden bij 18 °C. Tijdens deze periode zullen de larven uitkomen.
- Breng de injectieflacons met larven over naar een incubator van 29 °C en incubeer nog eens 7 dagen.
OPMERKING: Deze incubatiestap is optioneel, afhankelijk van het specifieke experimentele ontwerp.
2. Bereiding van volwassen wild type Drosophila voor allotransplantatie
- Verdoof wilde of geschikte gemuteerde volwassen vliegen met 100% CO2 en sorteer vliegen op basis van geslachten. Zowel mannelijke als vrouwelijke vliegen kunnen worden gebruikt als tumorgastheren.
- Bevestig een 5 cm lang stuk vliegentape aan een microscoopglaasje met de kleverige kant naar boven door het te bevestigen met twee kleinere stukjes tape, één aan elk uiteinde.
- Immobiliseer de vliegen door hun vleugels aan de tape te hechten. Gebruik een tang tijdens het manoeuvreren van de vliegen.
- Herhaal de bovenstaande stap voor 60-80 volwassen vliegen die worden gebruikt als allograft-acceptanten.
OPMERKING: Het is het beste om vliegen in nette rijen te organiseren, met hun lichaamsas parallel aan elkaar uitgelijnd voor een tijdsefficiënter injectieproces later. Figuur 1 toont rijen gastheervliegen die op deze manier zijn afgeplakt.
- Herhaal de bovenstaande stap voor 60-80 volwassen vliegen die worden gebruikt als allograft-acceptanten.
3. Montage van het auto-injectorapparaat
- Sluit zowel het autoinjectorapparaat als het netsnoer aan op de controllerbox.
- Stel het injectievolume in op 59,8 nL. Dit zal helpen om de juiste hoeveelheid zuig- en injectiekrachten te behouden tijdens allotransplantatie.
- Plaats de controllerbox en de autoinjector aan weerszijden van de lichtmicroscoop.
OPMERKING: Voor rechtshandige operators moet de besturingskast aan de linkerkant van de microscoop worden geplaatst met de injector aan de rechterkant. Andersom voor linkshandige operators. - Bereid het 3,5'' glazen capillair voor gebruik voor door het gesloten uiteinde met een tang af te knippen.
- Verwerk het ene uiteinde van het glazen capillair met behulp van een viertraps micropipettetrekker en verwarm tot een smal, gesloten uiteinde met behulp van de volgende specificaties in het instrument: Warmte = 650, Kracht = 200 en Afstand = 8. Plaats de haarvaten netjes in het trekkerapparaat en voer het programma uit na het invoeren van de bovenstaande instellingen.
- Gebruik een tang om het capillair in een hoek van ongeveer 60° te klikken om een scherper uiteinde te maken voor gemakkelijke toegang tot de buikvan de volwassen vlieg 1. Zie figuur 2 voor een voorbeeld van een goed geknipt capillair.
- Schroef de dop van de injector lichtjes los. Houd de knop Leeg ingedrukt om de injectornaald vooruit te helpen totdat 70% -80% van de totale lengte wordt weergegeven. Om de capillaire vooruitgang te versnellen, drukt u eenmaal op de knop Vullen terwijl u tegelijkertijd de knop Leeg ingedrukt houdt.
- Gebruik een spuit om het glazen capillair te vullen met minerale olie. Steek vervolgens voorzichtig het glazen capillair op de injectornaald totdat de eerste stevig is bevestigd aan de rubberen stop van de injector. Schroef nu de injectordop strak.
- Veeg de minerale olieresten op het buitenoppervlak van de glazen capillaire afdekking om besmetting van het medium tijdens allotransplantatie te voorkomen.
4. Dissectie van de SG imaginaire ringtumor
- Selecteer een van de larven en breng deze over naar een dissectieplaat gevuld met 100 μL Schneider's Medium om zich voor te bereiden op SG imaginaire ringtumordissectie.
OPMERKING: Alleen de exemplaren die de tumor herbergen, blijven als larven over. Dit komt omdat tumorgroei de ontwikkeling en progressie van larven vertraagt9. Tweederde van de exemplaren zal de tumor niet herbergen en zal dus geëvolueerd zijn tot poppen/volwassenen.- Gebruik voor dissectie- en allotransplantatiedoeleinden een stereomicroscoop met een vergrotingsbereik van 10x-20x.
- Gebruik een tang om het middengedeelte van het larvale lichaam vast te houden, knijp de larvale kop met behulp van een ander paar tangen en oefen een rekkracht in de lengte aan.
- Lokaliseer de Y-vormige SG van de larven en isoleer deze van de rest van het larvale weefsel10.
- Ontleed en isoleer de SG imaginaire ringtumor door het aangrenzende weefsel te verwijderen. Zie figuur 3 voor een weergave van dit dissectieproces.
- Herhaal stap 4.1-4.4 voor nog eens 10 tot 20 SG imaginaire ringtumoren op basis van onderzoeksbehoeften.
5. Allograft van primaire SG imaginaire ringtumor
- Dompel het capillair onder in het Schneider's Medium met de primaire SG imaginaire ringtumoren. Houd de vulknop ingedrukt om het glazen capillair te vullen met Schneider's Medium helemaal tot aan het bovenste segment van 0,5 cm. Dit topsegment moet gevuld blijven met minerale olie.
OPMERKING: Versnel dit proces door eenmaal op de knop Leeg te drukken en tegelijkertijd de knop Vullen ingedrukt te houden. - Lokaliseer een primaire tumor en druk op de vulknop totdat de tumor in het capillair wordt gezogen.
- Zorg ervoor dat de tumor zich aan de punt van het capillair bevindt of enkele millimeters verwijderd van de punt van het capillair. Dit helpt voorkomen dat de tumor afdrijft en verloren gaat in de oplossing in het capillair. Zie figuur 4A voor een demonstratie van de juiste tumorlocatie zoals deze zich in het capillair bevindt.
- Lokaliseer een volwassen vlieg die is geïmmobiliseerd op de tape op de microscoopglaasje. Gebruik een tang om de onderbuik voorzichtig vast te houden. Doorboort vervolgens de onderste laterale cuticula van de buik met het capillair. Druk op de knop Leeg totdat de tumor de nieuwe buik van de gastheer binnendringt. Zie figuur 4B voor een demonstratie van deze techniek.
- Knijp met behulp van een tang voorzichtig de vleugels van de gastheer omhoog om deze van de tape te verwijderen. Plaats de hostie in een nieuwe injectieflacon met vers voedsel. Het is het beste om de injectieflacon zijwaarts te plaatsen gedurende de eerste 24 uur na injectie. Elke injectieflacon mag maximaal 20 vliegen bevatten.
OPMERKING: Sommige gastheervliegen hebben ontbrekende vleugels en andere wonden op hun lichaam na injectie en kunnen aan het vliegenvoedsel blijven plakken als de injectieflacon rechtop wordt geplaatst. - Herhaal stap 5.2 tot en met 5.4 om de resterende primaire tumoren te transplanteren in hun nieuwe volwassengastheren.
- Gooi haarvaten in de container van de scherpe voorwerpen en reinig de minerale olieresten van de buitenkant van de autoinjector voordat u het apparaat terug in de doos vervangt.
- Bewaar de injectieflacon met gastheren gedurende 1 dag bij kamertemperatuur en breng de injectieflacon vervolgens over naar een incubatiekamer bij 29 °C. Breng vlieghosts elke 2-3 dagen over naar nieuwe injectieflacons.
- Monitor de vlieghosts dagelijks en bereken overlevingskansen. Na een week moeten tumoren zichtbaar zijn onder een stereomicroscoop met fluorescentieadapter en kunnen ze voortdurend worden gecontroleerd op hun grootte en progressie.
6. Re-allograft van getransplanteerde tumoren
- Ongeveer 10-14 dagen na allograft, screenen op tumoren die in de buik van de gastheer zijn gegroeid met behulp van een fluorescentiemicroscoop.
- Verdoof een gastheer met CO2 en plaats deze in een dissectieplaat gevuld met 100 μL Schneider's Medium. Ontleed de gegroeide allografted tumor uit de gastheer met behulp van twee paar tangen.
- Gebruik een tang om de buik vast te houden en het andere paar om de buikschubben open te snijden, waardoor de allografted tumorwordt blootgesteld 1.
- Isoleer de tumor zorgvuldig zoveel mogelijk uit de aangehechte gastheerweefsels met behulp van fluorescentiemarkers als leidraad.
- Herhaal stap 6.2 om u voor te bereiden op twee tot drie extra gealgrepeerde tumoren.
- Breng de dissectieplaat met de geoogste tumoren over op het stadium van een lichtmicroscoop.
- Gebruik steriele naalden en ontleed de tumoren in kleinere stukjes die geschikt zijn voor de capillaire grootte.
- Herhaal stap 4.1-4.5 om de nieuwe generatie volwassen gastheren voor te bereiden en herhaal stap 5.1-5.7 om de allotransplantatie van de tumoren te voltooien.
OPMERKING: Succespercentages zijn over het algemeen hoger voor niet-primaire tumoren in vergelijking met die van primaire tumoren. - Herhaal stap 6.1-6.6 voor elke volgende generatie vliegen die in het onderzoek is gebruikt.
OPMERKING: Kies Drosophila-hostlijnen die geschikt zijn voor de experimentele behoeften.
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Resultaten
Hier voerden we generatie-allotransplantatie van SG-imaginaire ringtumoren uit met behulp van het nanoliter-injectieautoinjectorapparaat en voerden we daaropvolgende tumor live-imaging uit met een confocale laserscanmicroscoop, wat een diepere duik mogelijk maakte in onderwerpen van tumorgroei, tumorcelmigratie en tumor-gastheerinteracties. Bij het monteren van vliegen lijm je ze op een microscoopglaasje en houd je ze vast via een polydimethylsiloxaan (PDMS) blok11.
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Discussie
Tumor allotransplantatie kan onderzoekers helpen bij het aanpakken van bepaalde problemen die zich voordoen tijdens de groei en progressie van Drosophila-tumoren. Een van die uitdagingen is het omzeilen van voortijdige sterfgevallen van tumordragende larven of volwassenen tijdens primaire tumorkweek12. In deze context zorgt voortdurende tumorallotransplantatie ervoor dat tumoren voor onbepaalde tijd kunnen groeien, wat longitudinale studies van tumorgroei, metastase en evolutie vergemakke...
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Openbaarmakingen
Er zijn geen belangenconflicten te melden tussen de auteurs.
Dankbetuigingen
We bedanken de voormalige lableden Dr. Sheng-An Yang en de heer Juan-Martin Portilla voor hun bijdrage aan de ontwikkeling van dit protocol. We zijn dankbaar voor het laboratorium van Dr. Yan Song aan de Peking University School of Life Sciences voor het delen van hun protocol over handmatige allotransplantatie. We bedanken ook de heer Calder Ellsworth en de heer Everest Shapiro voor het kritisch lezen van het manuscript.
WMD ontving financiering (GM072562, CA224381, CA227789) voor dit werk van het National Institute of Health (https://www.nih.gov/) en financiering (IOS-155790) van de National Science Foundation (htps://nsf.gov/). De financiers hadden geen rol in studieontwerp, gegevensverzameling en -analyse, beslissing om te publiceren of voorbereiding van het manuscript.
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Materialen
| Naam | Bedrijf | Catalogusnummer | Opmerkingen |
|---|---|---|---|
| Confocal Laser Scanning Microscope | Zeiss | LSM 980 | Ook bekend als "Zeiss LSM 980" |
| Cornmeal Fly Food | Bloomington Drosophila Stock Center | N/A | Ook bekend als "BDSC Standard Cornmeal Food" |
| Dissection Needle (30Gx1/2) | BD PrecisionGlide | 305106 | |
| Dissection Plate | Fisher Scientific | 12-565B | |
| Fly Tape | Fisherbrand | 159015A | |
| Fluoresence Adapter voor Stero Microscoop | Electron Microscopy Sciences | SFA-UV | Ook bekend als "NightSea Fluorescence Adapter" |
| Fluoresence Microscoop | Zeiss | 495015-0001-000 | Ook bekend als "Zeiss Stereo Discovery.V8" |
| Forceps | Fine Science Tools | 11251-10 | Ook bekend als "Dumont #5 Forceps" |
| Glass Capillary (3.5'') | Drummond | 3-000-203-G/X | |
| Lijm | Elmer | E305 | Ook bekend als "Elmer Washabale Clear Glue" |
| Licht Microscoop | Zeiss | 435063-9010-100 | Ook bekend als "Zeiss Stemi 305" |
| Micropipet Puller | World Precision Instruments | PUL-1000 | Ook bekend als "Four Step Micropipette Puller" |
| Nanoject Apparaat | Drummond | 3-000-204 | Ook bekend als "Nanoject II Auto-Nanoliter Injector" |
| Schneider's Medium | ThermoFisher | 21720001 | |
| Spuit (27G x1/2) | BD PrecisionGlide | 305109 | |
| Flesje | Fisherbrand | AS507 |
Referenties
- Rossi, F., Gonzalez, C. Studying tumor growth in Drosophila using the tissue allograft method. Nature Protocols. 10 (10), 1525-1534 (2015).
- Magadi, S. S., et al. Dissecting Hes-centred transcriptional networks in neural stem cell maintenance and tumorigenesis in Drosophilia. Development. 147 (22), (2020).
- Haller, S., Limmer, S., Ferrandon, D. Pseudomonas Methods and Protocols. , Springer. 723-740 (2014).
- Letinić, B., Kemp, A., Christian, R., Koekemoer, L. Inoculation protocol for the African malaria vector, Anopheles arabiensis, by means of nano-injection. African Entomology. 26 (2), 422-428 (2018).
- Mejia, M., Heghinian, M. D., Busch, A., Marí, F., Godenschwege, T. A. Paired nanoinjection and electrophysiology assay to screen for bioactivity of compounds using the Drosophila melanogaster giant fiber system. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (62), e3597(2012).
- Miles, W. O., Dyson, N. J., Walker, J. A. Modeling tumor invasion and metastasis in Drosophila. Disease Models & Mechanisms. 4 (6), 753(2011).
- Yang, S. A., Portilla, J. M., Mihailovic, S., Huang, Y. C., Deng, W. M. Oncogenic notch triggers neoplastic tumorigenesis in a transition-zone-like tissue microenvironment. Developmental Cell. 49 (3), 461-472 (2019).
- Bloomington Drosophila Stock Center. BDSC Cornmeal Food. , (2020).
- Garelli, A., Gontijo, A. M., Miguela, V., Caparros, E., Dominguez, M. Imaginal discs secrete insulin-like peptide 8 to mediate plasticity of growth and maturation. Science. 336 (6081), 579-582 (2012).
- Kennison, J. A. Dissection of larval salivary glands and polytene chromosome preparation. CSH Protocols. 2008, (2008).
- Ji, H., Han, C. LarvaSPA, a method for mounting drosophila larva for long-term time-lapse imaging. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (156), (2020).
- Mirzoyan, Z., et al. Drosophila melanogaster: a model organism to study cancer. Frontiers in Genetics. 10, 51(2019).
- Bangi, E. Drosophila at the intersection of infection, inflammation, and cancer. Frontiers in Cellular and Infection Microbiology. 3, 103(2013).
- Saavedra, P., Perrimon, N. Drosophila as a model for tumor-induced organ wasting. Advances in Experimental Medicine and Biology. 1167, 191-205 (2019).
- Figueroa-Clarevega, A., Bilder, D. Malignant drosophila tumors interrupt insulin signaling to induce cachexia-like wasting. Developmental Cell. 33 (1), 47-55 (2015).
- Koyama, L. A. J., et al. Bellymount enables longitudinal, intravital imaging of abdominal organs and the gut microbiota in adult Drosophila. PLOS Biology. 18 (1), 3000567(2020).
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Herprints en machtigingen
