Methodenartikel

Detectie van amyloïde-β accumulatie via immunofluorescerende kleuring in een muismodel van de ziekte van Alzheimer

DOI:

10.3791/62254

⸱

19 april 2021

 ,  ,  ,  ,  , 
1Jiangsu Province Key Laboratory of Anesthesiology, Jiangsu Province Key Laboratory of Anesthesia and Analgesia Application Technology and NMPA Key Laboratory for Research and Evaluation of Narcotic and Psychotropic Drugs, Xuzhou Medical University

* These authors contributed equally

In dit artikel

Samenvatting

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

In de neuropathologie van de ziekte van Alzheimer is een van de meest cruciale kenmerken de afzetting van amyloïde-β. In dit protocol beschrijven we de methode van immunofluorescerende kleuring in 5×FAD transgene muizen om amyloïde-β accumulatie in plaques te detecteren. Het proces van perfusie, cryosectie, kleuring en kwantificering zal in detail worden beschreven.

Samenvatting

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

De ziekte van Alzheimer (AD) is een neurodegeneratieve ziekte die bijdraagt aan 60-70% dementie over de hele wereld. Een van de kenmerken van AD ligt ongetwijfeld in de accumulatie van amyloïde-β (Aβ) in de hersenen. Aβ wordt geproduceerd uit de proteolytische splitsing van het bèta-amyloïde voorlopereiwit (APP) door β-secretase en γ-secretase. In pathologische omstandigheden leidt de verhoogde β-splitsing van APP tot overproductie van Aβ, dat samenklontert tot Aβ-plaques. Aangezien Aβ-plaques een kenmerk zijn van AD-pathologie, is het detecteren van de hoeveelheid Aβ erg belangrijk in AD-onderzoek. In dit protocol introduceren we de immunofluorescerende kleuringsmethode om Aβ-afzetting te visualiseren. Het muismodel dat in onze experimenten wordt gebruikt, is 5×FAD, dat vijf mutaties draagt die worden aangetroffen in menselijke familiale AD. De neuropathologische en gedragsstoornissen van 5xFAD-muizen zijn goed gedocumenteerd, waardoor het een goed diermodel is om Aβ-pathologie te bestuderen. We zullen de procedure introduceren, inclusief transcardiale perfusie, cryosectie, immunofluorescerende kleuring en kwantificering om Aβ-accumulatie bij 5×FAD-muizen te detecteren. Met dit protocol kunnen onderzoekers Aβ-pathologie onderzoeken in een AD-muismodel.

Inleiding

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

De ziekte van Alzheimer (AD) is een neurodegeneratieve ziekte die wereldwijd 60%-70% dementie veroorzaakt en veel sociale middelen kost1. Het is bekend dat accumulatie van amyloïde-β (Aβ) een pathologisch kenmerk is bij de ziekte van Alzheimer. Amyloïde voorlopereiwit (APP) is een integraal membraaneiwit dat in veel weefsels voorkomt. Aβ-peptide, bestaande uit 36-42 aminozuren2, wordt geproduceerd door de daaropvolgende splitsing van β- en γ-secretase in APP 3,4. Veranderingen in APP-splitsing en mutaties in het APP-gen leiden tot overproductie van Aβ. Aβ-moleculen kunnen samenklonteren om oligomeren of fibrillen te vormen, waarvan wordt aangenomen dat ze neurotoxisch zijn 5,6. In eerdere studies werd aangetoond dat de accumulatie van Aβ gecorreleerd was met neuronale dood inAD 7,8,9.

De 5×FAD (C57BL/6J) transgene muizen bevatten 3 mutaties in APP en 2 mutaties in PSEN1. De accumulatie van intracellulair Aβ begint al op de leeftijd van 1,5 maand. Extracellulaire accumulatie van Aβ werd ongeveer 2 maanden gevonden in de cortex en de hippocampus. De accumulatie nam snel toe met de leeftijd van10 jaar. De goed gedocumenteerde Aβ-pathologie maakt het een goed diermodel voor ons protocol.

Het doel van de beschreven kleuringsmethode is het visualiseren en kwantificeren van Aβ-afzetting in de hersenen van AD-muizen. De procedure, inclusief transcardiale paraformaldehydeperfusie, cryosectie, immunofluorescerende kleuring en kwantificering om Aβ-accumulatie bij 5×FAD-muizen te detecteren, zal worden geïntroduceerd. Dit protocol is een betrouwbare en gemakkelijke methode om Aβ-pathologie in AD-muismodel te onderzoeken.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Alle experimentele procedures werden uitgevoerd met de goedkeuring van het Institutional Animal Care and Use Committee van de Xuzhou Medical University en in overeenstemming met de richtlijnen van de Chinese overheidsvoorschriften voor de verzorging en het gebruik van proefdieren.

1. Perfusie van muizen

OPMERKING: Meer details van de perfusieprocedure kunnen verwijzen naar de video van Wiliam Shain's lab 11.

  1. Verdoving 5×FAD (C57BL/6J) transgene muizen met 1% pentobarbitalnatrium (50 mg/kg lichaamsgewicht) door intraperitoneale injectie12,13. Verlies van respons op knijpen van de achterpoot duidt op een juiste verdoving. Begin niet met perfusie voordat de muis goed is verdoofd.
  2. Gebruik vier pinnen om de ledematen op de polyfoam plank te bevestigen. Zet de buik van de verdoofde muis omhoog, met de ledematen voldoende gestrekt. Gebruik een irisschaar om een incisie te maken bij het xiphoid-proces. Dan wordt het middenrif belicht.
  3. Gebruik een chirurgische schaar om een incisie in het middenrif te maken en ga voorzichtig door met de incisie in het middenrif tot aan de bovengrens van de ribbenkast. Snijd de ribben en thoracale spieren, ontleed de aangehechte weefsels om het hart bloot te leggen.
  4. Zoek het juiste atrium van de muis. Knip het rechter atrium open met een irisschaar.
  5. Injecteer 20 ml 37 °C PBS (0,01 M, pH 7,2-7,4) uit de linker hartkamer om het bloed weg te spoelen. Injecteer vervolgens langzaam 20 ml 4% PFA kamertemperatuur uit de linkerventrikel om de weefsels te fixeren. De injectiesnelheid van PBS en 4% PFA is ongeveer 5 ml/min. Fixatietremoren moeten binnen enkele seconden worden waargenomen.
    LET OP: 4% PFA kan ogen en luchtwegen irriteren en allergische reacties veroorzaken. Deze stap moet worden uitgevoerd op geventileerde plaatsen en de bediener moet een veiligheidsbril en gezichtsmaskers dragen.
  6. Gebruik een chirurgische schaar om het hoofd af te knippen en verwijder voorzichtig de schedel, gebruik een ontleedtang en extraheer de hersenen. Dompel de hersenen vervolgens onder in 4 ml 4% PFA in een plastic tube van 5 ml gedurende 12-24 uur bij 4 °C.

2. Inbedding en cryosectie

  1. Na fixatie in 4% PFA, breng de hersenen over in 4 ml 15% sucrose in een plastic tube van 5 ml bij 4 °C. Na 12-24 uur zouden de hersenen naar de bodem moeten zinken.
  2. Breng de hersenen over in 4 ml 30% sucrose in een plastic tube van 5 ml bij 4 °C gedurende 12-24 uur. Dan is het brein klaar om in te bedden. Het doel van 15% en 30% sucrose stapsgewijs weken is om de hersenen uit te drogen, waardoor de vorming van ijskristallen in de cellen tijdens inbedding en cryosectie wordt voorkomen. De uitgedroogde hersenen kunnen een week lang bij 4°C worden bewaard.
  3. Laat ongeveer 1 ml sucrose met de hersenen in de buis. Voeg vervolgens hetzelfde volume optimale snijtemperatuur (OCT) compound toe aan de tube en meng goed. Dit helpt OCT-verbinding om de hersenen beter in te pakken.
  4. Monteer een dikke laag OCT-verbinding op het knopoppervlak en vries in bij -21 °C voordat u gaat cryosectieren. Snijd de hersenen sagitaal vanuit het midden; Gebruik beide helften voor secties in een cryostaat.
  5. Nadat de OCT-verbinding is gestold, monteert u de knop op de samplekop en snijdt u deze bij tot een platformoppervlak. Leg de ene helft van de hersenen op het bijgesneden oppervlak met de middelste kant naar beneden.
  6. Plaats een aluminiumfoliering om de hersenen om lekkage van OCT-verbinding te voorkomen en vul de ring vervolgens met OCT-verbinding totdat de hersenen zijn ondergedompeld. Wanneer de inbedding van OCT-verbindingen stolt, is het klaar om te worden doorgesneden.
  7. Stel de dikte van de sectie in op 20 μm. Stel de kamertemperatuur in op -21 °C en de temperatuur van de kop op -19 °C. Snijd de hersenen van het rostrale uiteinde naar het caudale uiteinde.
  8. Borstel wat PBS op de glaasjes. Lak de glasplaatjes voor met poly-lysine om te voorkomen dat de secties loskomen. Bevestig het gedeelte op de dia. Als de sectie is gevouwen, gebruik dan een zachte borstel om de secties uit te vouwen met PBS.
  9. Droog de partjes een nacht bij kamertemperatuur en bewaar ze bij -20 °C. Secties kunnen tot een maand bij -20 °C worden bewaard voordat ze worden gekleurd.

3. Aβ Procedure voor het aanbrengen van kleuringen

  1. Warm de secties op kamertemperatuur op, droog het diaoppervlak af en gebruik een hydrofobe pen om een cirkel rond de sectie te tekenen voor incubatie van antilichamen.
  2. Week de dia in PBS in een plastic kleurdoos van 30 ml om OCT-massa af te wassen. Gebruik minimaal 20 ml PBS.
  3. Voeg 100 μL 1x antigeenoplossing voor bevroren secties toe aan het objectglaasje. Incubeer gedurende 5 minuten bij kamertemperatuur.
  4. Was de ophaaloplossing met ten minste 20 ml PBS kamertemperatuur gedurende 3 keer (5 minuten voor elk).
  5. Voeg verdund primair antilichaam (6E10) toe op de secties en incubeer bij 4 °C gedurende 16-24 uur in een natte, donkere doos (primaire antilichaamverdunningsoplossing: 1% BSA, 0,3% Triton X-100, 0,01% natriumazide in PBS, 1:500 verdunning). BSA fungeert als blokkeringsmiddel.
  6. Was de secties 3 keer met PBS, telkens 5 minuten.
    OPMERKING: Voer stap 3.7, 3.8 en 3.9 uit op een donkere plaats.
  7. Incubeer secties in secundaire antilichaamoplossing (Geit anti-Muis IgG (H+L) Alexa Flour 594, verdund met PBS 1:200) gedurende 1 uur bij kamertemperatuur in een natte, donkere doos.
  8. Was het secundaire antilichaam van de secties met ten minste 20 ml PBS gedurende 3 keer, elke keer 5 minuten.
    OPMERKING: Giet PBS tijdens het wassen niet op secties om te voorkomen dat secties loskomen. Houd de secties nat.
  9. Absorbeer de vloeistof rond secties en voeg een druppel montagemedium toe op elke sectie. Dicht de secties af met dekglas en vermijd luchtbellen.
  10. Bekijk de bevlekte delen met een fluorescentiemicroscoop. Houd de beeldvormingsparameters consistent om afleiding te voorkomen. Bewaar de glaasjes op een donkere plaats op 4°C. Analyseer de secties binnen een week, omdat de vlekken na verloop van tijd zullen vervagen.

4. Beeldvorming en kwantificering van Aβ-accumulatie door ImageJ

  1. Leg beelden vast met een fluorescentiemicroscoop die is aangesloten op een digitale camera en beeldvormingssoftware. We gebruikten Image Pro Plus-software en de beeldvormingsparameter was als volgt ingesteld: Exp Pvw: 450 ms, Exp Acq: 450 ms; Pvw: 1 × 1, Acq: 1 × 1; Pvw-resolutie: Breedte 1 × Hoogte 1, Acq Resolutie: Breedte 1 × Hoogte 1; Opnamediepte: 8-bits mono; Versterking: Pvw: 13, Acq: 13, Gamma: Pvw: 1, Acq: 1, Offse: Pvw: -700, Acq: -700.
  2. Selecteer in ImageJ Fiji 2.0.0 (https://imagej.net/Fiji) de optie Plug-ins | Stikken | MosaicJ in het menu. Selecteer vervolgens Bestanden | Open Afbeeldingsreeks om de te naaien afbeeldingen te openen (Afbeelding 1A).
  3. Alle geselecteerde afbeeldingen worden onderaan weergegeven. Nadat u de afbeeldingen handmatig hebt samengevoegd, selecteert u Bestand | Maak een mozaïek (Figuur 1B, C, D).
  4. Selecteer afbeelding | Aanpassen | Helderheid/contrast ..., en pas de helderheid en het contrast van het beeld aan (Afbeelding 3A). Dan kan de afbeelding worden opgeslagen (Figuur 1E).
  5. Om de accumulatie van Aβ te kwantificeren, opent u de afbeelding via Bestand | Openen... in het menu (Figuur 2A).
  6. Selecteer afbeelding | Soort | 8-bit om de afbeelding aan te passen naar 8-bit. Kies vervolgens het gebied dat moet worden geteld met behulp van Polygoonselectie (Figuur 2B).
  7. Selecteer afbeelding | Aanpassen | Drempel om de juiste drempel van signalen te selecteren. De drempel kan worden aangepast door de schuifbalken te slepen of door de getallen rechtstreeks in het tekstvak te wijzigen (maximum: 255, minimum: 0). Wanneer alle Aβ-seinen in de sectie rood zijn geworden, is de drempel geschikt voor meting (Figuur 2C). Zorg ervoor dat het vakje Donkere achtergrond is aangevinkt.
  8. Analyseren | selecteren Meting instellen... in het menu om de parameters te kiezen die in de resultaten worden weergegeven. Controleer of Geïntegreerde dichtheid en Limiet tot drempel is geselecteerd. Geïntegreerde dichtheid (totale intensiteit) is het doel van de meting (Figuur 2D).
  9. Selecteer Analyseren | Meet om de resultaten te krijgen. De resultaten worden weergegeven en zijn klaar voor statistische analyse (Figuur 2E).

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Resultaten

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

We gebruikten de hierboven beschreven immunofluorescerende kleuringsprocedures om de afzetting van Aβ-accumulatie te onderzoeken bij 5×FAD-muizen van verschillende leeftijden. Figuur 3 geeft typische resultaten en suboptimale resultaten weer met behulp van ons protocol. Hersenplakjes van 5 maanden en 8 maanden heterozygote 5×FAD transgene muizen en 4 tot 6 maanden wildtype controle werden gekleurd met 6E10-antilichaam en gedetecteerd onder een fluorescentiem...

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Discussie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Immunofluorescerende kleuring met behulp van 6E10-antilichaam kan specifiek Aβ-accumulatie in de hersenen detecteren, die gemakkelijk kan worden gekwantificeerd door afbeelding J. Wat opmerkelijk is, is dat enkele cruciale stappen in dit protocol de resultaten kunnen beïnvloeden.

Om te voorkomen dat plakjes losvallen of breken, zoals weergegeven in figuur 3C, moeten enkele belangrijke punten worden opgemerkt. Perfusie moet snel ve...

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Openbaarmakingen

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

De auteurs hebben niets te onthullen.

Dankbetuigingen

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Dit onderzoek werd ondersteund door een algemeen project van de Natural Science Foundation of China (subsidienummer: 81974157) van de Natural Science Foundation of China, een Jiangsu Special Appointed Professorship (aan C.L.) van het Jiangsu Education Department, een Jiangsu Province Innovative and Entrepreneurial Team Program (aan H.Z., A.L., W.W., C.L. en Y.S.), een startbeurs van excellent talent (D2019025) en Innovation and Entrepreneurship Training Program (201910313038Z aan Z.S., Y.X., M.Z. en J.D.) van de Xuzhou Medical University. Dit onderzoek werd ook ondersteund door het National Demonstration Center for Experimental Basic Medical Science Education (Xuzhou Medical University).

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel
NaamBedrijfCatalogusnummerOpmerkingen
Anesthetia
InjectiespuitKLMEDICAL1 mL
Pentobarbitual natriumSigma-AldrichP37611% in zoutoplossing voor i.p. injectie
Thoracotomy:
IRIS-Fijne Rechte iris schaar (~11,5 cm)RWDS12010-11
Scherpe gebogen chirurgische schaar(11,5 cm)RWDS14016-11
Rechte dissectiestang (~10,5 cm)RWDF12010-10
Perfusie
Centrifugebuis (5 mL)Biosharp
InjectiespuitKLMEDICAL20 mL
ParaformaldehydeVicmedVIH100
PBS 0,01M (PH7,2-7,4) poederVicmedVC2001PVoeg gedeïoniseerd water toe om oplossing te maken
Fixatie, Dehydratie en Cryosectie
Adhesie microscoopglaasjesCITOTEST18810576,2 mm × 25,4 mm
Microtoom CryostaatLEICACM1950
Optimale snijtemperatuur compound (OCT)Sakura Finetek4583
SucroseVETECV900116
Immunofluorescence staining
FluorescentiemicroscoopOLYMPUSIX-81
Geit anti-Muis IgG (H+L) Cross-Adsorbed Secundair Antilichaam, Alexa Fluor 594Thermo Fisher ScientificA-11005200X
Image-Pro Plus 7.0CMedia CyberneticsWetenschappelijke grafisch en data-analyse software
Immunohistochemische Natte Box (zwart)SinylabAangepast300 mm × 100 mm × 38 mm, groefdiepte 27 mm, kan 10 standaard slides bevatten
PistoolThermo Scientific
PipettipsWell-offer
Kunststof kleuringsboxSinylabAangepast30 mL, kan 5 standaard slides bevatten
Primair Antilichaam Dilutie Buffergemaakt in ons lab1% BSA 1g, 0,3% Triton X-100 300ul, 0,01% natrium azide 10mg in 100ml PBS
Gepuurd anti beta amyloïde,1-16 antilichaam (6E10)BiolegendSIG-39320500X
Quick Antigen Retrieval Oplossing voor Frozen SectiesKeyGEN BioTECHKGIHC0055X
Kwantificering
Graphpad Prism 8.0.1GraphpadMedische kaartsoftware
Image J Fiji 2.0.0National Institute of HealthWetenschappelijke grafisch en data-analyse software

Referenties

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Burns, A., Iliffe, S. Alzheimer's disease. BMJ. 338, 158(2009).
  2. Leong, Y. Q., Ng, K. Y., Chye, S. M., Ling, A. P. K., Koh, R. Y. Mechanisms of action of amyloid-beta and its precursor protein in neuronal cell death. Metabolic Brain Disease. 35 (1), 11-30 (2020).
  3. Tiwari, S., Atluri, V., Kaushik, A., Yndart, A., Nair, M. Alzheimer's disease: pathogenesis, diagnostics, and therapeutics. International Journal of Nanomedicine. 14, 5541-5554 (2019).
  4. Murphy, M. P., LeVine, H. Alzheimer's disease and the amyloid-beta peptide. Journal of Alzheimer's Disease. 19 (1), 311-323 (2010).
  5. Hardy, J. A., Higgins, G. A. Alzheimer's disease: the amyloid cascade hypothesis. Science. 256 (5054), 184-185 (1992).
  6. Reitz, C. Alzheimer's disease and the amyloid cascade hypothesis: a critical review. International Journal of Alzheimer's Disease. 2012, 369808(2012).
  7. Bozyczko-Coyne, D., et al. CEP-1347/KT-7515, an inhibitor of SAPK/JNK pathway activation, promotes survival and blocks multiple events associated with Abeta-induced cortical neuron apoptosis. Journal of Neurochemistry. 77 (3), 849-863 (2001).
  8. Canevari, L., Abramov, A. Y., Duchen, M. R. Toxicity of amyloid beta peptide: tales of calcium, mitochondria, and oxidative stress. Neurochemical Research. 29 (3), 637-650 (2004).
  9. Zhu, X., et al. Oxidative stress signalling in Alzheimer's disease. Brain Research. 1000 (1-2), 32-39 (2004).
  10. Oakley, H., et al. Intraneuronal beta-amyloid aggregates, neurodegeneration, and neuron loss in transgenic mice with five familial Alzheimer's disease mutations: potential factors in amyloid plaque formation. Journal of Neuroscience. 26 (40), 10129-10140 (2006).
  11. Gage, G. J., Kipke, D. R., Shain, W. Whole animal perfusion fixation for rodents. Journal of Visualized Experiments. (65), e3564(2012).
  12. An, S., et al. Medial septum glutamatergic neurons control wakefulness through a septo-hypothalamic circuit. Current Biology. , (2021).
  13. Cao, J. L., et al. Activation of peripheral ephrinBs/EphBs signaling induces hyperalgesia through a MAPKs-mediated mechanism in mice. Pain. 139 (3), 617-631 (2008).
  14. Ly, P. T., Cai, F., Song, W. Detection of neuritic plaques in Alzheimer's disease mouse model. Journal of Visualized Experiments. (53), e2831(2011).
  15. Klunk, W. E., Jacob, R. F., Mason, R. P. Quantifying amyloid beta-peptide (Abeta) aggregation using the Congo red-Abeta (CR-abeta) spectrophotometric assay. Analytical Biochemistry. 266 (1), 66-76 (1999).
  16. Hatami, A., Albay, R., Monjazeb, S., Milton, S., Glabe, C. Monoclonal antibodies against Abeta42 fibrils distinguish multiple aggregation state polymorphisms in vitro and in Alzheimer disease brain. Journal of Biological Chemistry. 289 (46), 32131-32143 (2014).
  17. Shi, X. Z., Wei, X., Sha, L. Z., Xu, Q. Comparison of beta-Amyloid Plaque Labeling Methods: Antibody Staining, Gallyas Silver Staining, and Thioflavin-S Staining. Chinese Medical Sciences Journal. 33 (3), 167-173 (2018).

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Herprints en machtigingen

Toestemming aanvragen om de tekst of afbeeldingen van dit JoVE-artikel te hergebruiken

Toestemming aanvragen

Trefwoorden

Amylo de betaamylo de plaquesbeta amylo de precursor5xFAD muizentranscardiale perfusiecryosectieplaquekwantificering
Video binnenkort beschikbaar

Gerelateerde artikelen