Method Article

Multiplexed analyse van retinale genexpressie en chromatinetoegankelijkheid met behulp van scRNA-Seq en scATAC-Seq

DOI:

10.3791/62239

⸱

March 12th, 2021

 ,  ,  , 
1Solomon H. Snyder Department of Neuroscience, Johns Hopkins University School of Medicine, 2Department of Psychiatry and Behavioral Science, The Johns Hopkins Hospital, 3Department of Ophthalmology, The Johns Hopkins Hospital, 4Department of Neurology, The Johns Hopkins Hospital, 5Institute for Cell Engineering, Johns Hopkins University School of Medicine, 6Kavli Neuroscience Discovery Institute, Johns Hopkins University School of Medicine

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Hier tonen de auteurs het nut van MULTI-seq voor fenotypering en daaropvolgende gepaarde scRNA-seq en scATAC-seq bij het karakteriseren van de transcriptomische en chromatinetoegankelijkheidsprofielen in retina.

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Krachtige sequencingtechnieken van de volgende generatie bieden robuuste en uitgebreide analyse om te onderzoeken hoe retinale genregulerende netwerken functioneren tijdens de ontwikkeling en in ziektetoestanden. Single-cell RNA sequencing stelt ons in staat om genexpressieveranderingen waargenomen in retinale ontwikkeling en ziekte op cellulair niveau uitgebreid te profileren, terwijl eencellige ATAC-Seq het mogelijk maakt om analyse van chromatinetoegankelijkheid en transcriptiefactorbinding te profileren met een vergelijkbare resolutie. Hier wordt het gebruik van deze technieken in het zich ontwikkelende netvlies beschreven en MULTI-Seq gedemonstreerd, waarbij individuele monsters worden gelabeld met een gemodificeerd oligonucleotide-lipidencomplex, waardoor onderzoekers zowel de reikwijdte van individuele experimenten kunnen vergroten als de kosten aanzienlijk kunnen verlagen.

Introduction

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Begrijpen hoe genen het lot van cellen kunnen beïnvloeden, speelt een sleutelrol bij het ondervragen van processen zoals ziekte en embryonale progressie. De complexe relaties tussen transcriptiefactoren en hun doelgenen kunnen worden gegroepeerd in genregulerende netwerken. Toenemend bewijs plaatst deze genregulerende netwerken in het centrum van zowel ziekte als ontwikkeling in evolutionaire afstammingslijnen1. Terwijl eerdere technieken zoals qRT-PCR zich richtten op een enkel gen of een set genen, maakt de toepassing van high-throughput sequencing-technologie de profilering van volledige cellulaire transcriptomen mogelijk.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Het gebruik van dieren voor deze studies werd uitgevoerd met behulp van protocollen die zijn goedgekeurd door het Johns Hopkins Animal Care and Use Committee, in overeenstemming met de ARRIVE-richtlijnen, en werden uitgevoerd in overeenstemming met de relevante richtlijnen en voorschriften.

1. Multi-seq

  1. Media voorbereiding
    1. Bereid en balanceer ovomucoïde remmer, 10 mg ovomucoïde remmer en 10 mg albumine per ml Earle's Balanced Salt Solution (EBSS), gedurende 30 minuten voorafgaand aan gebruik13. Equilibrate met 95% O2:5% CO2 in een incubator.
      1. Bereid papa....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Results

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Deze workflow beschrijft een strategie voor onderzoek naar ontwikkelingsfenotypen en regelgevende processen met behulp van single cell sequencing. MULTI-seq sample multiplexing maakt een eerste goedkope fenotyperingstest mogelijk, terwijl gepaarde verzameling en fixatie van monsters voor scRNA-seq en scATAC-seq meer diepgaand onderzoek mogelijk maakt (figuur 1).

MULTI-seq barcoding maakt de gecombineerde sequencing van meerdere monsters en hun daaropvolgende compu.......

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Discussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

De kracht van MULTI-seq komt voort uit de naadloze integratie van gegevens uit meerdere experimentele omstandigheden of modellen en het enorme voordeel in termen van kosten en het beperken van batcheffecten. Het gebruik van MULTI-seq biedt een laboratorium ongekende fenotyperingsdiepte. Niet-genetische multiplexingmethoden zoals cell hashing of nuclei hashing openden de deur naar multiplexed samples door het gebruik van barcode-antilichamen 7,19,20

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Disclosures

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Niets te onthullen.

Acknowledgements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

We bedanken Linda Orzolek van de Johns Hopkins Transcriptomics en Deep Sequencing Core voor hulp bij het sequentiëren van de geproduceerde bibliotheken en Lizhi Jiang voor het uitvoeren van de ex vivo retinale explantaten.

....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
10 µL, 200 µL, 1000 µL pipette filter tips
10% Tween 20Bio-Rad1662404
100 µM Barcode SolutionRequest from Gartner labhttps://docs.google.com/forms/d/1bAzXFEvDEJse_cMvSUe_yDaP
rJpAau4IPx8m5pauj3w/viewform?ts=5c47a897&edit_requested
=true
100% EthanolMillipore SigmaE7023-500ML
100% MethanolMillipore Sigma322415-100ML
10x Chip Holder10x Genomics1000195
10x Chromium controller & Accessory Kit10x GenomicsPN-120263
15mL Centrifuge TubeQuality BiologicalP886-229411
40 µm FlowMi Cell StrainerBel-ArtH13680-0040
50 µM Anchor SolutionSigma or request from Gartner labhttps://docs.google.com/forms/d/1bAzXFEvDEJse_cMvSUe_yDaP
rJpAau4IPx8m5pauj3w/viewform?ts=5c47a897&edit_requested
=true
50 µM Co-Anchor SolutionSigma or request from Gartner labhttps://docs.google.com/forms/d/1bAzXFEvDEJse_cMvSUe_yDaP
rJpAau4IPx8m5pauj3w/viewform?ts=5c47a897&edit_requested
=true
5200 Fragment Analyzer systemAgilentM5310AA
70 um FlowMi cell strainerBel-ArtH13680-0070
Allegra X-12R CentrifugeVWRBK392302
Bovine Serum AlbuminSigma-AldrichA9647
Chromium Next GEM Chip G10x GenomicsPN-1000120
Chromium Next GEM Chip H10x GenomicsPN-1000161
Chromium Next Gem Single Cell ATAC Reagent Kit v1.110x GenomicsPN-1000175
Chromium Single Cell 3' GEM, Library & Gel Bead Kit v3.110x GenomicsPN-1000121
DigitoninFisher ScientificBN2006
Dissection microscopeLeica
DNA LoBind Tubes, 1.5 mLEppendorf22431021
Dry Ice
EVA Foam Ice PanTequipment04393-54
FA 12-Capillary Array Short, 33 cmAgilentA2300-1250-3355
Fisherbrand Isotemp Water BathFisher Scientific15-460-20Q
Forma CO2 Water Jacketed IncubatorThermoFisher Scientific3110
Glycerol 50% Aqueous solutionRicca Chemical Company3290-32
Hausser Scientific Bright-Line Counting ChamberFisher Scientific02-671-51B
Illumina NextSeq or NovaSeqIllumina
Kapa Hifi Hotstart ReadyMixHiFi7958927001
Low TE BufferQuality Biological351-324-721
Magnesium Chloride Solution 1 MSigma-AldrichM1028
Magnetic Separator Rack for 1.5 mL tubesMillipore Sigma20-400
Magnetic Separator Rack for 200 µL tubes10x GenomicsNC1469069
MULTI-seq PrimerSigma or IDTSee sequence list
MyFuge Mini CentrifugeBenchmark ScientificC1008
Nonidet P40 SubstituteSigma-Aldrich74385
Nuclease-free waterFisher ScientificAM9937
P2, P10, P20, P200, P1000 micropipettesEppendorf
Papain Dissociation SystemWorthington Biochemical CorporationLK003150
PBS pH 7.4 (1X)Fisher Scientific10010-023
Qiagen Buffer EBQiagen19086
Refridgerated Centrifuge 5424 REppendorf2231000655
RNase-free Disposable Pellet PestlesFisher Scientific12-141-368
RNasin Plus RNase InhibitorPromegaN2615
RPI primerSigma or IDTSee sequence list
Single Index Kit N, Set A10x GenomicsPN-1000212
Single Index Kit T Set A10x GenomicsPN-1000213
Sodium Chloride Solution 5 MSigma-Aldrich59222C
SPRIselect Reagent KitBeckman CoulterB23318
Standard Disposable Transfer PipettesFisher Scientific13-711-7M
TempAssure PCR 8-tube stripUSA Scientific1402-4700
Trizma Hydrochloride Solution, pH 7.4Sigma-AldrichT2194
Trypan Blue Solution, 0.4% (w/v)Corning25-900-CI
Universal I5 primerSigma or IDTSee sequence list
Veriti Thermal CyclerApplied Biosystems4375786
Vortex MixerVWR10153-838

References

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Hoang, T., et al. Gene regulatory networks controlling vertebrate retinal regeneration. Science. 370, (2020).
  2. Nagalakshmi, U., et al. The Transcriptional Landscape of the Yeast Genome Defined by RNA Sequencing. Science. 320, 1344-1349 (....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Tags

Single Cell RNA SeqSingle Cell ATAC SeqRetinal Gene ExpressionChromatin AccessibilityGene Regulatory NetworksMULTI Seq BarcodingCell Type IdentificationCell ClusteringSample BarcodingRetinal Development

Related Articles