Een abonnement op JoVE is vereist om deze inhoud te bekijken. Log in of start vandaag met uw gratis proefperiode.

Methodenartikel

Generatie van geïnduceerde pluripotente stamcellen van het syndroom van Turner (45XO) foetale cellen voor downstream modellering van neurologische tekorten geassocieerd met het syndroom

2.7K weergaven

⸱

DOI:

10.3791/62240

⸱

4 december 2021

 ,  ,  ,  , 
1Manipal Institute of Regenerative Medicine, Manipal Academy of Higher Education, Manipal, Karnataka, India-576104, 2Department of Medical Genetics, Manipal Hospitals

* These authors contributed equally

In dit artikel

Samenvatting

Dit protocol beschrijft het genereren van integratievrije iPSC's uit foetale weefselfibroblasten door toediening van episomale plasmiden door nucleofection gevolgd door een beschrijving van methoden die worden gebruikt voor iPSC-karakterisering en neuronale differentiatie.

Samenvatting

Chromosomale aneuploïden veroorzaken ernstige aangeboren misvormingen, waaronder misvormingen van het centrale zenuwstelsel en foetale sterfte. Prenatale genetische screening is puur diagnostisch en verheldert het ziektemechanisme niet. Hoewel cellen van aneuploïde foetussen waardevol biologisch materiaal zijn met de chromosomale aneuploïdie, zijn deze cellen van korte duur, waardoor hun gebruik voor downstream onderzoeksexperimenten wordt beperkt. Generatie van geïnduceerde pluripotente stamcel (iPSC) modellen is een effectieve methode van celvoorbereiding voor eeuwigdurend behoud van aneuploïde eigenschappen. Ze zijn zelfvernieuwend en differentiëren in gespecialiseerde cellen die doen denken aan de embryonale ontwikkeling. IPSC's dienen dus als uitstekende hulpmiddelen om vroege ontwikkelingsgebeurtenissen te bestuderen. Turner syndroom (TS) is een zeldzame aandoening geassocieerd met een geheel of gedeeltelijk ontbrekend X-chromosoom. Het syndroom wordt gekenmerkt door onvruchtbaarheid, kleine gestalte, endocriene, metabole, auto-immuun- en cardiovasculaire aandoeningen en neurocognitieve defecten. Het volgende protocol beschrijft isolatie en kweek van fibroblasten uit TS (45XO) foetaal weefsel, generatie van integratievrije TSiPSCs door levering van episomale herprogrammeringsplasmiden door nucleofection gevolgd door karakterisering. De herprogrammering van TSiPSC's werden aanvankelijk gescreend door levende cel alkalische fosfatasekleuring gevolgd door uitgebreid onderzoek naar pluripotentie biomarkers. Geselecteerde kolonies werden mechanisch ontleed, meerdere keren gepasseerd en stabiele zelfvernieuwende cellen werden gebruikt voor verdere experimenten. De cellen drukten pluripotentietranscriptiefactoren OCT4, NANOG, SOX2, celoppervlakmarkers SSEA 4 en TRA1-81 uit, typisch voor pluripotente stamcellen. Het oorspronkelijke 45XO karyotype bleef na herprogrammering behouden. De TSiPSCs waren in staat om embryoïde lichamen te vormen en te differentiëren in cellen van endoderm, mesoderm en ectoderm die afstammingsspecifieke biomarkers tot expressie brengen ((SRY BOX17), (MYOSIN VENTRICULAR HEAVY CHAINα/β), (βIII TUBULIN)). De exogene episomale plasmiden gingen spontaan verloren en werden na passage 15 in cellen niet gedetecteerd. Deze TSiPSC's zijn een waardevolle cellulaire bron voor het modelleren van defecte moleculaire en cellulaire neurologische ontwikkeling die neurocognitieve tekorten veroorzaakt die verband houden met het syndroom van Turner.

Inleiding

Aneuploïdieën leiden tot aangeboren afwijkingen/aangeboren misvormingen en zwangerschapsverlies bij de mens. ~50%-70% van de monsters van zwangerschapsverliezen vertonen cytogenetische afwijkingen. Aneuploïde embryo's die vroeg in de zwangerschap verloren zijn gegaan, kunnen niet gemakkelijk worden verkregen voor experimentele analyse, waardoor de noodzaak ontstaat om andere modellen te ontwikkelen die de menselijke embryogenese nauw weergeven. Geïnduceerde pluripotente stamcellen (iPSC's) afgeleid van cellen met de diagnose genetische aandoeningen zijn gebruikt om de representatieve genetische onregelmatigheden en hun gevolgen voor de foetale ontwikkeling te modelleren1,2,3,4. Deze iPSC's lijken op epiblastcellen van het zich ontwikkelende embryo en kunnen de vroege gebeurtenissen van embryovorming samenvatten. Ze maken begrip en karakterisering van het ontwikkelingsprogramma van cellijningen en patronen in vroege zoogdierembryo's mogelijk. iPSC's die eerder zijn afgeleid van huidfibroblasten en amniocyten van prenatale diagnostische tests van aneuploïdiesyndromen zoals monosomie X (syndroom van Turner), trisomie 8 (Syndroom van Warkany 2), trisomie 13 (Syndroom van Patau) en partiële trisomie 11; 22 (Emanuel syndroom) hebben waardevolle inzichten opgeleverd met betrekking tot mislukte ontwikkeling4.

Turner syndroom (TS) is een zeldzame aandoening die wordt gekenmerkt door vrouwelijke onvruchtbaarheid, kleine gestalte, endocriene en metabole stoornissen, een verhoogd risico op auto-immuunziekten en een aanleg voor hart- en vaatziekten5. Hoewel het het enige overlevingswaardige monosomiesyndroom is, is het ook dodelijk voor het zich ontwikkelende embryo dat spontane abortussen veroorzaakt6. Overlevende individuen met TS presenteren zich met graden van verandering van X-chromosomaal materiaal in hun cellen. Karyotypen variëren van volledig verlies van één X-chromosoom (45,XO) tot mozaïeken zoals 45,XO/46,XX; 45,XO/47,XXX, de aanwezigheid van ringchromosomen, de aanwezigheid van Y-chromosomaal materiaal,enz. 5.

Diagnose van het syndroom wordt over het algemeen gedaan door karyotypering van bloed van symptomatische personen en chorion villi sampling (CVS) om vroege aneuploïdie syndromen te detecteren. Aangezien aneuploïdiesyndromen verantwoordelijk zijn voor ~ 30% van de spontane abortussen, is het routine om het product van conceptie (POC) bij een spontane abortus te karyotyperen. Deze foetale cellen, waaronder de chorionvilli die de cytogenetische afwijking bezitten en daarvan afgeleide iPSC's, bieden een waardevolle bron van biologisch materiaal om aneuploïdiesyndromen te bestuderen4,6. TS iPSC's zijn eerder vastgesteld uit amniocyten via retrovirale herprogrammering4, fibroblasten van chorionvlokken (verkregen door prenatale diagnose) via retrovirale herprogrammering6, uit mononucleaire bloedcellen7 via sendaivirusherprogrammering en uit huidfibroblasten van TS-individuen via lentivirale herprogrammering4 . Omdat de primaire focus van ons lab is om ontwikkelingsfalen te begrijpen, hebben we TS iPSC's gegenereerd uit POC, met name de chorionvilli-component van een spontane abortus8. Alle cellen geïsoleerd uit dit foetale weefsel hadden een 45XO karyotype en leverden iPSC's op met hetzelfde karyotype. Deze iPSC's zijn uniek omdat ze de eerste zijn die worden gegenereerd uit een geaborteerde foetus en een waardevolle bron bieden om aneuploïdiegerelateerde zwangerschapsfalen te bestuderen. Dit artikel biedt een gedetailleerde methodologie van het genereren van iPSC's uit deze unieke celbron via episomale herprogrammering.

De vroege methoden van iPSC-generatie gebruikten virale transductie en transposons om de herprogrammeringsfactoren te leveren. Methoden voor het induceren van cellen tot pluripotentie zijn geëvolueerd van het gebruik van integrerende retrovirale vectoren9, excisable lentiviral vectoren10,11 en transposon-gebaseerde methoden12 tot niet-integrerende adenovirale vectoren13 en Sendai virus gebaseerde vectoren14. Retrovirale en lentivirale herprogrammering, hoewel efficiënt, omvat integratie van de herprogrammeringsfactoren in de gastheerchromosomen, waardoor insertiemutaties ontstaan die onvoorziene effecten hebben in de iPSC's. Bovendien voorkomt virale herprogrammering translationele toepassing van iPSC's. RNA-gebaseerde systemen15 en directe eiwitafgifte16 zijn onderzocht om de potentiële risico's in verband met het gebruik van virussen en DNA-transfecties volledig te elimineren. Deze methoden zijn echter inefficiënt gebleken.

In 2011 rapporteerden Okita et al. een verbeterde efficiëntie van herprogrammering door episomale plasmiden aangevuld met TP53-onderdrukking via shRNA. Ze vervingen ook cMYC door niet-transformerende LMYC (kleincellig longcarcinoom geassocieerde MYC) om de veiligheid van de hiPSC's te verbeteren. Deze episomale plasmiden drukken 5 herprogrammeringsfactoren uit: OCT4, LIN28, SOX2, KLF4, LMYC en shRNA voor TP5317,18. Deze vectoren worden extra-chromosomaal gehandhaafd en gaan verloren uit de geherprogrammeerde cellen bij continue kweek, waardoor de lijnen transgeenvrij worden binnen 10-15 passages. Nucleofection is een gespecialiseerde vorm van elektroporatie die nucleïnezuren rechtstreeks in de kern van gastheercellen aflevert. Het is een efficiënte methode voor de toediening van de herprogrammeringsplasmiden in verschillende celtypen. Episomale plasmiden zijn kosteneffectief en compenseren de hoge kosten van nucleofection. Deze methode is efficiënt en reproduceerbaar onder geoptimaliseerde omstandigheden en levert stabiele iPSC's op uit een verscheidenheid aan somatische cellen. In dit protocol beschrijven we de methode voor het genereren van iPSC's uit fibroblasten geïsoleerd uit foetaal weefsel door nucleofection van episomale herprogrammeringsplasmiden. Hier zijn de gedetailleerde protocollen voor fibroblastisolatie van foetale chorionvilli, plasmidezuivering, nucleofection, plukken van kolonies uit de herprogrammeringsplaat en vaststelling van stabiele iPSC's.

Het is essentieel om de aanwezigheid van pluripotentiekenmerken in de nieuw gegenereerde iPSC's te bevestigen. Dit omvat het aantonen van pluripotentiegerelateerde factoren (bijv. alkalische fosfatase-expressie, NANOG, SSEA4, Tra 1-80, Tra 1-81, E-cadherine; meestal aangetoond met immunofluorescentie- of genexpressietests), identificatie van de drie kiemlagen door in vitro differentiatietests om hun differentiatiepotentiaal te valideren, karyotypering om het chromosomale gehalte te bepalen, STR-typering om identiteit met oudercellen vast te stellen, verlies van exogene genen te verifiëren, en strengere in vivo testen zoals teratoomvorming en tetraploïde complementatie. Hier beschrijven we karakteriseringsprotocollen van karyotypering, alkalische fosfatasekleuring van levende cellen, detectie van pluripotentiegerelateerde biomarkers door immunofluorescentie, in vitro differentiatietests en methode om verlies van exogene genen aan te tonen19.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Protocol

FCV werden verkregen van Manipal Hospital, Bengaluru, onder goedkeuring van de ethische commissie van Manipal Hospitals.

OPMERKING: Zie tabel 1 voor de samenstelling van alle buffers en oplossingen.

1. Isolatie van fibroblasten van foetale chorionvlokken (FCV)

  1. Monsterverzameling en weefseldesintegratie in collagenase
    1. Fcv verzamelen onder steriele omstandigheden in fosfaat gebufferde zoutoplossing (PBS) en transporteren (bij kamertemperatuur) naar de celkweekfaciliteit.
    2. Breng de villi over in een petrischaaltje van 60 mm en was meerdere keren (minimaal 4 keer) in PBS met 1x Antibiotic Antimycotic solution (PBS-AA). Verwijder PBS-AA volledig door te pipetteren.
    3. Behandel de chorionvilli met 1 ml collagenasemengsel (5 mg/ml) gedurende 5 minuten bij 37 °C.
    4. Neutraliseer met celkweekmedium dat 10% foetaal runderserum (FBS) bevat, breng de digest over naar een buis van 15 ml en centrifugeer gedurende 5 minuten bij 225 x g om de gedesintegreerde villi en vrijgegeven cellen als een pellet te verzamelen.
  2. Subcultuur en voorraaduitbreiding
    1. Plaat gedesintegreerde villi samen met vrijgekomen cellen in een T25-kweekkolf met 5 ml volledige media (bijv. AmnioMAX) en groeien tot een confluente fibroblastcultuur is verkregen.
    2. Breid fibroblasten in cultuur uit om voorraden voor te bereiden voor gebruik in latere transfectie- en karakteriseringsexperimenten als volgt:
      1. Voeg 2 ml 0,05% trypsine toe aan de T25-kolf met FCV-fibroblasten en incubeer bij 37 °C gedurende 3-5 minuten om de cellen te dissociëren.
      2. Neutraliseer na incubatie trypsine door FBS toe te voegen (op hetzelfde volume als trypsine).
        OPMERKING: Kweekmedium dat FBS bevat, kan ook worden gebruikt om trypsine te neutraliseren, wanneer het wordt toegevoegd met een 1:3 trypsine:media ratio.
      3. Verzamel de gedissocieerde cellen in een buis van 15 ml en centrifugeer gedurende 5 minuten bij 225 x g om celpellets te verkrijgen.
      4. Decanteer supernatant en resuspend cell pellet in 1 ml complete media.
      5. Breng elk 500 μL over op 60 mm met weefselkweek behandelde schotels en maak het volume aan op 5 ml. Deze splitsingsverhouding van 1:2 werd ook gebruikt voor latere passages.
  3. Cryopreservatie
    1. Voer enzymatische dissociatie uit met behulp van 0,05% trypsine zoals beschreven in stappen 1.2.2.1 - 1.2.2.3 en verkrijg celpellets.
    2. Gooi het supernatant weg en resuspend de celkorrel in 1 ml vriesmengsel, bestaande uit 1:9 dimethylsulfoxide (DMSO): FBS.
    3. Breng de inhoud over naar een steriel cryoviaal en plaats de injectieflacon in een vriescontainer.
    4. Vries 's nachts in bij -80 °C en breng de injectieflacons de volgende dag over op vloeibare stikstof (-196 °C).

2. Plasmiden DNA Isolatie en verificatie

  1. Bacteriële celpreparaat
    1. Streak glycerol voorraden van E. coli die de drie afzonderlijke plasmiden pCXLE-hOCT3/4-shp53-F, pCXLE-hSK en pCXLE-hUL (van Addgene) bevatten op afzonderlijke Luria Bertani-ampicilline agarplaten.
    2. Ent enkele kolonies in startculturen van 5 ml Luria Bertani-ampicilline medium. Incubeer gedurende 8 uur bij 37 °C met schudden (10 x g).
    3. Ent 200 μL van deze startercultuur in 100 ml Luria Bertani-ampicillinemedium. Incubeer 's nachts bij 37 °C met schudden.
    4. Oogst 's nachts bacteriekweek door centrifugeren bij 6000 x g gedurende 15 minuten bij 4 °C.
  2. Plasmide isolatie met Midi Plasmid zuiveringskit
    1. Resuspend bacteriële pellet in 4 ml resuspensiebuffer.
    2. Voeg 4 ml lysisbuffer toe en meng grondig door 4-6 keer krachtig om te keren en incubeer bij kamertemperatuur gedurende 5 minuten.
    3. Voeg 4 ml voorgekoelde neutralisatiebuffer toe en keer de buis 4-6 keer om om grondig te mengen. Incubeer op ijs gedurende 15 min.
    4. Centrifugeer bij ≥20.000 x g gedurende 30 minuten bij 4 °C. Verzamel het supernatant in een verse buis en centrifugeer opnieuw bij ≥20.000 x g gedurende 15 minuten bij 4 °C.
    5. Breng de kolom in evenwicht door 4 ml equilibratiebuffer toe te passen.
    6. Pas het supernatant toe op de kolom.
    7. Was de kolom tweemaal met 10 ml wasbuffer.
    8. Elute DNA met 5 ml warme (65 °C) elutiebuffer.
    9. Precipiteer DNA door 3,5 ml isopropanol toe te voegen aan het geëlekte DNA. Meng goed. Centrifugeer bij ≥15.000 x g gedurende 30 minuten bij 4 °C. Decanteer supernatant zorgvuldig.
    10. Was de DNA-pellet met 2 ml 70% ethanol en centrifugeer gedurende 10 minuten op ≥15.000 x g. Decanteer supernatant zorgvuldig.
    11. Droog de pellet aan de lucht gedurende 5-10 minuten en los DNA op in een geschikt volume water van PCR-kwaliteit om een eindconcentratie van 1 μg /ml te verkrijgen.
      OPMERKING: Los DNA niet op in buffers omdat het niet geschikt is voor elektroporatie. Oude plasmide DNA-preparaten leveren geen geherprogrammeerde kolonies op.
  3. Plasmide verificatie door EcoRI restrictie vertering
    1. Combineer 15 μL nucleasevrij water, 2 μL 10x buffer, 1 μg plasmide DNA en 1 μL EcoRI enzym. Meng zachtjes.
    2. Incubeer het mengsel bij 37 °C gedurende 15 minuten in een warmteblok.
    3. Meng de verteerde plasmidemonsters met 6x DNA-gelbeladingskleurstof en elektroforese op 1% agarosegel in 1x TAE-buffer met 0,5 μg/ml ethidiumbromide. Inclusief standaard DNA-ladder. Stel de gel voor nadat het DNA op de juiste manier is opgelost. Verwachte EcoRI-bandmaten van pCXLE-hOCT3 / 4-shp53-F zijn 6.834 bp, 3.758 bp en 1.108 bp; pCXLE-hUL zijn 10.200 bp en 1.900 bp; pCXLE-hSK zijn 10.200 bp en 2.500 bp.

3. Nucleofection

  1. Cel pelleteren
    1. Kweek de geïsoleerde foetale villi fibroblasten in T25-kolf in 5 ml volledige media tot 80-90% confluentie.
    2. Was cellen tweemaal met PBS en trypsineer zoals beschreven in stappen 1.2.2.1 - 1.2.2.3.
    3. Verwijder de supernatant, geresuspendeerde pellet in 5 ml gereduceerde serummedia (bijv. Opti-MEM). Tel cellen met hemocytometer en neem 106 cellen voor nucleofection. Centrifugeer bij 225 x g gedurende 5 min. Verwijder supernatant volledig.
  2. Reagenspreparaat en nucleofection
    1. Bereid nucleofectorreagens door 0,5 ml supplement en 2,25 ml nucleofectoroplossing (beide in de kit aanwezig) te mengen.
    2. Voeg 100 μL nucleofectoroplossing toe in een buis van 1,5 ml. Voeg 1μg elk van pCXLE-hOCT3/4-shp53-F, pCXLE-hSK en pCXLE-hUL toe aan de buis. Resuspend 106 cellen (vanaf stap 3.1.2) voorzichtig in deze mix.
    3. Breng de cel-DNA-suspensie over in cuvette en zorg ervoor dat het monster de bodem van de cuvette (meegeleverd in de kit) bedekt zonder luchtbellen. Sluit de cuvette af en steek deze in de houder. Selecteer het nucleofectorprogramma U-23 (voor hoge efficiëntie) en pas het toe.
    4. Verwijder cuvette uit de houder en voeg 1 ml complete media toe. Breng de inhoud voorzichtig over in een met weefselkweek behandelde petrischaal van 60 mm gevuld met 4 ml volledige media (tot een totaal van 5 ml media). Incubeer de cellen in een bevochtigde CO2-incubator bij 37 °C.
    5. Controleer na 24 uur of de cellen zich hebben gehecht. Vervang het medium volledig.
      OPMERKING: De snelheid van celdood is hoog in nucleofection waardoor er weinig levensvatbare cellen overblijven die zich hechten.
    6. Houd de cellen gedurende 10 dagen in volledige media en schakel de komende 20 dagen over op pluripotentiemedia.
      OPMERKING: Visualiseer cellen regelmatig om morfologische veranderingen te volgen die optreden in de herprogrammeringscellen (zoals epitheliale morfologie en compacte kolonievorming) om te bevestigen of het experiment werkt. Ongeveer 25 iPSC-kolonies zijn te zien na 20 dagen cultuur in pluripotentiemedia.

4. Plukken en vermeerderen van iPSC-kolonies

  1. Kolonie plukken van herprogrammeerplaat
    1. Ontleed handmatig de embryonale stamcelachtige kolonies die in de herprogrammeringsschaal zijn gevormd met behulp van getrokken glazen pipetten of spuitnaalden van 1 ml en breng over naar een eerder bereide plaat met geïnactiveerde embryonale fibroblastvoeders van muizen met pluripotentiemedium of breng feedervrije culturen tot stand op matrigel-gecoate platen met mTESR-medium.
      OPMERKING: Muisembryotische fibroblasten (MEF's) werden afgeleid met behulp van enzymatische isolatie van muizenembryo's (ontleed van 13-14 dagen zwangere vrouwelijke muizen) en werden mitotisch geïnactiveerd door mitomycine C-behandeling. Stel enkele kloonpopulaties in door enkele kolonies te laten groeien van herprogrammeerplaat in afzonderlijke schotels of gemengde kloonpopulaties door veel kolonies over te brengen van herprogrammeerplaat naar een enkele schaal.
  2. Mechanische overdracht van opkomende kolonies naar verse feeders en passaging om stabiele iPSC's te vestigen
    1. Vermeerder iPSC's in pluripotentiemedium door elke tweede dag te voeren en splits 1:3 om de 5-7 dagen. Bereid voorraden door cryopreserving in een vriesmix van KnockOut Serum Replacement en DMSO in de verhouding 9:1.
      OPMERKING: KnockOut Serum Replacement wordt gebruikt in de vriesmix voor cryopreservatie van iPSC's in plaats van FBS, omdat componenten in de FBS differentiatie van de pluripotente cellen kunnen induceren tijdens langdurige conservering.

5. Karakterisering van iPSC's

OPMERKING: Karakteriseringsstudies inclusief PCR en immunostaining voor pluripotentiebiomarker werden uitgevoerd na het vijfde passagenummer. Karyotypering werd uitgevoerd op een later passagenummer.

  1. Karyotypering
    1. Behandel een samenvloeiend petrischaaltje van 60 mm van iPSC's met colcemid gedurende 45 minuten in een bevochtigde CO2-incubator bij 37 °C.
    2. Oogst met 0,05% trypsine behandeling en centrifuge. Verwijder het supernatant en pipetteer de overgebleven sporen van medium om de celkorrel los te maken.
    3. Voeg 5 ml hypotone oplossing toe. Meng door de buis om te keren en incubeer gedurende 20 minuten bij 37 °C. Centrifugeer bij 225 x g gedurende 5 min.
      OPMERKING: De verkregen pellet moet er luchtig uit zien.
    4. Voeg langzaam 2,5 ml Fixatieve oplossing van Carnoy toe terwijl u tikt om de pellet los te maken.
    5. Bereid spreads voor karyotypering voor door de celsuspensie op schone glasglaasjes te laten vallen.
    6. Behandel de dia's gedurende 1 minuut met 0,15% trypsine en was ze eenmaal met PBS. Vervolgens beitsen met Giemsa-oplossing gedurende 4 minuten en eindigen met een gedestilleerde waterwassing. Aanschaffen en verwerken met de juiste software.
  2. Bewijs van de transgene vrije status
    1. Genomische DNA-isolatie
      1. Pipetteer 20 μL protease in de bodem van een microcentrifugebuis van 1,5 ml.
      2. Voeg 200 μL TSiPSCs geresuspendeerd in PBS toe aan de microcentrifugebuis.
      3. Voeg 200 μL Buffer AL toe aan het monster en meng gedurende 15 s door puls-vortexing.
      4. Incubeer gedurende 10 min bij 56 °C.
      5. Centrifugeer de microcentrifugebuis kort om druppels van de binnenkant van het deksel te verwijderen.
      6. Voeg 200 μL ethanol (96-100%) toe aan het monster en meng opnieuw gedurende 15 s door pulsvortexing. Centrifugeer na het mengen kort de buis om druppels van de binnenkant van het deksel te verwijderen.
      7. Breng het mengsel uit de vorige stap voorzichtig aan op de mini-spinkolom (in een opvangbuis van 2 ml) zonder de rand nat te maken. Sluit de dop en centrifugeer gedurende 1 minuut bij 6000 x g. Gooi de buis met het filtraat weg en plaats de mini-spinkolom in een schone opvangbuis van 2 ml.
      8. Open voorzichtig de mini-spinkolom en voeg zonder de rand nat te maken 500 μL Buffer AW1 toe. Sluit de dop en centrifugeer gedurende 1 min op 6000 x g. Plaats de mini-spinkolom in een schone opvangbuis van 2 ml en gooi de opvangbuis met het filtraat weg.
      9. Open voorzichtig de mini-spinkolom en voeg 500 μL Buffer AW2 toe zonder de velg nat te maken. Sluit de dop en centrifugeer op volle snelheid (20.000 x g) gedurende 3 minuten.
      10. Plaats de mini-spinkolom in een nieuwe opvangbuis van 2 ml en gooi de oude opvangbuis weg met het filtraat. Centrifugeer op volle snelheid gedurende 1 minuut om de kans op mogelijke buffer AW2-overdracht te elimineren.
      11. Plaats de mini-spinkolom in een schone microcentrifugebuis van 1,5 ml en gooi de opvangbuis met het filtraat weg. Open voorzichtig de mini-spinkolom en voeg 200 μL buffer AE of gedestilleerd water toe. Incubeer bij kamertemperatuur (15-25 °C) gedurende 5 minuten en centrifugeer vervolgens gedurende 1 min bij 6000 x g.
    2. Transgene-Free Status PCR (met kapa hifi pcr kit kr0368)
      1. Zorg ervoor dat alle reagentia goed worden ontdooid en gemengd.
      2. Bereid een PCR-mastermix met het juiste volume van alle reactiecomponenten op basis van tabel 2 (stel reacties in op ijs).
      3. Breng de juiste volumes PCR-mastermix, sjabloon en primer over naar afzonderlijke PCR-buizen.
      4. Bep afzonderlijke reacties, meng en centrifugeer kort.
      5. Voer PCR uit volgens tabel 3.
  3. Pluripotentie biomarker identificatie
    1. Alkalische fosfatase (AP) kleuring
      1. Bereid een 1x AP live vlek werkoplossing door 3 μL 500x stockoplossing te verdunn in 1,5 ml DMEM/F-12 voor elke 10 cm2 kweekoppervlak.
      2. Verwijder het medium uit de iPSC kweekschaal. Was de kweek eenmaal met DMEM/F-12. Voeg de 1x AP live stain oplossing toe aan de iPSC's. Incubeer bij 37 °C gedurende 45 min.
      3. Verwijder de AP-vlek en was tweemaal met DMEM/F-12. Voeg verse DMEM /F-12 toe en beeld onder fluorescentiemicroscoop met behulp van een standaard FITC-filter binnen 30-90 minuten na kleuring.
    2. Immunostaining voor pluripotentie biomarkers
      1. Fixeer confluente iPSC-culturen met 4% paraformaldehyde gedurende de nacht bij 4 °C. Was driemaal met PBS Tween 20 (PBST), elke was gedurende 5 minuten.
      2. Permeabiliseer de cellen met 0,3% Triton X-100 in PBST gedurende 15 minuten bij kamertemperatuur. Driemaal wassen met PBST.
        OPMERKING: Permeabilisatie mag alleen worden uitgevoerd voor intracellulaire antigenen.
      3. Blokcellen met 3% runderserumalbumine (BSA) in PBST gedurende 30 minuten bij kamertemperatuur. Kleur de cellen 's nachts met primaire antilichamen (verdund 1:1000 in 1% BSA). Na primaire antilichaamincubatie, driemaal wassen met PBST.
      4. Incubateer cellen met het secundaire antilichaam (verdund 1:1000 in 1% BSA) gedurende 5 uur bij kamertemperatuur. Driemaal wassen met PBST.
      5. Label de kernen met 0,5 μg/ml 4',6-diamidino-2-fenylindool (DAPI) gedurende 1 minuut. Was de cellen eenmaal met PBST.
      6. Leg beelden vast onder een fluorescerende microscoop.

6.In vitro differentiatietests

  1. Embryoïde Lichaam (EB) Differentiatie
    1. Snijd de iPSC-kolonies in kleine stukjes, verzamel en plaats in petrischalen met lage aanhechting in embryoïde lichaamsmedium. Laat de cellen 15 dagen groeien door het medium om de 3 dagen te vervangen.
      OPMERKING: De dag 15 EB's kunnen direct worden gebruikt voor de detectie van de drie kiemlaag biomarkers. Als alternatief kunnen specifieke celstammen worden geïnduceerd met groeifactoren, gevolgd door biomarkerdetectie.
  2. Endoderm (Hepatocyte) differentiatie
    1. Kweek de iPSC's in monolaagculturen in pluripotentiemedium.
    2. Eenmaal confluent, schakel over naar RPMI 1640 media met 1x insuline transferrine seleniet en 100 ng / ml activine A gedurende 2 dagen, gevolgd door groei in RPMI 1640 media met 30 ng / ml bFGF en 20 ng / ml BMP4 gedurende 9 dagen. Vervang medium om de 2 dagen.
    3. Vul vanaf dag 10 media aan met 0,1 μM dexamethason. Beëindig het experiment op dag 20.
  3. Mesoderm (Cardiomyocyte) differentiatie
    1. Plaat dag 8 EB's op 0,5% Matrigel-gecoate platen in embryoïde lichaamsmedium. Laat de EB's worden bevestigd en samenvouwen.
    2. Vul media aan met 20 ng / ml BMP4 en groei gedurende 20 dagen. Vervang medium elke 2-3 dagen. Beëindig het experiment op dag 20.
  4. Ectoderm (Neuronale) differentiatie
    1. Plaat dag 4 EB's op 2 μg/cm2 collageen type IV-gecoate platen in embryoïde lichaamsmedium. Laat de EB's worden bevestigd en samenvouwen.
    2. Verschuif de volgende dag medium naar DMEM F-12 met 2 mg / ml glucose, 1x insulinetransferrineseleniet en 2,5 μg / ml fibronectine. Beëindig het experiment op dag 15.
  5. Vorming van cerebrale organoïden
    1. Kweek TSiPSCs in een 35 mm weefselkweekschaal op MEF's tot 70-80% confluent. Snijd de kolonies en verzamel in een buis van 15 ml. Centrifugeer de cellen gedurende 5 minuten bij 225 x g. Gooi het supernatant weg.
    2. Was de stukjes kolonies door resuspending in 2 ml PBS en centrifugeer om het supernatant te verwijderen.
    3. Voeg 1 ml 0,05% trypsine toe en tik op de buis om de cellen los te maken. Incubeer de buis bij 37 °C gedurende 3-4 minuten om de koloniestukken te dissociëren in een eencellige suspensie.
    4. Neutraliseer de trypsine door verdunning met 4 ml pluripotentiemedia die 10 μg /ml rho-geassocieerd eiwitkinase (ROCK) -remmer Y-27632 dihydrochloride (ROCKi) bevatten om dissociatie geïnduceerde celdood te voorkomen.
    5. Centrifugeer om een pellet te verkrijgen. Gooi het supernatant weg en resuspend de cellen in 2 ml embryoïde lichaamsmedium met 10 μg / ml ROCKi.
    6. Verwijder 10 μL celsuspensie voor het tellen van cellen. Voeg 10 μL Trypan blue toe om dode cellen te detecteren. Tel de cellen met behulp van een hemocytometer.
    7. Voeg het juiste volume embryoïde lichaamsmedium met ROCKi toe aan de celsuspensie om 9.000 levende cellen per 150 μL te verkrijgen.
    8. Plaat 150 μL in elke put van een laag-aanbouwplaat met 96 putten en incubeer in een bevochtigde CO2-incubator bij 37 °C. Controleer de platen na 24 uur op aggregatie. Verwijder op dag 2 voorzichtig het medium en vervang het door vers embryoïde medium zonder ROCKi.
    9. Breng op dag 6 EB's over naar putten van een laag aanbouwmiddel 24 putplaat met 500 μL neuraal inductiemedium bestaande uit DMEM-F12 met 1% N2-supplement, 2 mM GlutaMAX-supplement en 1 mM niet-essentiële aminozuren en 1 μg / ml heparine. Vervang het medium om de 2 dagen.
    10. Na 5 dagen in neuraal inductiemedium worden de neuro-epitheliale aggregaten in Matrigel ingesloten door een 2 cm x 2 cm vierkant parafilm over een lege tiplade van 200 μL-uiteinden te leggen. Druk parafilm met gehandschoende vingers over elk gaatje in de puntlade om kleine deukjes te maken. Reinig parafilm met 70% ethanol om te steriliseren.
    11. Breng het parafilm vierkant over in een schaal van 60 mm. Gebruik gesneden 200 μL tips om de neuro-epitheliale aggregaten over te brengen op de deuken in parafilm. Verwijder overtollig medium door te pipetteren.
    12. Voeg 30 μL ontdooide Matrigel toe aan de neuro-epithliale aggregaten en plaats het aggregaat in het midden van de Matrigel met behulp van een pipetpunt. Plaats de 60 mm schaal gedurende 20-30 minuten in een incubator van 37 °C om de Matrigel te polymeriseren.
    13. Voeg 5 ml cerebrale organoïde differentiatiemedium toe, bestaande uit 1:1 DMEM-F12: Neurobasaal medium, 0,5% N2-supplement, 2,5 μg / ml insuline, 2 mM GlutaMAX-supplement, 0,5 mM NEAA, 1% B27-supplement en 2,5 ml penicilline-streptomycine.
    14. Draai met een steriele tang het parafilmvel om en roer de schaal totdat de matrigel ingebedde aggregaten van het vel in het medium vallen. Kweek de ingebedde aggregaten in een bevochtigde CO2-incubator bij 37 °C gedurende 4 dagen, waarbij de media op verschillende dagen worden ververst.
    15. Plaats na 4 dagen statische cultuur de 60 mm schotels op een orbitale shaker die in de incubator is geïnstalleerd en schudt bij 50 tpm. Kweek de organoïden gedurende 3 maanden en geef elke 3 dagen volledige mediaveranderingen met cerebrale organoïde differentiatiemedium.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Resultaten

Generatie van integratievrije iPSC's van een spontaan geaborteerde foetus met 45XO karyotype
We isoleerden fibroblasten uit FCV met een turnersyndroom (TS) specifiek 45XO karyotype en nucleofecteerden ze met episomale herprogrammeringsplasmiden om TSiPSCs te genereren die kunnen worden gebruikt voor downstream modellering van het syndroom, met name de geassocieerde neurologische tekorten (Figuur 1a&b). We gebruikten niet-integrerende episomale vectoren en...

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Discussie

Het genereren van stabiele cellulaire modellen van cytogenetisch abnormaal foetaal weefsel is noodzakelijk voor het bestendigen van een defect fenotype. De iPSC-route is de meest effectieve methode voor celvoorbereiding voor eeuwigdurend behoud van defecte eigenschappen20.

Pluripotente stamcellen (PSC) vertonen eigenschappen van zelfvernieuwing en differentiatie in gespecialiseerde cellen die doen denken aan vroege splitsingsembryo's21. Vandaar d...

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Openbaarmakingen

De auteurs hebben niets te onthullen.

Dankbetuigingen

Financiële steun voor het bovenstaande onderzoek werd verstrekt door Manipal Academy of Higher Education. De karakterisering van de lijn werd gedeeltelijk uitgevoerd in het laboratorium van M.M. Panicker bij NCBS. Wij danken Anand Diagnostic Laboratory voor hulp bij karyotypering.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel
NaamBedrijfCatalogusnummerOpmerkingen
0.15% trypsinThermo Fisher Scientific27250018G Banding
2-mercaptoethanolThermo Fisher Scientific21985023Pluripotency and Embryoid body medium
4', 6 diamidino-2-phenylindoleSigma AldrichD8417Immunocytochemistry
Activine ASigma AldrichSRP3003Differentiation assays
Alkaline Phosphatase Live StainThermo Fisher ScientificA14353AP staining
AMAXA Nucleofector IILonza-Nucleofection
AmnioMAX II complete mediaThermo Fisher Scientific, Gibco11269016Medium specific for foetal chorionic villi cell cultures
AmpicillinHiMediaTC021Plasmid purification
Anti Mouse IgG (H+L) Alexa Fluor 488InvitrogenA11059Immunocytochemistry
Anti Rabbit IgG (H+L) Alexa Fluor 488InvitrogenA11034Immunocytochemistry
Anti Rabbit IgG (H+L) Alexa Fluor 546InvitrogenA11035Immunocytochemistry
Antibiotic-AntimycoticThermo Fisher Scientific, Gibco15240096Contamination control
Anti-E-CadherinBD Biosciences610181Immunocytochemistry
Anti-NanogBD Biosciences560109Immunocytochemistry
Anti-OCT3/4BD Biosciences611202Immunocytochemistry
Anti-SOX17BD Biosciences561590Immunocytochemistry
Anti-SOX2BD Biosciences561469Immunocytochemistry
Anti-SSEA4BD Biosciences560073Immunocytochemistry
Anti-TRA 1-81MilliporeMAB4381Immunocytochemistry
Basic Fibroblast Growth Factor[FGF2]Sigma AldrichF0291Pluripotency medium
Bone Morphogenetic Factor 4Sigma AldrichSRP3016Differentiation assays
Bovine Serum AlbuminSigma AldrichA3059Blocking
Collagen Human Type IVBD Biosciences354245Differentiation assays
Collagenase blendSigma AldrichC8051Digestion of foetal chorionic villi
DexamethasonSigma AldrichD4902Differentiation assays
DMEM F12Thermo Fisher Scientific11320033Differentiation assays
FastDigest EcoR1Thermo ScientificFD0274Restriction digestion
FibronectinSigma AldrichF2518Differentiation assays
Giemsa StainHiMediaS011G Banding
Glacial Acetic AcidHiMediaAS001Fixative for karyotyping
GlucoseSigma AldrichG7528Differentiation assays
GlutaMAXThermo Fisher Scientific35050061Pluripotency and Embryoid body medium
Heparin sodiumSigma AldrichH3149Differentiation assays
Insulin solution humanSigma AldrichI9278Differentiation assays
Insulin Transferrin SeleniteSigma AldrichI1884Differentiation assays
KAPA HiFi PCR kitKapa BiosystemsKR0368OriP, EBNA1 PCR
KaryoMAX ColcemidThermo Fisher Scientific15210040Mitotic arrest for karyotyping
KnockOut DMEMThermo Fisher Scientific10829018Pluripotency and Embryoid body medium
KnockOut Serum ReplacementThermo Fisher Scientific10828028Pluripotency and Embryoid body medium
Luria Bertani agarHiMediaM1151FPlasmid purification
MatrigelBD Biosciences356234Differentiation assays
MEM Non-essential amino acidsThermo Fisher Scientific11140035Pluripotency and Embryoid body medium
MethanolHiMediaMB113Fixative for karyotyping
Myosin ventricular heavy chain α/βMilliporeMAB1552Immunocytochemistry
NHDF Nucleofector KitLonzaVAPD-1001Nucleofection
Paraformaldehyde (PFA)Sigma AldrichP6148Fixing cells
pCXLE-hOCT3/ 4-shp53-FAddgene27077Episomal reprogramming Plasmid
pCXLE-hSKAddgene27078Episomal reprogramming Plasmid
pCXLE-hULAddgene27080Episomal reprogramming Plasmid
Penicillin StreptomycinThermo Fisher Scientific,15070063Pluripotency and Embryoid body medium
Phalloidin- Tetramethylrhodamine B isothiocyanateSigma AldrichP1951Immunocytochemistry
Phosphate buffered salineSigma AldrichP44171 X PBS 1 tablet of PBS dissolved in 200mL of deionized water and sterilized by autoclaving
Storage: Room temperature.
PBST- 0.05% Tween 20 in 1X PBS.
Storage: Room temperature.
Plasmid purification Kit- Midi prepQIAGEN12143Plasmid purification
Potassium Chloride SolutionHiMediaMB043Hypotonic solution for karyotyping
QIAamp DNA Blood KitQiagen51104Genomic DNA isolation
RPMI 1640Thermo Fisher Scientific11875093Hepatocyte differentiation medium
Sodium CitrateHiMediaRM255Hypotonic solution for karyotyping
Triton X-100HiMediaMB031Permeabilisation
Trypsin-EDTA (0.05%)Thermo Fisher Scientific, Gibco25300054Subculture of foetal chorionic villi fibroblasts
Tween 20HiMediaMB067Preparation of PBST
β III tubulinSigma AldrichT8578Immunocytochemistry
Y-27632 dihydrochlorideSigma AldrichY0503Differentiation assays

Referenties

  1. Verlinsky, Y., et al. Human embryonic stem cell lines with genetic disorders. Reproductive BioMedicine Online. 10, 105-110 (2005).
  2. Eiges, R., et al. Developmental Study of Fragile X Syndrome Using Human Embryonic Stem Cells Derived from Preimplantation Genetically Diagnosed Embryos. Cell Stem Cell. 1, 568-577 (2007).
  3. Biancotti, J. -C., et al. Human Embryonic Stem Cells as Models for Aneuploid Chromosomal Syndromes. STEM CELLS. 28, 1530-1540 (2010).
  4. Li, W., et al. Modeling abnormal early development with induced pluripotent stem cells from aneuploid syndromes. Human Molecular Genetics. 21, 32-45 (2012).
  5. Gravholt, C. H., Viuff, M. H., Brun, S., Stochholm, K., Andersen, N. H. Turner syndrome: mechanisms and management. Nature Reviews Endocrinology. 15, 601-614 (2019).
  6. Luo, Y., et al. Uniparental disomy of the entire X chromosome in Turner syndrome patient-specific induced pluripotent stem cells. Cell Discovery. 1, 15022(2015).
  7. Luo, Y., et al. Generation of an induced pluripotent stem cell line from an adult male with 45,X/46,XY mosaicism. Stem Cell Research. 27, 42-45 (2018).
  8. Parveen, S., Panicker, M. M., Gupta, P. K. Generation of an induced pluripotent stem cell line from chorionic villi of a Turner syndrome spontaneous abortion. Stem Cell Research. 19, (2017).
  9. Takahashi, K., et al. Induction of Pluripotent Stem Cells from Adult Human Fibroblasts by Defined Factors. Cell. 131, 861-872 (2007).
  10. Soldner, F., et al. Parkinson's Disease Patient-Derived Induced Pluripotent Stem Cells Free of Viral Reprogramming Factors. Cell. 136, 964-977 (2009).
  11. Somers, A., et al. Generation of Transgene-Free Lung Disease-Specific Human Induced Pluripotent Stem Cells Using a Single Excisable Lentiviral Stem Cell Cassette. STEM CELLS. 28, 1728-1740 (2010).
  12. Woltjen, K., et al. piggyBac transposition reprograms fibroblasts to induced pluripotent stem cells. Nature. 458, 766-770 (2009).
  13. Stadtfeld, M., Nagaya, M., Utikal, J., Weir, G., Hochedlinger, K. Induced Pluripotent Stem Cells Generated Without Viral Integration. Science. 322, 945-949 (2008).
  14. Fusaki, N., Ban, H., Nishiyama, A., Saeki, K., Hasegawa, M. Efficient induction of transgene-free human pluripotent stem cells using a vector based on Sendai virus, an RNA virus that does not integrate into the host genome. Proceedings of the Japan Academy, Series B. 85, 348-362 (2009).
  15. Warren, L., et al. Highly Efficient Reprogramming to Pluripotency and Directed Differentiation of Human Cells with Synthetic Modified mRNA. Cell Stem Cell. 7, 618-630 (2010).
  16. Kim, D., et al. Generation of human induced pluripotent stem cells by direct delivery of reprogramming proteins. Cell Stem Cell. 4, 472-476 (2009).
  17. Yu, J., et al. Human Induced Pluripotent Stem Cells Free of Vector and Transgene Sequences. Science. 324, 797-801 (2009).
  18. Okita, K., et al. A more efficient method to generate integration-free human iPS cells. Nature Methods. 8, 409-412 (2011).
  19. Martí, M., et al. Characterization of pluripotent stem cells. Nature Protocols. 8, 223-253 (2013).
  20. Avior, Y., Sagi, I., Benvenisty, N. Pluripotent stem cells in disease modelling and drug discovery. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 17, 170-182 (2016).
  21. Ambartsumyan, G., Clark, A. T. Aneuploidy and early human embryo development. Human Molecular Genetics. 17, 10-15 (2008).
  22. Lancaster, M. A., Knoblich, J. A. Generation of cerebral organoids from human pluripotent stem cells. Nature Protocols. 9, 2329-2340 (2014).

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Herprints en machtigingen

Tags

Chromosomale aneuploïdieiPSC-generatieepisomale herprogrammeringfibroblastisolatiepluripotentiemarkersvorming van embryoïde lichaampjeskiemblad-differentiatieneurocognitieve tekorten
Generatie van geïnduceerde pluripotente stamcellen van het syndroom van Turner (45XO) foetale cellen voor downstream modellering van neurologische tekorten geassocieerd met het syndroom
Neem contact met ons op
Aanbevelen aan de bibliotheek

Privacy

Gebruiksvoorwaarden

Beleidsoverzicht

Copyright © 2026 MyJoVE Corporation. Alle rechten voorbehouden.