Een abonnement op JoVE is vereist om deze inhoud te bekijken. Log in of start vandaag met uw gratis proefperiode.

Methodenartikel

Activiteit van Posterior Lateral Line Afferent Neurons tijdens het zwemmen in Zebrafish

3.4K weergaven

⸱

DOI:

10.3791/62233

⸱

10 februari 2021

 , 
1Department of Biology, University of Florida, The Whitney Laboratory for Marine Bioscience

In dit artikel

Samenvatting

We beschrijven een protocol om veranderingen in de activiteit van het afferente neuron te volgen tijdens motorische commando's in een model gewerveld haarcelsysteem.

Samenvatting

Sensorische systemen verzamelen signalen die essentieel zijn voor het sturen van gedrag, maar dieren moeten ontcijferen welke informatie biologisch relevant is. Voortbeweging genereert reafferent signalen die dieren moeten ontwarren van relevante zintuiglijke signalen van de omgeving. Wanneer een vis bijvoorbeeld zwemt, wordt de stroom die wordt gegenereerd door lichaamsgolvingen gedetecteerd door de mechanoreceptieve neuromasten, bestaande uit haarcellen, die het laterale lijnsysteem vormen. De haarcellen sturen vervolgens vloeibare bewegingsinformatie van de sensor naar de hersenen via de sensorische afferente neuronen. Tegelijkertijd wordt de uitvloeiing van het motorcommando doorgegeven aan haarcellen om sensorische overbelasting te voorkomen. Het remmende effect van voorspellende motorische signalen tijdens de voortbeweging is daarom van cruciaal belang bij het evalueren van de gevoeligheid van het laterale lijnsysteem. We hebben een in vivo elektrofysiologische benadering ontwikkeld om tegelijkertijd posterieure laterale lijnafferente neuron en ventrale motorische wortelactiviteit bij zebravislarven (4-7 dagen na bevruchting) te monitoren die enkele uren kan duren. Extracellulaire opnames van afferent neuronen worden bereikt met behulp van de losse patch clamp techniek, die activiteit van enkele of meerdere neuronen kan detecteren. Ventrale wortelopnamen worden uitgevoerd door de huid met glazen elektroden om motorneuronactiviteit te detecteren. Ons experimentele protocol biedt het potentieel om endogene of opgeroepen veranderingen in sensorische input over motorisch gedrag te volgen in een intact, gewerveld gewerveld gedrag.

Inleiding

Afferent neuronen van mechanosensorische systemen verzenden informatie van haarcellen naar de hersenen tijdens het gehoor en evenwicht. Elektrofysiologie kan de gevoeligheid van afferente neuronen onthullen door middel van directe opnames. Hoewel hele celpatches van haarcellen een uitdaging kunnen zijn, is het opnemen van downstream afferente neuronen gemakkelijker en maakt het mogelijk om actiepotentiaal te beoordelen als reactie op gecontroleerde stimulaties1,2,3. Stimulerende haarcellen leiden tot hun afbuiging, die mechanosensorische structuren wijzigt, waardoor een toename van actiepotentiaal (spikes) in afferente neuronen4,5,6wordt geactiveerd . Bij afwezigheid van externe stimuli pieken afferente neuronen ook spontaan als gevolg van glutamaatlek uit de haarcellen op afferent post-synaptische terminals7,8, en is aangetoond dat ze bijdragen aan het handhaven van gevoeligheid9,10. Patchklemregistratie van afferente activiteit maakt observatie van haarcelgevoeligheid en signaaldynamiek mogelijk die niet mogelijk zijn met behulp van technieken met een lagere temporele resolutie, zoals in microfonica11,12 of functionele calciumbeeldvorming13,14,15. Het volgende protocol zal het mogelijk maken om afferente activiteit gelijktijdig met motorische commando's te registreren om onmiddellijke veranderingen in de gevoeligheid van haarcellen te onthullen.

Zebravissen (Danio rerio) gebruiken haarcellen in neuromasten die het laterale lijnsysteem samenstellen om waterbeweging ten opzichte van hun lichaam te detecteren, wat wordt vertaald in neurale signalen die essentieel zijn voor navigatie16,17,18,roofdiervermijding, prooivangst19,20en scholing21. De waterstroom kan ook zelf worden gegenereerd door de bewegingen van zwemmen22,23,24,ademhaling22,25,26en voeding27. Dit gedrag bestaat uit repetitieve bewegingen die haarcellen kunnen vermoeien en de gevoeligheid kunnen aantasten. Daarom is het van cruciaal belang dat het laterale lijnsysteem onderscheid maakt tussen externe (exafferent) en zelfgegenereerde (reafferent) stroomprikkels. Een uitvloeiing dempt zelfgegenereerde stroomsignalen tijdens voortbeweging bij zebravissen. Dit remmende voorspellende motorsignaal wordt via dalende neuronen doorgegeven aan de sensorische receptoren om de input te wijzigen of de verwerking van de reafferent feedback28,29te onderbreken . Baanbrekend werk dat bijdroeg aan ons vroege begrip van dit feedforward-systeem was gebaseerd op in vitro preparaten waarbij de connectiviteit en endogene activiteit van het neurale circuit niet werden gehandhaafd28,30,31,32,33,34,35. Dit protocol beschrijft een benadering van het behoud van een intact neuraal circuit waar endogene feedbackdynamiek wordt gehandhaafd, waardoor een beter begrip van de uitvloeiing in vivo mogelijk wordt.

Het hier geschetste protocol beschrijft hoe posterieure laterale lijn afferent neuron en motorneuron activiteit tegelijkertijd in larvale zebravissen te controleren. Het karakteriseren van afferente signaaldynamiek voor, tijdens en na motorische commando's geeft inzicht in real-time, endogene feedback van het centrale zenuwstelsel die de gevoeligheid van haarcellen tijdens de voortbeweging moduleert. Dit protocol beschrijft welke materialen voorafgaand aan experimenten moeten worden voorbereid en beschrijft vervolgens hoe zebravislarven kunnen worden verlamd en voorbereid. Het protocol zal beschrijven hoe een stabiele losse patchopname van afferent neuronen en extracellulaire ventrale wortel (VR) opnames van motorneuronen tot stand kan worden brengen. Representatieve gegevens die met behulp van dit protocol kunnen worden verkregen, worden gepresenteerd door een voorbeeldig individu en de analyse is uitgevoerd op meerdere replica's van het experimentele protocol. Voorverwerking van gegevens wordt uitgevoerd met behulp van aangepaste geschreven scripts in MATLAB. Over het algemeen is dit in vivo experimentele paradigma klaar om een beter begrip te geven van sensorische feedback tijdens voortbeweging in een model gewerveld haarcelsysteem.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Protocol

Alle dierverzorging en experimenten werden uitgevoerd in overeenstemming met protocollen die zijn goedgekeurd door het Institutional Animal Care and Use Committee van de Universiteit van Florida.

1. Voorbereiding van materialen voor elektrofysiologische opnamen

  1. Maak een opnameschaal met siliconen elastomeerbodem.
    1. Verdeel een dunne laag zelfmengende siliconen elastomeercomponenten (bijv. Sylgard) in een afdekvorm met glasbodem tot het niveau met de rand van ondiepe put. Ongeveer 0,5 ml is voldoende.
    2. Dek de schaal af en hard deze minimaal 48 uur uit bij kamertemperatuur.
  2. Maak dissectiepennen.
    1. Geef een negatieve lading (5 V) op een bekerglas van 100 ml etchant (3 M KOH) met behulp van een GELIJKSTROOM-voeding en sluit een wolfraamdraad (0,002 inch; 50,8 μm diameter) aan op de positief geladen uitgang.
      LET OP: Negatieve en positieve draden mogen tijdens deze procedure niet met elkaar in contact komen, omdat u het risico loopt vonken te produceren, wat een potentieel brandgevaar kan opleveren.
    2. Ets wolfraamdraad door snel en herhaaldelijk de punt van de draad in het etsbad te dompelen totdat de punt tot een scherp punt vernauwt. Snijd onder een stereomicroscoop de draad ongeveer 1 mm van de punt af met een scheermesje met rechte rand. Herhaal dit nog drie keer en steek vervolgens pinnen in de uitgeharde opnameschaal met behulp van een fijne tang.
  3. Bereid opnameelektroden voor.
    1. Trek een borosilicaat glazen capillaire buis (binnendiameter: 0,86 mm, buitendiameter: 1,50 mm) met behulp van een horizontale micropipettrekker met doosfilament in elektroden met een punt met een diameter van 30 μm met een lichte taps toelopend (figuur 1 Ai) die zal worden gebruikt om afferente neuronen van de achterste laterale lijn op te nemen.
    2. Trek een extra borosilicaatglas capillaire buis in een paar elektroden met kleinere tipdiameters (1-5 μm). Houd één elektrode in elke hand en laat de uiteinden voorzichtig over elkaar lopen om ze in een hoek van ~ 30 ° te breken. Polijst met behulp van een microsmederij de afgeschuinde punt glad. De uiteindelijke tipdiameter moet tussen 30-50 μm liggen en zal worden gebruikt als de ventrale wortel (VR) opname-elektrode (Figuur 1 Aii).
    3. Markeer de zijkant van de VR-elektrode met de voorrand met permanente inkt om de tipopening naar beneden te richten bij het plaatsen van de elektrode in de pipethouder van de koptrap (stap 3.2).
      OPMERKING: Mechanische modificatie van de VR-opname-elektrode is onnauwkeurig en stap 1.3.2 kan meerdere pogingen vereisen totdat een geschikte tipmorfologie is bereikt voordat het polijsten wordt bereikt. VR-opnameelektrode wordt afgeschuind om te voldoen aan de lichaamscurve van de larven. Eenmaal vervaardigd, kan de VR-opname-elektrode herhaaldelijk worden gebruikt, zolang de punt tussen de experimenten helder en schoon blijft.
  4. Genereer het protocol in elektrofysiologie opnameprogramma's.
    1. Zorg ervoor dat de rechter headstage is aangesloten op de Kanaal 1 ingang aan de achterkant van de microelectrode stroom- en spanningsklemversterker voor de afferent neuron opnames en de linker headstage is aangesloten op de Channel 2 ingang voor de VR opnames.
      OPMERKING: Computerspecificaties voor de stroom- en spanningsklemversterker vereisen minimaal 1 Ghz of een betere processor, Windows XP Pro of Mac OS X 10.46.6, cd-rom-station met 512 MB RAM, 500 MB ruimte op de harde schijf en 2 USB-poorten.
    2. Open de computergestuurde versterkersoftware.
    3. Stel kanaal 1 en kanaal 2 in op de huidige klemmodus door op de IC-knop voor elk kanaal te klikken.
    4. Voer de volgende parameters in onder zowel I-Clamp 1 als I-Clamp 2 tabs . Primaire uitgang: 100x AC membraanpotentiaal (100.000 mV/mV), versterking: 1.000, Bessel: 1 kHz , AC: 300 Hz , Bereik: Bypass . Secundaire output: 100x AC membraanpotentiaal (100 mV/mV), versterking:1 , lowpass-filter: 10 Hz.
    5. Sla kanaalparameters op als Ch1_Aff en Ch2_VR.
    6. Installeer en open de patch clamp elektrofysiologie software.
    7. Klik op Lab Bench configureren en selecteren om de analoge signalen in te stellen door Ch1_Aff en Ch2_Vr toe te voegen aan digitizerkanalen (bijv. analoge IN-#0 en analoge IN-#1)die via een BNC-coaxkabel zijn aangesloten op de overeenkomstige kanaal 1- en kanaal 2-geschaalde uitgangen van de versterker. Klik op OK.
      OPMERKING: De minimale computervereisten voor de digitizer zijn: een 1 Ghz of betere processor, Windows XP Pro of Mac OS X 10.46.6, cd-rom-station 512 MB RAM, 500 MB ruimte op de harde schijf en 2 USB-poorten.
    8. Klik op Acquire en selecteer Nieuw protocol.
    9. Selecteer Op het tabblad Modus/Tarief de optie Vrij van openingen. stel onder Acquisitiemodus de proeflengte in op Beschikbare schijfruimte gebruiken (d.w.z. opnemen tot gestopt) of een gewenste ingestelde duur (uu:mm:ss)en stel vervolgens de bemonsteringsfrequentie per signaal (Hz) in op 20.000 om de resolutie te maximaliseren.
    10. Selecteer onder het tabblad Ingangen de analoge IN-kanalen die eerder zijn geconfigureerd (in stap 1.4.6) en selecteer Ch1_Aff en Ch2_VR voor het bijbehorende kanaal.
    11. Selecteer onder het tabblad Uitgangen de optie Cmd 0 en Cmd 1 voor respectievelijk Kanaal #0 en Kanaal #1.
      1. Sluit kanaal 1-opdracht op de versterker aan op analoge ouput 0 op de digitizer via BNC-coaxkabel en herhaal voor kanaal 2 Command op analoge uitgang 1.
    12. De overige tabbladen kunnen onder de standaardinstellingen blijven staan. Klik op OK en sla het protocol op.

2. Oplossingsvoorbereiding

  1. Bereid hank's oplossing voor: 137 mM NaCL, 5,4 mM KCl, 0,25 mM Na2HPO4,0,44 mM KH2PO4,1,3 mM CaCl2,1,0 mM MgSO4,4,2 mM NaHCO4; pH 7,3. Verdun tot 10% Hank's oplossing door het juiste volume gedeioneerd water aan de bouillon toe te voegen.
  2. Bereid extracellulaire oplossing voor: 134 mM NaCl, 2,9 mM KCl, 1,2 mM MgCl2,2,1 mM CaCl2,10 mM glucose, 10 mM HEPES-buffer; pH 7,8 aangepast met NaOH. Vacuümfilter extracellulaire oplossing door het filter met een poriegrootte van 0,22 μm.
  3. Bereid α -bungarotoxine: Los 1 mg gevlyfiliseerd α-bungarotoxine op in 10 ml extracellulaire oplossing om 0,1% verdunning te produceren.
  4. Bereid euthanasieoplossing voor: 50% (mg/L) gebufferd ms-222 van farmaceutische kwaliteit in 10% Hanks oplossing.
    LET OP: α-bungarotoxine is een krachtig neurotoxine dat spieren verlamt door cholinerge receptoren te blokkeren. Handschoenen zijn vereist en oogbescherming wordt aanbevolen tijdens het hanteren van de verlamming.

3. Bereiding van larven voor elektrofysiologische opnames

  1. Immobiliseer zebravislarven.
    1. Gebruik larven uit de in het laboratorium gefokte populatie zebravissen(Danio rerio; 4-7 dagen na de bevruchting) en huis in embryo-oplossing (10% Hank's oplossing) bij 27 °C.
    2. Breng de larve van de behuizing over in een kleine Petrischaal (35 mm) met behulp van een grote transferpipet en verwijder zoveel mogelijk van de omringende oplossing.
      OPMERKING: Verwijdering van de embryooplossing voorkomt verdunning van de verlamming en verhoogt de werkzaamheid ervan. De hoek van een taakdoekje kan worden gebruikt om de resterende embryo-oplossing weg te voeren, en het is van cruciaal belang om geen contact te maken met de larven of larven bloot te stellen aan lucht.
    3. Dompel larven gedurende ongeveer 5 minuten onder in 10 μL van 0,1% α-bungarotoxine.
      OPMERKING: De tijd die nodig is om larven te immobiliseren varieert tussen de preparaten. Een gezond preparaat hangt af van nauwlettend toezicht op aanhoudende snelle bloedstroom en verminderde motorische reacties. Korte overbelichting van de verlamming kan leiden tot een langzame afname van de algehele gezondheid van het preparaat, zelfs na een grondige washout. Het is het beste om een wasbeurt aan te brengen voordat de larve volledig geïmmobiliseerd is, terwijl deze nog steeds tekenen van subtiele spiertrillingen vertoont.
    4. Was verlamde larve met extracellulaire oplossing en baad gedurende 10 minuten.
      OPMERKING: De washout zorgt ervoor dat de larve kan overgaan van subtiele spiertrillingen naar volledige verlamming. Ook is α-bungarotoxine een antagonist van de nicotinehoudende acetylcholinereceptor (nAChR) α9-subeenheid, die een essentieel onderdeel is van het endogene feedbackcircuit dat dit protocol waarneemt; echter, dit effect is aangetoond omkeerbaar in Xenopus en zebravis haarcellen na een 10 min washout36,29.
  2. Speld vis in de opnameschaal.
    OPMERKING: Anesthesie (bijv. MS-222, Tricaine) is niet nodig tijdens het bereiden van larvale zebravissen (4-7 dpf) omdat het de diergezondheid verstoort. In feite zijn larvale zebravissen vrijgesteld van bepaalde gewervelde protocollen.
    1. Verplaats de larve met behulp van de transferpipet van het bad met extracellulaire oplossing naar de opnameschaal met siliconenbodem. Vul de rest van de schaal met extracellulaire oplossing.
    2. Plaats onder een stereomicroscoop de larven voorzichtig met een fijn getipte tang boven het midden van de siliconenmat, zijwaarts naar boven, waarbij de voorste en achterste uiteinden van het lichaam respectievelijk van links naar rechts lopen. Pak vervolgens een geëtste pin van de siliconenmat met behulp van een tang met fijne punt en steek de pin, orthogonaal in de siliconen, door de dorsale notochord van de larven direct dorsaal naar de anus. Steek de tweede pen door de notochord aan het einde van de staart en steek de derde pen door de notochord dorsale van de gasblaas (Figuur 1B).
      OPMERKING: Bij het plaatsen van pinnen is het belangrijk om het midden van de notochordbreedte te richten om te voorkomen dat de bloedstroom wordt belemmerd of het omliggende spierstelsel wordt beschadigd. De notochord is dorsaal aan de achterste laterale lijnzenuw, dus met de juiste pinning wordt geen schade verwacht aan de laterale lijn sensorische neuronen. Breng na het eerste contact in om het omliggende weefsel niet te verstoren. Idealiter is de diameter van de pin minder dan de helft van de breedte van de notochord om een schone invoeging te garanderen. Als de pinnen deze breedte overschrijden, herhaalt u stap 1.2 totdat de gewenste penbreedte is bereikt. Als de bloedstroom na het vastzetten vertraagt, herhaal dit dan vanaf stap 1.3 met een nieuw monster.
    3. Steek de vierde pen door het blaasje terwijl u een lichte rotatie naar de voorste plaats geeft terwijl de pen in het inkapselingsmiddel wordt geplaatst (afbeelding 1B). Als een lichte rotatie wordt toegepast, kijk uit voor het weefsel tussen het cleithrum en het otic blaasje om de cluster van afferent somata te onthullen.
      OPMERKING: Schuine invoeging van de vierde pen is om de blootstelling van de achterste laterale lijn afferent ganglion, die anders wordt belemmerd door het grote otic blaasje te garanderen.

4. Ventrale root opname

  1. Plaats de vastgepinde larve onder het 10x wateronderdompelingsdoel op een rechtopstaande microscoop (Fixed Stage Differential Interference Contrast) en oriënteer de myseptale kloven van de spierblokken evenwijdig aan de linker headstage approach vector (Figuur 1B).
    1. Een DIC-microscoop met vaste trap die op een optische luchttafel zweeft, werkt het beste om te voorkomen dat trillingen de opnamen verstoren. Met behulp van een gemotoriseerde positioner kan de microscoop zich vervolgens vrij bewegen rond het vaste stadium waarin de voorbereiding en de headstages zijn gemonteerd (figuur 1C).
    2. Plaats de aardingsdraad in de badoplossing en zorg ervoor dat deze is aangesloten op de linker headstage.
  2. Vul de VR-opname-elektrode met 30 μL extracellulaire oplossing met behulp van een flexibele pipettip voor gelbelasting en plaats deze in de linker headstage pipethouder.
  3. Laat de opnamepipet in de schoteloplossing zakken met een micromanipulator terwijl u een positieve druk (1-2 mmHg) uitoefent die door een pneumatische transducer wordt geproduceerd. Controleer onder 10x vergroting of de richting van de tipopening naar beneden is gericht.
    1. De pneumatische transducer moet via siliconenslangen op de poort van de pipethouder worden aangesloten.
  4. Plaats de VR-elektrode op het myoseptum
    1. Laat de VR-elektrodetip met behulp van de micromanipulator zakken totdat deze boven de larve staat. Verhoog de vergroting tot 40x onderdompeling.
    2. Breng de elektrodepunt over een myoseptum tussen twee myomeren ventrale naar de laterale lijn totdat de spleet is gecentreerd in de VR-elektrode tip opening (Figuur 1D).
    3. Laat de pipet zakken totdat de achterblijvende rand van de puntopening voorzichtig in contact komt met het epitheel. Manoeuvreer de pipet na het eerste contact diagonaal om ervoor te zorgen dat de voorrand contact maakt en een afdichting kan genereren.
    4. Oefen negatieve druk (~100 mm Hg) uit met de pneumatische transducer en houd vast.
      OPMERKING: Een goede oriëntatie van de VR-pipet ten opzichte van het myoseptum en continue negatieve druk optimaliseert het detecteren van motorneuronactiviteit met een hoge signaal-ruisverhouding door de huid.
  5. Detecteer motorneuronactiviteit.
    1. De linker headstage moet worden aangesloten op de versterker, die het versterkte signaal doorgeeft aan een digitizer die het genoemde signaal uitvoert in de elektrofysiologiesoftware van de patchklem die op een aangrenzende computer moet worden bewaakt (zie punt 1.4).
    2. Klik in de patchklemsoftware op de play-knop op de gereedschapsbalk om het VR-signaal te bewaken (Afbeelding 1E).
    3. Zorg ervoor dat de VR-opname wordt bereikt zodra motorneuronactiviteit met goed stereotiepe burst-signaaldynamiek wordt waargenomen29,37 (Figuur 1E).
      OPMERKING: Fictieve zwemperioden zijn de activiteitspatronen van de VR-motorneuronen die blijven overbrengen ondanks dat het preparaat verlamd is. Daarom zijn fictieve zwemmen een toegankelijk middel om de gedragstoestand van het dier te bepalen en motorische parameters te meten, terwijl tegelijkertijd afferent neuronopnamen worden uitgevoerd die een geïmmobiliseerd preparaat vereisen. In onze handen, zodra een VR-opname is bereikt, zal een gezonde voorbereiding om de paar seconden vrijwillige fictieve zwemperiodes uitlokken. Vergeet niet dat een gezond preparaat een snelle bloedstroom heeft. Houd er rekening mee dat het verkrijgen van een voldoende VR-signaal enkele minuten kan duren en dat de signaal-ruisverhouding kan verbeteren na de eerste detectie. In het belang van de tijd is het aanvaardbaar om verder te gaan met sectie 5.
    4. Als een VR-opname na het voltooien van sectie 5 nog steeds niet wordt bereikt, laat dan de negatieve druk los, verhoog de elektrode en herhaal vanaf stap 4.4.2 verder op een ander myoseptum als de gezondheid van de larve nog steeds optimaal is.

5. Afferent neuron opname

  1. Vul de afferente opname-elektrode met 30 μL extracellulaire oplossing; steek in de rechter pipethouder(afbeelding 1B,C)en laat deze in de schoteloplossing zakken terwijl u een positieve druk uitoefent (1-2 mm Hg) geproduceerd door een pneumatische transducer.
  2. Zoek en bevestig losjes aan achterste laterale lijn afferent ganglion.
    1. Laat met behulp van een micromanipulator de tip van de afferente elektrode zakken totdat deze boven het hakbeen staat.
    2. Verhoog de vergroting tot 40x onderdompeling en lokaliseer het snijpunt van de achterste laterale lijnzenuw en het cleithrum. Volg de laterale lijn zenuw anterieure van het cleithrum naar waar de vezels innervate de posterieure laterale lijn afferent ganglion, te onderscheiden door de discrete cluster van soma (Figuur 1F).
    3. Breng de elektrodepunt over het afferente ganglion en laat de pipet zakken totdat de punt in contact komt met het epitheel. Manoeuvreer de elektrode voorzichtig zodat de hele tipomtrek in contact komt met het afferent ganglion.
    4. Oefen negatieve druk (20-50 mm Hg) uit met de pneumatische transducer en houd vast.
      OPMERKING: De negatieve druk die op het afferent ganglion wordt uitgeoefend, is zachter dan de zuigkracht die wordt uitgeoefend tijdens de ventrale wortelopname. Toenemende negatieve druk kan signaal-ruis verbeteren, maar de gezondheid van afferent neuronen neemt af onder aanhoudende agressieve zuiging, wat de kans op een succesvolle opname vermindert.
  3. Neem afferente neuron activiteit op.
    1. Zorg ervoor dat de rechter headstage is aangesloten in een vergelijkbare volgorde als beschreven in stap 4.5.1.
    2. Klik in pClamp10 op de play-knop op de gereedschapsbalk om tegelijkertijd een afferent neuron en VR-signaal te volgen.
    3. Zorg ervoor dat de hele cel, losse patchopname van afferente neuronen wordt bereikt zodra spikes spontaan optreden, ongeveer elke 100-200 ms1,29 (Figuur 1E).
    4. Verhoog geleidelijk de afferent neuron opname elektrodedruk terug naar atmosferisch (0 mm Hg) en houd voor de rest van de opname.

6. Gegevensverwerving

  1. Gelijktijdige opname.
    1. Zodra afferent neuron en motor neuron activiteit zijn beide gedetecteerd, klik op de record knop op de werkbalk in pClamp10 om gelijktijdige gap vrije opnames in beide kanalen vast te leggen.
    2. Record voor de gewenste duur (Figuur 1E).
      OPMERKING: Een opname in een gezonde voorbereiding kan vele uren duren en reageert op externe stimuli.
    3. Sla de opname op als een ondersteund bestandstype (.abf, pClamp10) om metagegevens zoals acquisitieparameters te behouden.

7. Euthanasie

  1. Oefen positieve druk (10 mm Hg) uit op zowel afferent- als VR-opnameelektroden met pneumatische transducers en til de elektroden uit de opnameschaal met behulp van de micromanipulatoren.
  2. Breng de opnameschotel over van de DIC-microscoop in een vast stadium naar de dissectiesterenamoscoop.
  3. Verwijder met behulp van een fijne tip pinps wolfraampennen uit notochord en otic capsule, en breng de larven met behulp van een transfer pipet in een Petri schaal (35 mm) met 5 ml euthanasie oplossing voor een minimum van 5 minuten.

8. Voorverwerking en gegevensanalyse

OPMERKING: Voor de voorverwerking en analyse van gegevens is een basiskennis van de codering van de opdrachtregel vereist.

  1. Converteer het opnamebestand voor voorbewerking.
    1. Installeer de Matlab software.
    2. Download het aangepaste geschreven script, abfload.m38 en sla het bestand op in dezelfde map waarin het onbewerkte opnamebestand wordt opgeslagen.
    3. Open in het matlab editor-venster abfload.m en klik op Uitvoeren op de gereedschapsbalk. Selecteer Map wijzigen, indien daarom wordt gevraagd.
    4. Voer de functie uit in het opdrachtvenster met het onbewerkte opnamebestand als invoer,
      > [d,si,h] = abfload('[bestandsnaam raw-opname].abf')
      en sla de uitvoerwerkruimte op met een bestandsnaam die de aanduiding van de larve, de leeftijd en de experimentele datum bevat, zoals [specimennummer]_[leeftijd in dpf]_[bestandsnaam voor onbewerkte opname (inclusief standaard experimentele datum)].
      OPMERKING: De geconverteerde bestandsnaam mag alleen onderstrepingstekens van afgebakende gehele getallen bevatten.
  2. Voer gegevensvoorverwerking uit.
    1. Download Matlab script AffVR_preprocess.m en bijbehorende functies, op maat geschreven door de auteurs.
    2. Open AffVR_preprocess.m in het venster Editor.
    3. Pas onder Variabelende ondergrensdrempels voor spikedetectie aan voor zowel afferent- als VR-opnamen(respectievelijk spk_detect_lb en vr_detect_lb,lijnen 8 en 14), afhankelijk van de opname van de signaal-ruisverhouding.
      OPMERKING: Spikedetectie is afhankelijk van handmatige drempels om signalen van meer dan één afferente neuron per amplitude te sorteren en te isoleren. Basisgeluid en activiteit van andere eenheden worden gefilterd door drempels om alleen piekamplitudes op te nemen binnen een percentage (bijv. spk_detect_lb) van het maximum (bijv. spk_detect_ub). Drempels zorgen ook voor nauwkeurige binning van motorische activiteit spikes in uitbarstingen en collectieve fictieve zwemperiodes. Begin over het algemeen met een drempel ondergrens van 0,5 en neem geleidelijk af totdat nauwkeurige detectie is bereikt. Als u bijvoorbeeld spk_detect_lb instelt als 0,5 en spk_detect_ub als 1,0, worden alle pieken gedetecteerd die gelijk zijn aan of groter zijn dan 50% van het maximale piekamplitude en worden ruis of extra neuronen met lagere spikeamplitudes uitgesloten (figuur 2A). Als alternatief zou men ook de spk_detect_ub van 1,0 kunnen verlagen om neuronen van hogere spike-amplitudes uit te sluiten om de neuronen van lagere spike-amplitudes te isoleren. Voorbewerkingscijferuitgangen (zie stap 7.2.6) geven aan of aanpassingen en herhaling vanaf stap 7.2.2 noodzakelijk zijn.
    4. Klik in het venster Editor op Uitvoeren om AffVR_preprocess.m uit te voeren.
    5. Navigeer naar het eerder geconverteerde .mat-gegevensbestand (zie stap 7.1.3); selecteer en klik op Openen om te beginnen met geautomatiseerde voorbewerking.
      OPMERKING: Terwijl het aangepaste script wordt uitgevoerd, worden uitvoer uitgevoerd in het opdrachtvenster om de voortgang ervan te informeren via verwerkingsstappen zoals "gegevens filteren ...", "ventrale hoofdactiviteit detecteren ...", en "cijfers genereren ...".
    6. Cijfers gegenereerd door AffVR_preprocess.m zullen een afferent spike en VR-detectie visualiseren en aangeven of analysevariabelen moeten worden aangepast (Figuur 2).
    7. Voer "Y" in op het toetsenbord om vooraf verwerkte metagegevens op te slaan in een preprocess_output map.
    8. Voorbewerkte gegevens worden automatisch uitgevoerd als data_out.xls.
  3. Analyseer de voorbewerkte gegevens naar wens.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Resultaten

Nadat zebravislarven goed zijn geïmmobiliseerd en de achterste laterale lijn afferent ganglion en VR-opname is bereikt, kan activiteit in zowel afferent- als motorneuronen tegelijkertijd worden gemeten. Opnamekanalen worden weergegeven met behulp van gap-free opnameprotocollen (stap 1.4) voor continue monitoring van afferent- en VR-activiteit. In real-time kan een afname van de spontane afferente spikesnelheid gelijktijdig met VR-activiteit worden waargenomen die wijst op fictieve zwemperioden (Figuu...

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Discussie

Het beschreven experimentele protocol biedt het potentieel om endogene veranderingen in sensorische input over motorisch gedrag te monitoren in een intact, gewerveld gewerveld gedrag. In het bijzonder beschrijft het een in vivo benadering van het uitvoeren van gelijktijdige extracellulaire opnames van laterale lijnafferente neuronen en ventrale motorwortels bij larvale zebravissen. Spontane afferente activiteit werd eerder gekarakteriseerd bij zebravissen zonder rekening te houden met potentiële gelijktijdige motorische ...

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Openbaarmakingen

De auteurs verklaren geen concurrerende financiële belangen.

Dankbetuigingen

We erkennen dankbaar de steun van het National Institute of Health (DC010809), National Science Foundation (IOS1257150, 1856237) en het Whitney Laboratory for Marine Biosciences aan J.C.L. We willen voormalige en huidige leden van het Liao Lab bedanken voor het stimuleren van discussies.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel
NaamBedrijfCatalogusnummerOpmerkingen
100 mL bekerPYREX1000receptakel voor etser
10x waterimmersie objectiefOlympusUMPLFLN10xWlage vergroting voor het positioneren van larven en het opnemen van elektrode
40x waterimmersie objectiefOlympusLUMPLFLN40XWhogere vergroting voor het positioneren van de elektrodetip en het vaststellen van patch-clamp
abfload.maanvullend coderingsbestandop maat geschreven MATLAB-script voor het converteren van ruwe elektrofysiologische opnames naar.mat-bestanden
AffVR_preprocess.maanvullend coderingsbestandop maat geschreven MATLAB-script voor het voorverwerken van opnamegegevens
BNC-coaxiale kabelsThorLabs2249-C-12verbindt versterker- en digitalisatorkanalen; vereist 4
borosilicaatglazen capillairen met filamentWarner InstrumentsG150F-3binnendiameter: 0,86, buitendiameter: 1,50; capillair glas wordt gebruikt om opname-elektroden te vormen
burst_detectaanvullend coderingsbestandop maat geschreven MATLAB-functie die nodig is om AffVR_preprocess.m uit te voeren
computerN/AN/Aelke computer zou moeten werken
DC-voedingTenma72-420gebruikt voor het elektrisch etsen van dissectienelden
elektrofysiologie-digitalisatorAxon Instruments, Molecular DevicesAxon DigiData 1440Amaakt het verzamelen van patch-clamp-gegevens mogelijk
filamentSutter Instrument CompanyFB255B2,5 mm box filament gebruikt in micropipet-puller
fijne pincetFine Science ToolsDumont #5 (0,05 x 0,02 mm) Artikelnr. 11295-10gebruikt om larven te manipuleren en pinnen te plaatsen
vaste stage DIC-microscoopOlympusBX51WImicroscoop die wordt gebruikt om patch-clamp-opnames te visualiseren en vast te stellen
flexibele, versmallende pipettipFisher Scientific02-707-169flexibele tips maken inbrenging in opname-elektrode mogelijk om extracellulaire oplossing aan de punt af te geven
FluoroDishWorld Precision Instruments Inc.FD3510-100dekglas met glazen bodem opnamebakje
KimWipeKimTech34155takendoekje gebruikt voor het wegwiken van overtollig vocht van larven
Kwik-GardWorld Precision Instruments Inc.710172zelfmengende sylgard-elastomeer
MATLABMathWorksR2020bopdrachtregelsoftware voor het voorverwerken van gegevens
micro-elektrode versterkerAxon Instruments, Molecular DevicesMultiClamp 700Bpatch clamp versterker voor dual kanaal opnames
microsmeltovenNarishigeMF-830 microsmeltovenom opname-elektrode te polijsten
micromanipulator besturingseenheidSiskiyouMC1000-eR/T4-assige draaiknopcoördinator voor het besturen van micromanipulator
micropipet-pullerSutter Instrument CompanyFlaming/Brown P-97voor het trekken van capillair glas in opname-elektroden
microscoop besturingseenheidSiskiyouMC1000eplaatst de microscoop rond de vaste stage en voorbereiding
gemotoriseerde micromanipulatorSiskiyouMX7600plaatst de headstage en bevestigde opname-elektrode voor patch-clamp-opname
MultiClamp CommanderMolecular Devices2.2.2te downloaden vanaf de Axon MultiClamp 700B Commander downloadpagina
optische luchttafelNewport CorporationVH3036W-OPTbreadboardisolatietafel om microscoop te laten zweven en trillingen tijdens opnames te minimaliseren
pCLAMPMolecular Devices10.7.0te downloaden vanaf de Axon pCLAMP 10 Electrophysiology Data Acquisition & Analysis Software Download pagina
permanente inktmarkerSharpiebestel bij amazon.comvoor het markeren van de voorkant van de VR-elektrode om de juiste oriëntatie te garanderen bij het plaatsen in de pipethouder
petrischaalFalcon35-3001gebruikt om larven in verlammend middel te dompelen
pipethouderMolecular Devices1-HL-Uhoudt opname-elektrode vast en verbindt met de headstage
pneumatische transducerFluke Biomedical InstrumentsDPM1Bvoor het regelen van de interne druk van de opname-elektrode
kaliumhydroxideSigma-Aldrich221473-25Getser voor het etsen van dissectienelden
siliconenbuisTygon14-169-1Aslang om pneumatische transducer met pipethouder te verbinden
spike_detectaanvullend coderingsbestandop maat geschreven MATLAB-functie die nodig is om AffVR_preprocess.m uit te voeren
stereomicroscoopCarl ZeissStemi 2000-Cgebruikt om punten van pinnen te visualiseren en tijdens de voorbereiding van larven
rechte randmesjeCanopusbestel bij amazon.comsnijdt het wolfraamdraad terwijl dissectienelden worden gemaakt
swimbout_detectaanvullend coderingsbestandop maat geschreven MATLAB-functie die nodig is om AffVR_preprocess.m uit te voeren
spuitBecton Dickinson Compoany309602gevuld met extracellulaire oplossing om in opname-elektroden te injecteren
transferpipetSigma-AldrichZ135003-500EAeenmalig, niet-steriele pipet voor het overbrengen van larven
tricaine methaansulfonaatSyndel12854farmaceutisch anesthetisch middel dat wordt gebruikt om larven met een hoge dosis te euthanasiëren.
wolfraamdraadWorld Precision Instruments Inc.7155000,002 inch, 50,8 μm diameter; gebruikt om dissectienelden te maken
vacuümfiltratie-eenheidSigma-AldrichSCGVU11REeenmalig, steriele, vacuümfiltratie-eenheden die worden gebruikt om extracellulaire oplossing te

Referenties

  1. Trapani, J. G., Nicolson, T. Mechanism of spontaneous activity in afferent neurons of the zebrafish lateral-line organ. The Journal of Neuroscience. 31 (5), 1614-1623 (2011).
  2. Haehnel-Taguchi, M., Akanyeti, O., Liao, J. C. Afferent and motorneuron activity in response to single neuromast stimulation in the posterior lateral line of larval zebrafish. Journal of Neurophysiology. 112 (6), 1329-1339 (2014).
  3. Levi, R., Akanyeti, O., Ballo, A., Liao, J. C. Frequency response properties of primary afferent neurons in the posterior lateral line system of larval zebrafish. Journal of Neurophysiology. 113 (2), 657-668 (2015).
  4. Harris, G. G., Fishkopf, L. S., Flock, A. Receptor potentials from hair cells of the lateral line. Science. 167 (3914), 76-79 (1970).
  5. Dow, E., Jacobo, A., Hossain, S., Siletti, K., Hudspeth, A. J. Connectomics of the zebrafish's lateral line neuromast reveals wiring and miswiring in a simple microcircuit. eLife. 7, 33988(2018).
  6. Obholzer, N., et al. Vesicular glutamate transporter 3 is required for synaptic transmission in zebrafish hair cells. The Journal of Neuroscience. 28 (9), 2110-2118 (2008).
  7. Keen, E. C., Hudspeth, A. J. Transfer characteristics of the hair cell's afferent synapse. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 103 (14), 5537-5542 (2006).
  8. Li, G., Keen, E., Andor-Ardó, D., Hudspeth, A. J., von Gersdorff, H. The unitary event underlying multiquantal EPSCs at a hair cell's ribbon synapse. The Journal of Neuroscience. 29 (23), 7558-7568 (2009).
  9. Manley, G. A., Robertson, D. Analysis of spontaneous activity of auditory neurons in the spiral ganglion of the guinea-pig cochlea. The Journal of Physiology. 258 (2), 323-336 (1976).
  10. Kiang, N. Y. S., Watanabe, T., Thomas, E., Clark, L. Discharge patterns of single fibers in the cat's auditory nerve. , MIT Press. Cambridge MA. (1965).
  11. Corey, D. P., Hudspeth, A. J. Ionic basis of the receptor potential in a vertebrate hair cell. Nature. 281 (5733), 675-677 (1979).
  12. Trapani, J. G., Nicolson, T. Physiological recordings from zebrafish lateral-line hair cells and afferent neurons. Methods in Cell Biology. 100, 219-231 (2010).
  13. Reinig, S., Driever, W., Arrenberg, A. B. The descending diencephalic dopamine system is tuned to sensory stimuli. Current Biology. 27 (3), 318-333 (2017).
  14. Zhang, Q., et al. Synaptically silent sensory hair cells in zebrafish are recruited after damage. Nature Communications. 9 (1), 1388(2018).
  15. Pichler, P., Lagnado, L. Motor behavior selectively inhibits hair cells activated forward motion in the lateral line of zebrafish. Current Biology. 30 (1), 150-157 (2020).
  16. Olszewski, J., Haehnel, M., Taguchi, M., Liao, J. C. Zebrafish larvae exhibit rheotaxis and can escape a continuous suction source using their lateral line. PloS One. 7 (5), 36661(2012).
  17. Suli, A., Watson, G. M., Rubel, E. W., Raible, D. W. Rheotaxis in larval zebrafish is mediated by lateral line mechanosensory hair cells. PLoS One. 7 (2), 29727(2012).
  18. Oteiza, P., Odstcil, I., Lauder, G., Portugues, R., Engert, F. A novel mechanism for mechanosensory-based rheotaxis in larval zebrafish. Nature. 547 (7664), 445-448 (2017).
  19. McHenry, M. J., Feitl, K. E., Strother, J. A. Larval zebrafish rapidly sense the water flow of a predator's strike. Biology Letters. 5 (4), 477-479 (2009).
  20. Stewart, W. J., Cardenas, G. S., McHenry, M. J. Zebrafish larvae evade predators by sensing water flow. The Journal of Experimental Biology. 216, Pt 3 388-398 (2013).
  21. Mekdara, P. J., Schwalbe, M. A. B., Coughlin, L. L., Tytell, E. D. The effects of lateral line ablation and regeneration in schooling giant danios. The Journal of Experimental Biology. 221, Pt 8 175166(2018).
  22. Palmer, L. M., Giuffrida, B. A., Mensinger, A. F. Neural recordings from the lateral line in free-swimming toadfish, Opsanus tau. The Biological Bulletin. 205 (2), 216-218 (2003).
  23. Ayali, A., Gelman, S., Tytell, E. D., Cohen, A. H. Lateral line activity during undulatory body motions suggests a feedback link in closed-loop control of sea lamprey swimming. Canadian Journal of Zoology. 87 (8), 671-683 (2009).
  24. Mensinger, A. F., Van Wert, J. C., Rogers, L. S. Lateral line sensitivity in free-swimming toad fish Opsanus tau. The Journal of Experimental Biology. 222, Pt 2 190587(2019).
  25. Montgomery, J., Bodznick, D., Halstead, M. Hindbrain signal processing in the lateral line system of the dwarf scorpionfish Scopeana papillosus. The Journal of Experimental Biology. 199, Pt 4 893-899 (1996).
  26. Montgomery, J. C., Bodznick, D. An adaptive filter that cancels self-induced noise in the electrosensory and lateral line mechanosensory systems of fish. Neuroscience Letters. 174 (2), 145-148 (1994).
  27. Palmer, L. M., Deffenbaugh, M., Mensinger, A. F. Sensitivity of the anterior lateral line to natural stimuli in the oyster toadfish, Opsanus tau (Linnaeus). The Journal of Experimental Biology. 208, Pt 18 3441-3450 (2005).
  28. Russell, I. J., Roberts, B. L. Inhibition of spontaneous lateral-line activity of efferent nerve stimulation. The Journal of Experimental Biology. 57, 77-82 (1972).
  29. Lunsford, E. T., Skandalis, D. A., Liao, J. C. Efferent modulation of spontaneous lateral line activity during and after zebrafish motor commands. Journal of Neurophysiology. 122 (6), 2438-2448 (2019).
  30. Russell, I. J. The pharmacology of efferent synapses in the lateral-line system of Xenopus laevis. The Journal of Experimental Biology. 54 (3), 643-659 (1971).
  31. Roberts, B. L., Russell, I. J. The activity of lateral-line efferent neurons in stationary and swimming dogfish. The Journal of Experimental Biology. 57 (2), 435-448 (1972).
  32. Flock, A., Russell, I. J. The post-synaptic action of efferent fibres in the lateral line organ of the burbot Lota lota. The Journal of Physiology. 235 (3), 591-605 (1973).
  33. Montgomery, J. C. Noise cancellation in the electrosensory system of the thornback ray; common mode rejection of input produced by the animal's own ventilatory movement. Journal of Comparative Physiology. 155, 103-111 (1984).
  34. Tricas, T. C., Highstein, S. M. Action of the octavolateralis efferent system upon the lateral line of free-swimming toadfish, Opsanus tau. Journal of Comparative Physiology. 169 (1), 25-37 (1991).
  35. Weeg, M. S., Land, B. R., Bass, A. H. Vocal pathways modulate efferent neurons to the inner ear and lateral line. The Journal of Neuroscience. 25 (25), 5967-5974 (2005).
  36. Elgoyhen, A. B., Johnson, D. S., Boulter, J., Vetter, D. E., Heinemann, S. α9: an acetylcholine receptor with novel pharmacological properties expressed in rat cochlear hair cells. Cell. 79 (4), 705-715 (1994).
  37. Masino, M. A., Fetcho, J. R. Fictive swimming motor patterns in wild type and mutant larval zebrafish. Journal of Neurophysiology. 93 (6), 3177-3188 (2005).
  38. Hentschke, H. abfload. 1.4.0.0. MATLAB Central File Exchange. , (2020).
  39. Harris, G. G., Milne, D. C. Input-output characteristics of the lateral-line sense organs of Xenopus laevis. The Journal of the Acoustical Society of America. 40 (1), 32-42 (1966).
  40. Liao, J. C., Haehnel, M. Physiology of afferent neurons in larval zebrafish provides a functional framework for lateral line somatotopy. Journal of Neurophysiology. 107 (10), 2615-2623 (2012).
  41. Song, S., et al. Mathematical modeling and analyses of interspike-intervals of spontaneous activity in afferent neurons of the zebrafish lateral line. Nature Science Reports. 8, 14851(2018).
  42. Liao, J. C., Fetcho, J. R. Shared versus specialized glycinergic spinal interneurons in axial motor circuits of larval zebrafish. The Journal of Neuroscience. 28 (48), 12982-12992 (2008).
  43. von Holst, E., Mittelstaedt, H. The principle of reafference: interactions between the central nervous system and the peripheral organs. Die Naturwissenschften. 37, 463(1950).
  44. Crapse, T. B., Sommer, M. A. Corollary discharge across the animal kingdom. Nature Reviews. Neuroscience. 9 (8), 587-600 (2008).
  45. Brichta, A. M., Goldberg, J. M. Responses to efferent activation and excitatory response-intensity relations of turtle posterior-crista afferents. Journal of Neurophysiology. 83 (3), 1224-1242 (2000).

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Herprints en machtigingen

Tags

Lateraal lijnsysteemafferente neuronale activiteitzebravislarvenpatch-elektrofysiologieloose patch clamphaarcelcircuitsmotorneuronale activiteitextracellulaire registratiesensorische verwerkingcollaterale ontlading
Activiteit van Posterior Lateral Line Afferent Neurons tijdens het zwemmen in Zebrafish
Neem contact met ons op
Aanbevelen aan de bibliotheek

Privacy

Gebruiksvoorwaarden

Beleidsoverzicht

Copyright © 2026 MyJoVE Corporation. Alle rechten voorbehouden.