Methodenartikel

Primaire microglia-isolatie van postnatale muizenhersenen

DOI:

10.3791/62237

⸱

25 februari 2021

 ,  ,  ,  ,  , 
1Shanghai Key Laboratory of Psychotic Disorders, Shanghai Mental Health Center, Shanghai Jiao Tong University School of Medicine, 2Division of Biology and Biomedical Science, Washington University in St. Louis, 3Shenzhen Institutes of Advanced Technology, Chinese Academy of Sciences, 4Department of Neurosurgery, Huashan Hospital, Institute for Translational Brain Research, State Key Laboratory of Medical Neurobiology, MOE Frontiers Center for Brain Science, Fudan University, 5Co-innovation Center of Neuroregeneration, Nantong University

* These authors contributed equally

In dit artikel

Samenvatting

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Primaire celcultuur is een van de meest gebruikte benaderingen voor het bestuderen van microgliale biologie in vitro. Hier hebben we een methode ontwikkeld voor eenvoudige en snelle microglia-isolatie van de muis na dag 1 (P1) tot P4.

Samenvatting

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Microglia zijn de mononucleaire fagocyten in het centrale zenuwstelsel (CZS), die een sleutelrol spelen bij het handhaven van de homeostase en het reguleren van het ontstekingsproces in het CZS. Om de microgliale biologie in vitro te bestuderen, vertonen primaire microglia grote voordelen ten opzichte van onsterfelijke microgliale cellijnen. Microglia-isolatie van het postnatale muizenbrein is echter relatief minder efficiënt en tijdrovend. In dit protocol bieden we een snelle en gemakkelijk te volgen methode om primaire microglia te isoleren uit de hersenen van neonatale muizen. De algemene stappen van dit protocol omvatten hersendissectie, primaire hersencelcultuur en microglia-isolatie. Met behulp van deze aanpak kunnen onderzoekers primaire microglia met een hoge zuiverheid verkrijgen. Bovendien waren de geoogste primaire microglia in staat om te reageren op de lipopolysaccharidenuitdaging, wat aangeeft dat ze hun immuunfunctie behielden. Gezamenlijk hebben we een vereenvoudigde aanpak ontwikkeld om primaire microglia met hoge zuiverheid efficiënt te isoleren, wat een breed scala aan microgliale biologische onderzoeken in vitro mogelijk maakt.

Inleiding

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Microglia, de residente immuuncellen in het centrale zenuwstelsel (CZS), spelen een cruciale rol bij het behoud van de homeostase, die reageert op de neuropathologische uitdagingen1. Onlangs zijn er intensieve onderzoeken gedaan om de fysiologische functies van microglia te achterhalen, bijvoorbeeld bij de ziekte van Alzheimer2. Momenteel biedt het transcriptieprofiel van microglia met de eencellige resolutie verkregen tijdens de ontwikkeling, veroudering en ziekte van het CZS een beter begrip van de microgliale functie in gezonde en zieke hersenen3. Eerdere studies identificeerden een ziektegeassocieerd microgliaal subtype bij AD en andere neurodegeneratieve ziekten 4,5,6. Deze subpopulatie bevindt zich proximaal van de afzetting van het amyloïde β (Aβ). Genen geassocieerd met fagocytose en lipidenmetabolisme (bijv. Apoe, Tyrobp) bleken in deze populaties opwaarts gereguleerd te zijn 6,7. De subcellulaire processen, extracellulaire en intracellulaire signaalroutes die de dynamische moleculaire profielveranderingen in microglia reguleren, worden echter niet volledig begrepen. Met name het mechanisme dat ten grondslag ligt aan chronische microgliale activering bij neurodegeneratieve ziekten blijft ongrijpbaar. Daarom is het van cruciaal belang om microglia-betrokken cellulaire mechanismen te begrijpen, aangezien microglia-reacties duidelijk bijdragen aan de ontwikkeling van de hersenen en de progressie van neurodegeneratie.

Hoewel er een aantal in vivo en in vitro instrumenten zijn om microglia te bestuderen, zijn er nog steeds enkele beperkingen. Het is technisch moeilijk om een voldoende groot aantal microgliacellen met een hoge zuiverheid te verkrijgen voor het routinematig uitvoeren van experimenten, zoals western blot, om intracellulaire signaalroutes op te helderen. Primaire microgliacultuur biedt een alternatieve manier om de biologie van microglia te bestuderen. De gekweekte primaire microglia kunnen worden toegepast om de microgliale fagocytische capaciteit na genmanipulatie te analyseren en de productie van pro- en ontstekingsremmende cytokines te evalueren als reactie op inflammatoire stimuli en andere biologische aspecten om hun rol in de hersenen te begrijpen8. Hier presenteren we een nieuw protocol en beschrijven we een stapsgewijze instructie voor de isolatie en kweek van primaire microglia uit de hersenen van neonatale muizen, met de nadruk op de stappen die cruciaal zijn voor het verkrijgen van gezonde en zuivere primaire microgliacellen.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Alle dierproeven werden goedgekeurd door de commissie voor dieronderzoek en het institutionele administratiepanel voor laboratoriumdierverzorging aan de Shanghai Jiao Tong University. Alles is in het werk gesteld om dierenleed tot een minimum te beperken.

1. Voorbereiding van kweekbuffer, kolven en dekglaasjes

  1. Kweekmedium en microglia-kweekmedium: Vul DMEM aan met 10% FBS om het kweekmedium te maken. Het microglia-kweekmedium wordt gemaakt door 10% FBS en 20% LADMAC geconditioneerd medium aan de DMEM toe te voegen. Voeg 1% penicilline/streptomycine toe aan zowel het medium.
    1. Om 20% LADMAC-geconditioneerd medium te bereiden, verzamelt u het kweekmedium uit de LADMAC-cellen, centrifugeert u het gedurende 10 minuten op 200 x g , filtreert u met een celzeef van 0,22 μm en bewaart u de aliquots vervolgens bij -80 °C.
  2. Spijsverteringsbuffer: Bereid de spijsverteringsbuffer voor door 8 E/ml papaïne en 125 E/ml DNase aan DMEM toe te voegen.
    OPMERKING: Voor het beste resultaat moet de spijsverteringsbuffer vers worden bereid. Bereken de gewenste hoeveelheid op basis van het aantal jongen (1 ml oplossing per 2 jongen).
  3. Coaten van kolven: Gebruik T25- of T75-kolven voor het voorplateren van de geïsoleerde hersencellen. Vóór de hersendissectie wordt de T25-kolf ingesmeerd met 2 ml (of 4 ml voor een T75-kolf) van 0,1 mg/ml poly-D-lysine (PDL) en wordt deze gedurende ten minste 1 uur bij 37 °C geïncubeerd. Zuig de PDL-oplossing op, was twee keer met 1x PBS en laat de kolf vervolgens aan de lucht drogen in de celkweekkap.
    OPMERKING: De grootte en het aantal kolven dat in het experiment werd gebruikt, waren afhankelijk van het aantal postnatale jongen. Om de cellen in korte tijd de confluente astrocytcellaag te laten bereiken, bereidt u één T25-kolf voor 3-5 hersenen of één T75-kolf voor 5 hersenen. Ongebruikte gecoate kolven kunnen maximaal een maand bij 4 °C worden bewaard. Om tijd te besparen, kan voor het begin van het experiment 10x (1 mg/ml) stockoplossing van PDL worden bereid en bij -20 °C worden bewaard als aliquots voor eenmalig gebruik. Verdun de aliquots in steriel 1x PBS vlak voor gebruik.
  4. Bereid dekglaasjes voor: Was in de handel verkrijgbare glazen dekglaasjes met 0,1 M HCl gedurende 1 uur, spoel ze twee keer af met autoclaafwater en bewaar ze vervolgens in 100% ethanol. Vlam voor gebruik de dekglaasjes met een fijne tang met een branderlamp om resterende ethanol te verwijderen. Glazen dekglaasjes van 8 mm kunnen in een plaat met 48 putjes worden geplaatst en glazen dekglaasjes van 12 mm kunnen in een plaat met 24 putjes worden geplaatst.
  5. Bereid dissectiegereedschap voor: Week fijne scharen, tangen en roestvrijstalen microlepels minimaal 20 minuten in 75% ethanol. Plaats deze hulpmiddelen vervolgens gedurende 30 minuten onder ultraviolette straling in de weefselkweekkap.

2. Dissectie van de hersenen van muizen

OPMERKING: Om de werkzaamheid van het protocol te evalueren, hebben we hier CX3CR1GFP knock-in muizen gebruikt voor het traceren van microglia9. CX3CR1GFP/GFP-muizen en wildtype C57BL/6J-vrouwtjes van 2 tot 8 maanden werden gekruist om CX3CR1+/GFP-muizen te genereren, beide werden oorspronkelijk verkregen uit commerciële bronnen. Muizen werden gehuisvest onder een licht-donkercyclus van 12-12 uur in een specifieke pathogeenvrije (SPF) omgeving aan de Shanghai Jiao Tong University. Pups van dag 1 tot dag 4 kunnen voor dit protocol worden ingezet.

  1. Onthoofd alle pups met een chirurgische schaar. Om vervuiling tot een minimum te beperken, spoel je alle kroppen af met 75% ethanol en zet je ze snel in de ijskoude 1x PBS. Verwarm intussen de digestiebuffer en het co-cultuurmedium in een waterbad van 37 °C.
    OPMERKING: Onthoofd en isoleer hersenweefsel van één pup tegelijk om de structurele integriteit te behouden. Om besmetting te voorkomen, moeten alle chirurgische instrumenten tussen de onthoofdingen in 75% ethanol worden geplaatst.
  2. Gebruik een fijne snijschaar om de schedel samen met de medulla oblongata te knippen. Plaats een roestvrijstalen microlepel onder het hersenweefsel vanaf de snijplaats om de hersenen uit de hoofdholte te persen. Breng het over naar een nieuwe gekoelde plaat met 6 putjes met 2 ml voorkoude 1x PBS per putje.
  3. Snijd het cerebellum en de bulbus olfactorius af en gooi ze weg. Breng het resterende hersenweefsel voorzichtig over naar een gekoelde plaat met 6 putjes met 2 ml voorkoude 1x PBS.
    OPMERKING: Plaats 4-5 hersenweefsels in één putje.
  4. Herhaal dezelfde procedure voor de resterende koppen totdat al het weefsel is verzameld.

3. Zaai de gemengde primaire cellen

  1. Zuig 1,5 ml 1x PBS op in de plaat met 6 putjes en hak het hersenweefsel volledig in kleine stukjes (ongeveer 1 mm2) met behulp van een veerschaar.
    OPMERKING: Om de hoeveelheid fijn vuil te verminderen, mag u het weefsel niet te lang fijnhakken.
  2. Voeg de gewenste hoeveelheid digestiebuffer toe aan het putje (0,5 ml digestiebuffer per brein) en plaats de plaat vervolgens 20 minuten in de bevochtigde incubator met 5% CO2, 37 °C. Draai de plaat elke 10 minuten rond.
    OPMERKING: Maak tijdens de incubatietijd een celzeef van 70 μm nat met kweekmedium (10% FBS in DMEM) en plaats de celzeef vervolgens op een verse opvangbuis van 50 ml.
  3. Haal de plaat uit de broedmachine en beëindig de papaïnevertering door aan elk putje 3 ml kweekmedium toe te voegen. Pipetter de cellen 10 keer licht op en neer met een pipet van 1 ml. Breng het mengsel over in een tube van 15 ml en laat het 1 minuut bezinken. Op de bodem is een troebele celpellet te zien. Om grote klonten en celresten te verwijderen, voert u de celsuspensie voorzichtig door een celzeef van 70 μm en vangt u de doorstroom op in de opvangbuis van 50 ml.
  4. Voeg 3 ml opgewarmd kweekmedium (10% FBS in DMEM) toe aan de niet-gedissocieerde celpellet in de tube van 15 ml. Triturateer 10 keer zoals in stap 3.3 om de dissociatie voort te zetten. Laat het weefsel 1 minuut bezinken en leid vervolgens de celsuspensie door de zeef naar de verzamelbuis van 50 ml. Herhaal deze stap en gooi het resterende celafval weg.
  5. Breng de celsuspensie van de 50 ml verzamelbuis over in de buisjes van 15 ml en centrifugeer de cellen bij 200 x g gedurende 10 minuten bij kamertemperatuur.
  6. Zuig de supernatant op en suspendeer de cellen in 5 ml kweekmedium. Zaai de primaire cellen in een T25- of T75-kolf met een celdichtheid van ongeveer 5 x 106 en kweek ze in de bevochtigde incubator (5% CO2, 37 °C). Dit is dag 0 in dit cultuurrooster.
    OPMERKING: Als cellen in een T25-kolf worden gezaaid, is een eindvolume van 5 ml medium per kolf voldoende. Voeg een extra 5 ml kweekmedium toe aan elke kolf wanneer deze in een T75-kolf wordt gezaaid.

4. Verzameling van primaire microglia

  1. Evalueer de samenvloeiing van de gemengde cellen op de volgende dag (dag 1). Omdat de gemengde cellen met een vrij hoge dichtheid zijn gezaaid, duurt het 3-4 dagen voordat de astrocyten samenvloeien, waardoor de microglia 1-2 dagen later kunnen worden verzameld.
    OPMERKING: Wees voorzichtig als er de volgende dag geen cellen aan de bodem van de kolf zijn bevestigd; Het kan te wijten zijn aan celbesmetting of celdood veroorzaakt door oververtering of harde behandeling.
  2. Was op dag 2 de kolven twee keer met 3 ml warme 1x PBS en vervang het medium door 3-5 ml vers kweekmedium toe te voegen aan elke T25-kolf (7-10 ml voor een T75-kolf). Het afgedankte kweekmedium bevat celresten en verschillende soorten cellen, waaronder neuronen, oligodendrocyten en microglia.
  3. Zorg er op dag 4 voor dat astrocyten die aan de bodem van de kolf zijn bevestigd, 100% samenvloeien. Ondertussen is een subpopulatie van microglia losjes bevestigd aan de oppervlaktelaag van gemengde cellen, die gemakkelijk kan loskomen van het oppervlak en in het kweekmedium kan drijven door handen te schudden. Breng het kweekmedium over op een verse plaat met 6 putjes en tijdens dit proces worden primaire microglia verzameld die in het medium zijn verrijkt. Voorzie vervolgens de cellen op de originele plaat met 6 putjes van vers kweekmedium voor verdere celverzameling.
    OPMERKING: Het tikken op de kolven op de tafel of het schudden van de kolven op een laboratoriumschudder bij 180 tpm gedurende 30 minuten voordat het medium wordt overgebracht, is geschikt om meer cellen op te leveren.
  4. Plaats de 6-well voorzichtig in de couveuse om celbevestiging mogelijk te maken. Ongeveer 2 uur na de incubatie worden alle cellen aan de plaat gehecht. Wanneer de cellen zijn bevestigd, wast u ze voorzichtig met warme 1x PBS twee keer om celaggregaten en celresten te verwijderen; Voorzie de cellen vervolgens van 3 ml vers microglia-kweekmedium. De geïsoleerde microgliacellen kunnen in vitro meer dan een maand worden bewaard door het microglia-kweekmedium elke 2 dagen te verversen.
    OPMERKING: Koloniestimulerende factor 1 (CSF1) is een belangrijke groeifactor om de overleving van microglia's in vitro te ondersteunen. Eerdere studies melden dat CSF1 kan worden uitgescheiden uit de LADMAC-cellijn, een getransformeerde cellijn die is ontstaan uit beenmergcellen van muizen. Het LADMAC-geconditioneerde medium kan worden verzameld door de LADMAC-cultuur gedurende 10 minuten op 200 x g te centrifugeren; Haal vervolgens het bovenstaande door een celzeef van 0,22 μm. Microglia-kweekmedium werd bereid door 20% LADMAC-geconditioneerd medium aan het kweekmedium toe te voegen (10% FBS, DMEM).
  5. Ga elke 2-3 dagen door met het verzamelen van de microglia van het medium voor gemengde celkweek, zoals in stap 4.4. Kweek de resterende gemengde cellen in de kolf en gebruik ze voor het consequent oogsten van microglia om de 2-3 dagen gedurende maximaal 1 maand.
    OPMERKING: Microglia kunnen met succes worden geoogst door de mediumvorm van gemengde cultuurcellen gedurende maximaal 50 dagen te verzamelen. Elke keer levert het verzamelde co-kweekmedium ongeveer ~1-3 x 105 microgliacellen per T75-kolf op. Combineer microgliale cellen, indien nodig.
  6. Gebruik primaire microgliacellen voor de gewenste functionele test.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Resultaten

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Primaire microglia verzameld uit CX3CR1+/GFP op dag 7 en dag 35 na het zaaien van de cellen werden gedemonstreerd in figuur 1. Zoals aangetoond in de immunofluorescentiekleuring van microglia/macrofaagcelmarker IBA1, zijn alle IBA1-positieve cellen positief voor de GFP-signalen en negatief voor S100β (astrocytmarker) en CC1 (oligodendrocytmarker), wat suggereert dat de gezuiverde GFP-positieve cellen inderdaad microglia zijn. Vervolgens werd ontde...

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Discussie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Dit protocol is gebaseerd op de eerder beschreven methoden met enkele wijzigingen11. Tips voor het verbeteren van de levensvatbaarheid en zuiverheid van geïsoleerde microglia worden als volgt opgesomd. Zorg er eerst voor dat besmetting wordt voorkomen bij het voorbereiden van buffers die worden gebruikt voor weefselisolatie en celcultuur. Zorg ervoor dat het operatiegereedschap, de containers en de plastic apparatuur steriel zijn. Meestal voeren we de hersendissec...

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Openbaarmakingen

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Alle auteurs onthulden dat er geen belangenconflicten zijn. Alle auteurs verklaren geen concurrerende financiële belangen.

Dankbetuigingen

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

De auteurs willen graag hun respect betuigen aan de helden die de COVID-19-uitbraak bestrijden. De auteurs danken Fang Lei (Fudan University) voor het uitstekende laboratoriummanagement, Dr. Zikai Zhou, Dr. Jing Li en Dr. Guiqing He (Shanghai Mental Health Center) voor de bespreking van microglia-isolatie. Last but not least tonen de auteurs hun dankbaarheid en respect voor alle dieren die in deze studie zijn geofferd. Deze studie werd ondersteund door het National Key R&D Program of China (Grant No. 2017YFC0111202) (B.P.), National Natural Science Foundation of China (Grant No. 31922027) (B.P.) en (Grant No. 32000678) (Y.R.), en het Shenzhen Science and Technology Research Program (Grant No. JCYJ20180507182033219 en JCYJ20170818163320865) (B.P.) en (Grant No. JCYJ20170818161734072) (S.X.).

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel
NaamBedrijfCatalogusnummerOpmerkingen
Cell strainers, 40 µmThermoFisher Scientific22-363-547
DNase I Sigma11284932001
Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM)Gibco by Life TechnologiesC11995500BT
Dulbecco's Phosphate Buffered Saline (DPBS)Gibco by Life Technologies14190-144
Fetal Bovine Serum (FBS)Gibco by Life Technologies10099141
Papain, SuspensionSangon BiotechPapain, Suspension
Penicillin-Streptomycin 100X solutionHycloneSV30010
Poly-D-LysineThermoFisher ScientificA3890401

Referenties

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Prinz, M., Jung, S., Priller, J. Microglia biology: one century of evolving concepts. Cell. 179 (2), 292-311 (2019).
  2. Perry, V. H., Nicoll, J. A., Holmes, C. Microglia in neurodegenerative disease. Nature Reviews. Neurology. 6 (4), 193-201 (2010).
  3. Parker, K. R., et al. Single-cell analyses identify brain mural cells expressing CD19 as potential off-tumor targets for CAR-T immunotherapies. Cell. 183 (1), 126-142 (2020).
  4. Tay, T. L., Dautzenberg, J. S., Grun, D., Prinz, M. Unique microglia recovery population revealed by single-cell RNAseq following neurodegeneration. Acta Neuropathologica Communications. 6 (1), 87(2018).
  5. Deczkowska, A., et al. Disease-associated microglia: a universal immune sensor of neurodegeneration. Cell. 173 (5), 1073-1081 (2018).
  6. Keren-Shaul, H., et al. A unique microglia type associated with restricting development of Alzheimer's disease. Cell. 169 (7), 1276-1290 (2017).
  7. Krishnaswami, S. R., et al. Using single nuclei for RNA-seq to capture the transcriptome of postmortem neurons. Nature Protocols. 11 (3), 499-524 (2016).
  8. Timmerman, R., Burm, S. M., Bajramovic, J. J. An overview of in vitro methods to study microglia. Frontiers in Cellular Neuroscience. 12, 242(2018).
  9. Huang, Y., et al. Repopulated microglia are solely derived from the proliferation of residual microglia after acute depletion. Nature Neuroscience. 21 (4), 530-540 (2018).
  10. Garcia, J. A., Cardona, S. M., Cardona, A. E. Analyses of microglia effector function using CX3CR1-GFP knock-in mice. Methods in Molecular Biology. 1041, 307-317 (2013).
  11. Lian, H., Roy, E., Zheng, H. Protocol for primary microglial culture preparation. Bio-protocol. 6 (21), (2016).
  12. Tamashiro, T. T., Dalgard, C. L., Byrnes, K. R. Primary microglia isolation from mixed glial cell cultures of neonatal rat brain tissue. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (66), e3814(2012).
  13. Caldeira, C., et al. Microglia change from a reactive to an age-like phenotype with the time in culture. Frontiers in Cellular Neuroscience. 8, 152(2014).

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Herprints en machtigingen

Toestemming aanvragen om de tekst of afbeeldingen van dit JoVE-artikel te hergebruiken

Toestemming aanvragen

Trefwoorden

Postnatal Mouse BrainBrain DissectionBrain Cell CultureMicroglial BiologyCentral Nervous SystemImmune FunctionIn Vitro MicrogliaMicroglia Purity
Video binnenkort beschikbaar

Gerelateerde artikelen