Faseverandering dimethyldioctadecylammonium-geschelpte microdruppels als een veelbelovend medicijnafgiftesysteem: resultaten op 3D-sferoïden van tumorcellen van zoogdieren

Samenvatting

Decafluoropentaanmicrodruppels, ontwikkeld met een omhulsel van dimethyldioctadecylammoniumbromide, vertoonden een uitzonderlijke colloïdale stabiliteit en een actractieve bio-interface. DDAB-MD's bleken efficiënte geneesmiddelreservoirs te zijn die worden gekenmerkt door een hoge affiniteit voor plasmamembranen samen met een verbeterde opname en antitumoractiviteit van doxorubicine tegen humane triple-negatieve borstkanker (MDA-MB-231) 3D-model.

Samenvatting

Significante verbetering van faseverandering perfluorkoolstof microdruppels (MD's) in het uitgebreide theranostische scenario gaat door de optimalisatie van de MD's-samenstelling met betrekking tot synthese-efficiëntie, stabiliteit en vermogen tot medicijnafgifte. Hiertoe werden decafluoropentaan (DFP) MD's ontworpen, gestabiliseerd door een omhulsel van dimethyldioctadecylammoniumbromide (DDAB) kationische oppervlakteactieve stof. Een hoge concentratie DDAB-MD's werd binnen enkele seconden gemakkelijk verkregen door gepulseerde insonatie met hoog vermogen, wat resulteerde in druppels met een lage polydisperse grootte van 1 μm. Zeer positieve ζ-potentialiteit, samen met een lange, verzadigde koolwaterstofketen van de DDAB-schil, zijn sleutelfactoren om de druppel en de medicijnlading daarin te stabiliseren. De hoge affiniteit van de DDAB-schil met het celplasmamembraan maakt gelokaliseerde chemotherapeutische toediening mogelijk door de geneesmiddelconcentratie op de tumorcelinterface te verhogen en de opname te stimuleren. Dit zou DDAB-MD's veranderen in een relevant hulpmiddel voor medicijnafgifte dat een hoge antitumoractiviteit vertoont bij zeer lage medicijndoses.

In dit werk wordt aangetoond dat de werkzaamheid van een dergelijke benadering het effect van doxorubicine tegen 3D-sferoïden van tumorcellen van zoogdieren, MDA-MB-231, drastisch verbetert. Het gebruik van driedimensionale (3D) celculturen die zijn ontwikkeld in de vorm van meercellige tumorsferoïden (d.w.z. dicht opeengepakte cellen in een bolvorm) heeft tal van voordelen ten opzichte van 2D-celculturen: het heeft niet alleen het potentieel om de kloof tussen conventionele in vitro-onderzoeken en dierproeven te overbruggen, maar zal ook het vermogen verbeteren om in vitro meer voorspellende onderzoeken uit te voeren screeningstests voor preklinische geneesmiddelenontwikkeling of evalueer het potentieel van off-label geneesmiddelen en nieuwe co-targetingstrategieën.

Inleiding

Vectoren voor medicijnafgifte die in staat zijn om een hoge antitumorwerkzaamheid te garanderen en bijwerkingen te verminderen, zijn primaire doelen, terwijl ze een ernstige chemisch-farmaceutische uitdaging blijven ^1,2. Tot op heden wordt hun vooruitgang in eerste instantie beperkt door het contrast van een onvoldoende in situ medicijnafgifte en een kritiek niveau van niet-specifieke toxiciteit ^3,4,5. In de afgelopen jaren zijn verschillende medicijnafgiftesystemen geïmplementeerd om de toediening van antikankermiddelen te verbeteren, waaronder liposomen, polymere micellen, polymersomen 6,7,8,9,10. Deze systemen vertonen potentieel voor het verlengen van de circulatietijd en selectiviteit van geneesmiddelen, terwijl ze de distributie en accumulatie in gezonde organen en weefsels verminderen. Hoe dan ook, de ingekapselde formuleringen van antineoplastische chemotherapiemedicijnen, zoals anthracyclines, leidden tot een significant verminderde internalisatie-efficiëntie van geneesmiddelen. Onlangs hebben stimuli-responsieve micron- en submicrondragers zoals microbubbels¹¹, microdruppels, hybride gouden nanodeeltjes¹², nano-hydrogels¹³, PLGA-steigers en mesoporeuze platforms¹⁴ aan farmacologische belangstelling gewonnen vanwege hun grote veelzijdigheid bij het richten op en uitoefenen van tumorremmende effecten met behulp van doxorubicine (Dox) en docetaxel. Baanbrekende experimenten om van deze dragers efficiënte antikankersoldaten te maken voor multimodale taken (d.w.z. chemotherapeutische, fotothermische en gensynergetische benaderingen) en moleculaire beeldvorming¹⁵ hebben de weg geëffend voor gepersonaliseerde theranostische nanogeneeskunde.

In dit scenario zijn faseveranderende perfluorkoolstofmicrodruppels (MD's) geëvalueerd aan de hand van de belangrijkste mogelijkheid die ze bieden om een hoge lading van geneesmiddelen te conjugeren, de chemische veelzijdigheid van de MD's-schil die biologische barrières aanpakt, colloïdale stabiliteit en synthese-efficiëntie^11,12. Als extra troef maakt de echogeniciteit van de MD's, bevorderd door akoestische of optische verdamping van de perfluorkoolstof (PFC) kern, het mogelijk om in situ beeldvorming en veelbelovende therapeutische werkzaamheid te verkrijgen. Bovendien kan de verdamping van de MD-kern, verkregen door het vrijkomen van energie door ioniserende deeltjesbundels, worden benut voor het volgen van bundels en stralingsdosimetrie.

De huidige studie is gericht op de ontwikkeling van decafluoropentaan (DFP) microdruppeltjes die worden gestabiliseerd door een meervoudig bruikbaar omhulsel van dimethyldioctadecylammoniumbromide (DDAB) kationische oppervlakteactieve stof. DDAB shelled-MD's voldoen aan zowel fysisch-chemische als biologische verwachtingen. Van op DFP gebaseerde microdruppels is aangetoond dat ze waardevolle faseveranderingscontrastmiddelen zijn om biocompatibele en stabiele perfluorkoolstof-MD's¹⁶ te bereiken. DDAB kristallijne gel verzadigt lange ketens bij fysiologische temperatuur, dringt diep door in de hydrofobe kern en stabiliseert de druppel en de medicijnlading daarin. Bovendien verbetert het hoge positieve ζ-potentieel op het watergrensvlak de colloïdale stabiliteit van de MD's. De biologische aantrekkelijkheid van het oppervlak van de DDAB-schelp ligt in het vermogen om de dood van bacteriën en schimmels te veroorzaken, in concentraties die zoogdiercellen nauwelijks aantasten, en om plasmamembranen, negatief geladen antigene eiwitten, nucleotiden, DNA of nanodeeltjes te binden. De bovengenoemde kenmerken kunnen worden benut om een opmerkelijke immunoadjuvans-, gentherapie- en antitumorwerking in zoogdiercellen te genereren¹⁷.

Dox-geladen DDAB-MD's (Dox@DDAB-MD's) die hierin worden beschreven, bevorderen de afgifte van geneesmiddelen tegen zeer agressieve, invasieve en slecht gedifferentieerde triple-negatieve borstkankercellen. Hieronder wordt een eenvoudig en snel protocol beschreven op basis van sonde-insonatie met hoog vermogen om stabiele DDAB-MD's met hoge dichtheid te verkrijgen met een smalle grootteverdeling met een hoge laadefficiëntie van Dox in een formulering in één stap. Dergelijke kenmerken zijn concurrerend, zelfs voor andere bereidingsmethoden zoals microfluïdische apparaten en homogenisatoren met hoge afschuiving¹⁶.

Het andere grote beperkende probleem bij het ontwerpen van efficiënte vectoren voor medicijnafgifte is dat de activiteit van een medicijn een functie is van verschillende parameters (bijv. absorptie, distributie, concentraties) die kunnen worden verkregen in een daadwerkelijk biologisch doelwit, die niet kunnen worden beschouwd door monolaagcelmodellen¹⁸. Om deze reden is de geschiedenis van de ontwikkeling van nieuwe antitumorformuleringen bezaaid met in vitro studies die helaas al ineffectief zijn gebleken op het niveau van preklinische modellen bij dieren¹⁹.

Met name de noodzaak om over te stappen van celculturen naar een complexer en betrouwbaarder systeem dan in vivo en ex vivo studies houdt verband met de inherente beperkingen van farmacologische studies op 2D-culturen. In deze context zijn de in vitro 3D-systemen opgenomen, zoals sferoïden, organoïden, organ-on-chip, die de morfologie, activiteit en fysiologische respons van complexere structuren dan de 2D-monolagen²⁰ simuleren. In een preklinische visie bieden 3D-celmodellen die de cellulaire micro-omgeving nabootsen de mogelijkheid om complexe biologie beter te begrijpen in een fysiologisch relevanter kader waarin traditionele monolaagculturen niet effectief zijn^21,22.

Na te hebben bewezen dat DDAB-MD's kunnen interageren met het celmembraan van menselijke borstkankercellen, waarbij de internalisatie van geneesmiddelen en celdood bij een zeer lage (nanomolaire) Dox-concentratie worden bevorderd, is de werkzaamheid van een dergelijke methodologie tegen 3D-sferoïden van tumorcellen van zoogdieren, MDA-MB-231, getest.

Protocol

OPMERKING: Alle reagentia en instrumenten staan vermeld in de materiaaltabel.

1. Vervaardigen en karakteriseren van microdruppels

1. Dox-geladen DDAB-MD's voorbereiden
   1. Los het DDAB-poeder op in ethanol om een eindconcentratie van 10 mM en een eindvolume van 1 ml te verkrijgen. Bereid 1 ml Dox-bouillonoplossing en los 2 mg Dox-poeder op in ethanol.
      LET OP: Van Dox is bekend dat het acute orale toxiciteit heeft, categorie 4 en kankerverwekkendheid, categorie 1B. Alleen gebruiken onder een zuurkast met handschoenen en een gezondheidsmasker.
   2. Voeg 250 μl DFP toe aan 300 μl DDAB-oplossing (oliefase) in een centrifugebuis van 15 ml met plastic schaalverdeling.
      OPMERKING: De zuiverheid van DFP is 60% (GC), dichtheid 1,6 g/ml (20 °C), kookpunt is 55 °C. De zuiverheid van Dox is 98, 0-102, 0% (HPLC). De zuiverheid van DDAB is ≥98% (TLC). De zuiverheid van ethanol is 97%.
   3. Voeg voorzichtig 2,15 ml gedeïoniseerd water toe aan de oliefase, wat resulteert in een tweefasig water/oliemengsel. Injecteer voorzichtig 10 μL Dox-oplossing rechtstreeks in de oliefase vlak voor de insonatie om te voorkomen dat een aanzienlijke hoeveelheid Dox in de waterfase wordt verdeeld.
   4. Emulgeer het bifasische mengsel door sonde-insonatie (met een 1/8 in titanium taps toelopende microtip) met behulp van ultrasone vloeistofprocessorapparatuur met hoge intensiteit in een pulsmodus (0,7 s aan en 0,3 s uit) bij 20 kHz, 100 W gedurende 10 s. Verdun vers bereide MD's onmiddellijk met ultragefilterd, gedeïoniseerd water (bijv. MilliQ) met een factor 1,8.
      OPMERKING: De verdunningsfactor is indicatief, empirisch gekozen. MD's oplossing kan meer worden verdund zolang er voldoende pellet wordt verkregen uit daaropvolgende centrifugaties.
   5. Neem 1 ml van de verkregen suspensie en centrifugeer 3x, resersuspendeer in ultragefilterd, gedeïoniseerd water (bijv. MilliQ) om het teveel aan Dox en ethanol te verwijderen. Voer de eerste centrifugatie uit bij 25 °C, 360 x g gedurende 3 minuten en de tweede en derde bij 280 x g bij dezelfde temperatuur en tijd.
   6. Verwijder na de laatste wasbeurt het bovenstaande water en zuig 5 μL van de pellets op en dispergeer ze in 2 ml van het medium voor celbehandeling, waarbij een equivalente Dox-concentratie van 10 nDox@DDABM wordt verkregen.
      OPMERKING: Equivalente Dox-concentratie wordt gedefinieerd als de hoeveelheid vrije Dox in hetzelfde volume van een suspensie van Dox@DDAB-MD's.
2. Karakterisering van Dox-geladen DDAB-MD's
   1. Meet de grootteverdeling met behulp van een Dynamic Light Scattering (DLS) fotometer en analyseer de verkregen correlogrammen met het Contin-algoritme om de bijbehorende vervaltijden te extrapoleren. Gebruik vervolgens de vervaltijden om de verdeling van de diffusiecoëfficiënten van de deeltjes (D) te bepalen en zet deze om in een verdeling van hydrodynamische diameters (2R_H) met behulp van de Stokes-Einstein-relatie R_H = k_BT/6πηD, waarbij k_BT de thermische energie van het systeem is en η de viscositeit van het oplosmiddel.
   2. Controleer de grootte en grootteverdeling ook met behulp van helderveldmicroscopie met een beeldanalysesoftware (bijv. Afbeelding J), meet de grootte van ten minste 100 druppels per frame (voor 3 of 4 frames), het verkrijgen van een gemiddelde waarde en een standaarddeviatie.
      OPMERKING: Verdun voor DLS-metingen de MDs-oplossing in ultragefilterd, gedeïoniseerd water (bijv. MilliQ), PBS en in celkweekmedium om terugverstrooiing te voorkomen tot een vaste concentratie van 1,5 x 10⁸ MD's /ml. Voor ultragefilterd, gedeïoniseerd water en PBS in celkweekmedium verkregen we gemiddelde groottewaarden van respectievelijk 1,1 ± 0,1 μm, 1,1 ± 0,25 μm en 1,2 ± 0,2 μm. MD's die na centrifugatie uit de pellets worden teruggewonnen, vertonen geen veranderingen in de grootte van de fouten.
   3. Gebruik een dia van de celtelkamer voor microscopie om de MD-concentratie te beoordelen. De kamer is samengesteld uit twee verschillende telgebieden met een dikte van 0,10 mm. Plaats 10 μL MDs-suspensie over de kamer. Tel MD's in het vierkant van 0,25 x 0,25 nm² van de kamer met behulp van een optische microscoop met een 40x langeafstandsobjectief en analyseer met een freeware voor beeldanalyse.
   4. Bereken de MDs-concentratie, uitgedrukt als aantal MDs/ml, volgens de vergelijking:
      
   5. Controleer de geïnternaliseerde Dox door Confocal Laser Scanning Microscope (CLSM)-beelden die gebruik maken van de Dox-autofluorescentie bij 590 nm. Meet het Dox-gehalte met behulp van een fluorimetrische test, waarbij de deeltjes worden gedispergeerd in ultragefilterd, gedeïoniseerd water of PBS, ze gedurende 3 minuten worden gecentrifugeerd bij 25 °C, 360 x g en vervolgens de hoeveelheid vrije drug wordt bepaald door de fluorescentie van het bovenstaande bij 590 nm te evalueren met een kalibratiecurve (lineariteitsbereik voor Dox-concentratie: 2-20 μmol/ml, R² = 0,99).
      NOTITIE: Trek de verkregen waarde af van de totale concentratie Dox om de ingekapselde hoeveelheid Dox te verkrijgen. Voer het experiment uit in drievoud. De efficiëntie van de Dox-inkapseling resulteert in 28% ± 2%, berekend door de hoeveelheid Dox van het geneesmiddel in de MD's te delen door de totale inhoud van de ingezette Dox.
   6. Voer experimenten uit met het vrijkomen van Dox in de loop van de tijd, door te centrifugeren en de procedure te herhalen volgens stap 1.2.3 om het percentage Dox dat in het bovenstaande vrijkomt te verkrijgen tot het aantal ingekapselde Dox. Herhaal na de eerste bepaling de procedure door de centrifugatiesnelheid te verlagen tot 280 x g om te voorkomen dat de MD's breken. Plot een releasecurve in de loop van de tijd. Controleer of de concentratie Dox die binnen 24 uur in het bovenstaande vrijkomt, een maximum van 20% bereikt.
   7. Meet de ζ-potentiaal bij 37 °C met behulp van een speciaal apparaat (bijv. NanoZetaSizer) en controleer of de verkregen waarden rond de 90-100 mV liggen.

2. Fabricage van sferoïden in microgegoten niet-klevende substraten

1. Gieten van micromallen
   1. Plaats kleine 3D-vormpjes en 1 g puur agarosepoeder in containers die geschikt zijn voor sterilisatie. Autoclaaf ze gedurende 30 minuten op een droge cyclus (121 °C).
   2. Voeg in een bioveiligheidskast 50 ml 0,9% zoutoplossing (NaCl) toe aan de glazen fles met gesteriliseerde agarose en plaats deze in een magnetron om te koken en het poeder op te lossen. Laat de gesmolten agarose afkoelen tot 60 °C en voeg 500 μL toe aan elke microvorm om te voorkomen dat er luchtbellen ontstaan tijdens het pipetteren.
      WAARSCHUWING: Gesmolten agarose kan ernstige brandwonden veroorzaken. Er zijn geschikte persoonlijke beschermingsmiddelen nodig.
   3. Verwijder de gegeleerde agarose door de vorm voorzichtig te buigen en het nieuw gevormde substraat te verwijderen. Doe de substraten in een plaat met 12 putjes en voeg 2 ml vers kweekmedium per putje toe. Incubeer gedurende ten minste 15 minuten om elk substraat in evenwicht te brengen.
      OPMERKING: Bereid het kweekmedium van tevoren voor en leid het door een filter van 0.22 μm om mogelijke deeltjes of verontreinigingen te verwijderen.
2. Zaaien van de cellen
   1. Kweek MDA-MB 231 cellen met compleet medium (DMEM aangevuld met 1% Pen/Streptokok, 10% FBS en 1% L-Glu) in een celkweekincubator bij 37 °C, 5% CO₂. Wanneer de cellen in een T75-kolf ongeveer 80% samenvloeien, gooi je het medium weg, spoel je het af met 4 ml DPBS en voeg je 3 ml trypsine/EDTA toe. Plaats de kolf in de broedmachine en wacht tot de cellen zijn losgekomen. Inspecteer het detachement elke 5 minuten onder een omgekeerde microscoop (op 20x).
   2. Verzamel de losgemaakte cellen met 3 ml DPBS met 10% FBS in een buis van 15 ml en centrifugeer op 235 x g gedurende 10 minuten. Gooi het bovenstaande dat zowel DPBS als trypsine/EDTA bevat weg en suspendeer de celpellet in 3 ml vers medium. Pipetteer 10 μL celsuspensie met 10 μL trypanblue en tel de cellen met behulp van een Neubauer-kamer.
      OPMERKING: Neutraliseer bij het oogsten van de cellen de trypsine/EDTA met DPBS die 10% FBS bevat om te voorkomen dat de trypsine de cellen beschadigt tijdens de centrifugatiestap.
   3. Om een nominale sferoïde diameter van 50 μm (~15 cellen/sferoïde te verkrijgen), verdunt u de celsuspensie tot een uiteindelijke concentratie van 3.840 cellen/190 μL, wat resulteert in 256 sferoïden in de kleine mal. Als alternatief, voor een sferoïde diameter van 200 μm (~1.000 cellen/sferoïde) verdunnen tot een uiteindelijke concentratie van 81.000 cellen/190 μL, wat resulteert in 81 sferoïden in de grote mal, volgens de instructies van de fabrikant.
   4. Verwijder het kweekmedium van de plaat met 12 putjes en kantel de substraten om het medium voorzichtig uit de celzaaikamer te verwijderen. Voeg 190 μL celsuspensie toe aan elk substraat (druppelsgewijs) en wacht 10 minuten tot de cellen zich hebben genesteld in de weefselkweekincubator.
   5. Voeg 2 ml van het omringende medium per putje toe en plaats de multiwell terug in de broedmachine. Inspecteer elke 24 uur op sferoïdevorming. Vervang indien nodig door een vers medium.
3. Oogsten en verwerken van sferoïden
   1. Plaats een petrischaaltje van 35 mm met 2 ml vers medium in de broedmachine om gedurende 10-15 minuten in evenwicht te blijven.
   2. Verwijder het celkweekmedium dat het substraat omringt. Verwijder met een steriel pincet het substraat uit het putje en keer het om in het petrischaaltje. Tik zachtjes op de onderkant van het substraat om de sferoïden door de zwaartekracht te laten vallen.
   3. Plaats het petrischaaltje met de sferoïden terug in de broedmachine voor verdere verwerking. Protocolstappen voor de fabricage van sferoïden worden weergegeven in figuur 2.

3. Sferoïde behandeling

1. Verwijder het bovenstaande uit de mal en vervang het door 200 μL Dox@DDAB-MDs-dispersie, bereid zoals beschreven in stap 1.1.6.
2. Voeg na 5 minuten 2 ml/putje omringend medium toe om in evenwicht te komen. Ga na de gewenste behandeltijd verder volgens stap 2.1.

4. Karakterisering van sferoïde grootte en morfologie

1. Controleer de sferoïde grootte na de gewenste incubatietijd met een 40x objectief in combinatie met de beeldverwerkingssoftware van de microscoop.
2. Meet de grootte van ten minste 10 sferoïden om voldoende gegevens te verzamelen voor geschikte statistieken en analyseer hun volumes zoals gerapporteerd in stap 7.

5. Proliferatie/levensvatbaarheidstest: fluorescentiemicroscopie met kleuring van levende cellen

NOTITIE: Volg de instructies voor sferoïde fabricage tot stap 2.2.5.

1. Haal het bovenstaande uit de vorm en vervang het door 200 μL 4 μM calceïne-AM in PBS en incubeer gedurende 3 uur bij kamertemperatuur in het donker. Voeg tijdens de laatste 20 minuten van de incubatie 10 μg/ml propidiumjodide toe om de dode cellen te kleuren.
2. Oogst de sferoïden door het substraat om te keren in de petrischaal volgens stap 2.3.2.
3. Beeld de sferoïden af in kleuroplossing met behulp van CLSM met 40x/60x objectieven en een Ar+ laser, waarbij de versterking en het gaatje op de juiste manier worden ingesteld om scherpe beelden te verkrijgen.

6. Beeldanalyse en -acquisitie

1. Transmissie en confocale 2D-beelden
   1. Open de confocale software (aanvullend bestand A) en selecteer het doel (60x, 40x, enz.). Klik in het rechterpaneel op Trans om het transmissiekanaal te selecteren.
   2. Klik op Live om het beeld te visualiseren en te zoeken naar de geoptimaliseerde focus. Klik op Single om de acquisitie te stoppen.
   3. Klik voor de confocale afbeeldingen op rode of groene laserkanalen, afhankelijk van de gebruikte fluorescerende kleurstof. Selecteer in het gaatjesgedeelte de optie S-diafragma in het vervolgkeuzemenu en stel het versterkingsgedeelte in op 6.00 B.
   4. Klik op Live en stel het gaatjesdiafragma en de versterking in om het contrast te optimaliseren. Klik op Single om de acquisitie te stoppen en de afbeelding op te slaan. Overlap het transmissie- en confocale beeld door het juiste kanaal te selecteren op de bovenste werkbalk.
2. Confocale 3D-beelden
   1. Klik op Z in het rechterpaneel (Aanvullend bestand B). Klik op de rode knop om de instellingen te resetten.
   2. Selecteer de sectie Ref , klik op Live en zoek het mediaanplan in het object dat de focus verplaatst. Selecteer het bovenste gedeelte en verplaats de focus omhoog totdat het object onscherp is en verdwijnt.
   3. Herhaal stap 6.2.2 voor het onderste gedeelte en beweeg naar beneden de focus.
   4. Stel de stapgrootte in op 0,75 μm. Klik op Z-stack en vervolgens op Single om het scannen te starten. Sla de afbeeldingen op in .ics formaat.
3. Optische beelden en analyse
   1. Open de optische microscoopsoftware, leg het beeld vast met een 40x lange focus of 20x objectief door op Play te drukken op de bovenste werkbalk. Druk op Stop en sla de afbeelding op.
   2. Klik op de bovenste werkbalk op Weergave, Analysecontrole, Annotaties en Metingen en open een paneel met verschillende opties (Aanvullend bestand C). Selecteer in het deelvenster Annotatie en metingen de optie Halve as en klik op Ellips
   3. Zoek bij het zoeken naar afbeeldingen naar de as die het beste past bij de objectvorm en druk op Enter op het toetsenbord om de verkregen waarde over te brengen naar de rechterpaneeltabel.
   4. Herhaal stap 6.3.3 voor ten minste 10 objecten om voldoende gegevens te verkrijgen. Klik op Exporteren naar Excel-gegevensblad om de gegevens te exporteren en op te slaan.
4. 3D Z-Stack beeldvisualisatie en volumenumerieke berekening
   1. Open het 3D-beeld dat is vastgelegd met de confocale microscopie in de optische microscoopsoftware (aanvullend bestand D).
   2. Om de 3D-reconstructie te zien, klikt u op Volumeweergave weergeven in de afbeeldingswerkbalk; Het object kan in elke richting worden gedraaid door op de linkermuisknop te klikken. Om een deel van het volume te selecteren, blijft u op ctrl + linkermuistoetsen drukken (aanvullend bestand E).
   3. Druk op de x-knop op het toetsenbord om een momentopname van het 3D-beeld te maken en op te slaan.
   4. Om het objectvolume te berekenen, klikt u op Meten, 3D-objectmetingen en opent u een paneel (Aanvullend bestand, afbeelding F). Klik op de werkbalk van het paneel Definieer 3D-drempel en stel de geoptimaliseerde drempel in met behulp van ook de vloeiende en schone filters (Aanvullend bestand, Afbeelding G). Klik op OK om in het paneel met 3D-objectmetingen verschillende parameters te verkrijgen, waaronder het volume.
   5. Klik op Exporteren naar Excel om gegevens te exporteren en op te slaan.

7. Sferoïde gegevensanalyse

1. Benader voor de volumeberekeningen van de sferoïden de 3D-structuur met een prolaat-ellipsoïde, waarbij u de hoofd- en mineuras schat via de 2D-projectie zoals weergegeven in de invoeging van figuur 3.
2. Valideer de benadering van de prolaatellipsoïde door een vergelijking tussen het numeriek berekende volume zoals weergegeven in stap 6.4 en de volumeformule voor de prolaatellipsoïde met b>a=c waarbij a, b en c de ellipsoïde as zijn).
3. Bereken het gemiddelde volume van ten minste 10 sferoïden en de respectieve standaarddeviaties. Als de volumeverdeling van sferoïde normaal is, past u de Dixon-test toe om de uitbijterwaarde te identificeren en te verwerpen. Bereken vervolgens de volumeverhouding tussen de behandelde en de monsters samen met de foutpropagatie zoals weergegeven in figuur 6A.

Resultaten

Dox@DDAB-MD's zijn ontwikkeld volgens protocol (Sectie 1) zoals schematisch beschreven in Figuur 1. De verkregen MD's zijn gemaakt van een monolaag DDAB die de DFP-kern inkapselt (Figuur 1A). De kationische lading van DDAB en de sonicatieprocedure voorkomen de vorming van DDAB-multilamellaire lagen die zijn gestapeld op het DFP- en watergrensvlak²³.

De CLSM-mic...

Discussie

Om de werkzaamheid van anthracyclines als antitumorgeneesmiddelen te verbeteren, presenteert dit werk de vorming van DDAB-gepelde PFC-druppeltjes die het chemotherapeutische geneesmiddel doxorubicine (Dox) inkapselen en het effect van een dergelijke formulering die interageert met de hoge agressieve triple-negatieve borstkankercellen, MDA-MB-231.

Opbouw van DOX@DDAB-MD's
Dox loaded MD's zijn geformuleerd door de insonatiemethode met een ext...

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel

Naam	Bedrijf	Catalogusnummer	Opmerkingen
µ-Petri dish	Ibidi	81156	35mm hoog, IbiTreat
1,1,1,2,3,4,4,5,5,5-Decafluoropentane	Sigma-Aldrich	138495-42-8	b.p. 55°C
12-well kweekplaat	Corning
15 ml centrifugebuis	Falcon	89039-664
3D-Petri dishes 12:256	Microtissues (Sigma-Aldrich)	Z764000-6EA	Klein
3D-Petri dishes 12:81	Microtissues (Sigma-Aldrich)	Z764019-6EA	Groot
5%CO2 kweekincubator, 37°C	Thermo Scienific		HERAcell 150i
50 ml centrifugebuis	Falcon	352070
Biologische veiligheidskast, II niveau
Calcein	Sigma-Aldrich
Calcein-AM	Sigma-Aldrich	148504-34-1	4mM stockoplossing in DMSO
cam sCMOS Andor Zyla 4.2	Andor Instruments
Centrifuge Hettich Universal 320R	Hettich Lab. Technology
DAPI	SIgma-Aldrich
Dimethyldioctadecylammonium bromide poeder	Sigma-Aldrich	3700-67-2
DMEM (Dulbecco's Gemodificeerd Eagle Medium)	Corning	15-013-CV
Doxorubicin hydrochloride	Sigma-Aldrich	25316-40-9
DPBS (Dulbecco's Gemodificeerd PBS)	Corning	21-030-CV	pH 7,4
Ethanol 70%	Sigma-Aldrich
EZ-C1 digitale ecliplse	Nikon Instruments		Zilver versie 3.91
Fetaal bovien serum (FBS)	Corning	35-079-CV
Goniometer BI-200SM	Brookhaven Instruments Corporations
Laser Ar+	Spectra Physics
Laser He-Ne	Melles-Griot
L-Glutamin	Corning	25-005-CI
Microscoop Nikon Eclipse Ti	Nikon Instruments
MDA-MB 231 cellijn	ATCC
Microsoft Excel	Microsoft
Microplates reader Spark	Tecan group
NanoZetaSizer ZS	Malvern Instruments LTD
Neubauer verbeterde kamer		718605
NIS Elements software	Nikon Instruments		AR 4.30
Pen/Strepto	Corning	30-002-CI
Photocorrelator BI-9000 AT	Brookhaven Instruments Corporations	62927-1
Fotometer HC120	Brookhaven Instruments Corporations	N° 1275
Pipetten en tips, verschillende maten	Gilson
Propidium Jodide	SIgma-Aldrich
Serologische pipetten, verschillende maten	Corning
Solid-state laser	Suwtech Laser	N° 22368
T25 Flessen	Sarstedt	83.3910.002
T75 Flessen	Sarstedt	83.3911.002
Trypsin/EDTA 0.05%	EuroClone	ECB3052D
Vibra-Cell VCX-400	Sonics & Materials, inc
Waterbad			37°C