NMR-gebaseerde fragmentscreening in een minimale steekproef maar maximale automatiseringsmodus

Summary

Fragmentgebaseerde screening door NMR is een robuuste methode om snel kleine molecuulbinders voor biomacromoleculen (DNA, RNA of eiwitten) te identificeren. Protocollen die op automatisering gebaseerde monstervoorbereiding, NMR-experimenten en acquisitievoorwaarden en analyseworkflows beschrijven, worden gepresenteerd. De techniek maakt een optimale benutting van zowel ¹H als ¹⁹F NMR-actieve kernen mogelijk voor detectie.

Abstract

Fragment-based screening (FBS) is een goed gevalideerd en geaccepteerd concept binnen het proces van geneesmiddelenontdekking, zowel in de academische wereld als in de industrie. Het grootste voordeel van NMR-gebaseerde fragmentscreening is het vermogen om niet alleen bindmiddelen van meer dan 7-8 ordes van grootte van affiniteit te detecteren, maar ook om de zuiverheid en chemische kwaliteit van de fragmenten te bewaken en zo hits van hoge kwaliteit en minimale valse positieven of valse negatieven te produceren. Een vereiste binnen de FBS is het uitvoeren van initiële en periodieke kwaliteitscontrole van de fragmentbibliotheek, het bepalen van de oplosbaarheid en chemische integriteit van de fragmenten in relevante buffers en het opzetten van meerdere bibliotheken om verschillende steigers te bedekken om verschillende macromolecuuldoelklassen (eiwitten / RNA / DNA) te huisvesten. Verder is een uitgebreide NMR-gebaseerde screeningsprotocoloptimalisatie met betrekking tot monsterhoeveelheden, snelheid van acquisitie en analyse op het niveau van biologische constructie / fragmentruimte, in conditieruimte (buffer, additieven, ionen, pH en temperatuur) en in ligandruimte (ligandanalogen, ligandconcentratie) vereist. Althans in de academische wereld zijn deze screeninginspanningen tot nu toe handmatig en op een zeer beperkte manier uitgevoerd, wat heeft geleid tot een beperkte beschikbaarheid van screeninginfrastructuur, niet alleen in het ontwikkelingsproces van geneesmiddelen, maar ook in de context van de ontwikkeling van chemische sondes. Om economisch aan de eisen te voldoen, worden geavanceerde workflows gepresenteerd. Ze maken gebruik van de nieuwste state-of-the-art geavanceerde hardware, waarmee de vloeistofmonsterverzameling op een geconditioneerde manier in de NMR-buizen kan worden gevuld. ¹H/¹⁹F NMR op ligand gebaseerde spectra worden vervolgens verzameld bij een bepaalde temperatuur. High-throughput sample changer (HT sample changer) kan meer dan 500 samples verwerken in temperatuurgecontroleerde blokken. Dit samen met geavanceerde softwaretools versnelt data-acquisitie en -analyse. Verder wordt de toepassing van screeningsroutines op eiwit- en RNA-monsters beschreven om bewust te worden van de gevestigde protocollen voor een brede gebruikersbasis in biomacromoleculair onderzoek.

Introduction

Fragmentgebaseerde screening is nu een veelgebruikte methode voor het identificeren van vrij eenvoudige moleculen met een laag molecuulgewicht (MW <250 Da) die een zwakke binding vertonen aan macromoleculaire doelen, waaronder eiwitten, DNA en RNA. Initiële hits van primaire schermen dienen als basis om een secundair scherm van commercieel beschikbare grotere analogen van de hits uit te voeren en vervolgens op chemie gebaseerde fragmentgroei- of koppelingsstrategieën te gebruiken. Voor een succesvol platform voor het ontdekken van fragmenten (FBDD) is in het algemeen een robuuste biofysische methode nodig voor het detecteren en karakteriseren van zwakke treffers, een fragmentbibliotheek, een biomoleculair doelwit en een strategie voor vervolgchemie. Vier veelgebruikte biofysische methoden binnen de campagnes voor het ontdekken van geneesmiddelen zijn thermische verschuivingstests, oppervlakteplasmonresonantie (SPR), kristallografie en kernspinresonantiespectroscopie (NMR).

NMR-spectroscopie heeft verschillende rollen laten zien binnen de verschillende stadia van de FBDD. Afgezien van het waarborgen van de chemische zuiverheid en oplosbaarheid van de fragmenten in een fragmentbibliotheek opgelost in een geoptimaliseerd buffersysteem, kunnen ligand-geobserveerde NMR-experimenten fragmentbinding aan een doelwit met lage affiniteit detecteren en kunnen de doelgeobserveerde NMR-experimenten de bindende epitoop van het fragment afbakenen, waardoor gedetailleerde structuur-activiteitsrelatiestudies mogelijk worden. Binnen epitoopkartering kunnen op NMR gebaseerde chemische verschuivingsveranderingen niet alleen de orthosterische bindingsplaatsen identificeren, maar ook allosterische plaatsen die mogelijk cryptisch zijn en alleen toegankelijk in zogenaamde aangeslagen conformatietoestanden van het biomoleculaire doelwit. Als het biomoleculaire doelwit al een endogene ligand bindt, kunnen de geïdentificeerde fragmenttreffers gemakkelijk worden geclassificeerd als allosterisch of orthosterisch door NMR-gebaseerde competitie-experimenten uit te voeren. Het bepalen van de dissociatieconstante (K_D) van de ligand-target interactie is een belangrijk aspect in het FBDD-proces. NMR-gebaseerde chemische verschuivingstitraties, ligand of doel waargenomen, kunnen gemakkelijk worden uitgevoerd om de K_D te bepalen. Een groot voordeel van NMR is dat de interactiestudies worden uitgevoerd in oplossing en in de buurt van fysiologische omstandigheden. Zo kunnen alle conformatietoestanden voor de analyse van ligand/fragmentinteractie met zijn doelwit worden onderzocht. Verder zijn NMR-gebaseerde benaderingen niet alleen beperkt tot screening van goed gevouwen oplosbare eiwitten, maar worden ze ook toegepast om grotere doelruimte te accommoderen, waaronder DNA, RNA, membraangebonden en intrinsiek ongeordende eiwitten¹.

Fragmentbibliotheken zijn een onmisbaar onderdeel van het FBDD-proces. Over het algemeen fungeren fragmenten als de eerste voorlopers die uiteindelijk deel gaan uitmaken (onderbouw) van de nieuwe remmer die is ontwikkeld voor een biologisch doelwit. Van verschillende geneesmiddelen (Venetoclax², Vemurafenib³, Erdafitinib⁴, Pexidartnib⁵) is gemeld dat ze als fragmenten zijn begonnen en nu met succes in de klinieken worden gebruikt. Typisch, fragmenten zijn lage molecuulgewicht (<250 Da) organische moleculen met een hoge waterige oplosbaarheid en stabiliteit. Een zorgvuldig samengestelde fragmentenbibliotheek met meestal een paar honderd fragmenten, kan al een efficiënte verkenning van de chemische ruimte beloven. De algemene samenstelling van fragmentbibliotheken is in de loop van de tijd geëvolueerd en werd meestal afgeleid door bekende medicijnen in kleinere fragmenten te ontleden of computationeel te ontwerpen. Deze diverse fragmentbibliotheken bevatten voornamelijk platte aromatische of heteroatomen en houden zich aan de Lipinski-regel van 5 ⁶, of aan de huidige commerciële trendregel van 3 ⁷, maar vermijden reactieve groepen. Sommige fragmentbibliotheken waren ook afgeleid van of samengesteld uit sterk oplosbare metabolieten, natuurlijke producten en of derivaten daarvan⁸. Een algemene uitdaging van de meeste fragmentbibliotheken is het gemak van downstream-chemie.

Het Center for Biomolecular Magnetic Resonance (BMRZ) aan de Goethe-Universiteit Frankfurt is partner van de iNEXT-Discovery (Infrastructure for NMR, EM and X-rays for Translational research-Discovery), een consortium voor structurele onderzoeksinfrastructuren voor alle Europese onderzoekers uit alle domeinen van biochemisch en biomedisch onderzoek. Binnen het vorige initiatief van iNEXT dat in 2019 eindigde, werd een fragmentenbibliotheek bestaande uit 768 fragmenten gemaakt met als doel "minimale fragmenten en maximale diversiteit" die een grote chemische ruimte beslaan. Verder is de iNEXT-fragmentbibliotheek, in tegenstelling tot elke andere fragmentbibliotheek, ook ontworpen op basis van het concept van "gepokte fragmenten" met als doel de downstream-synthese van complexe liganden met hoge affiniteit te vergemakkelijken en voortaan bekend te staan als in-house bibliotheek (Diamond, Structural Genomic Consortium en iNEXT).

Het opzetten van FBDD door NMR vereist mankracht, kennis en instrumentatie. Bij de BMRZ zijn geoptimaliseerde workflows ontwikkeld ter ondersteuning van technische assistentie bij fragmentscreening door NMR. Deze omvatten kwaliteitscontrole en oplosbaarheidsbeoordeling van de fragmentbibliotheek ⁹, bufferoptimalisatie voor de gekozen doelen, ¹H of ¹⁹F- waargenomen 1D-ligandgebaseerde screening, competitie-experimenten om onderscheid te maken tussen orthosterische en allosterische binding, 2D-gebaseerde doelgeobserveerde NMR-experimenten voor epitoopkartering en voor het karakteriseren van de interactie met secundaire set derivaten van de initiële fragmenttreffers. BMRZ heeft geautomatiseerde routines opgezet voor de analyse, zoals ook eerder besproken in de literatuur ^10,11, van kleine molecuul-eiwitinteracties en heeft alle benodigde geautomatiseerde infrastructuur voor NMR-gebaseerde fragmentscreening. Het heeft verzadigingsoverdrachtsverschil NMR (STD-NMR), waterligand waargenomen via gradiëntspectroscopie (waterLOGSY) en Carr-Purcell-Meiboom-Gill-gebaseerde (CPMG-gebaseerde) relaxatie-experimenten geïmplementeerd om fragmenten te identificeren binnen een breed scala aan affiniteitsregimes, evenals state-of-the-art geautomatiseerde NMR-instrumentatie en software voor het ontdekken van geneesmiddelen. Hoewel NMR-gebaseerde fragmentscreening goed ingeburgerd is voor eiwitten, wordt deze aanpak minder vaak gebruikt voor het vinden van nieuwe liganden die interageren met RNA en DNA. BMRZ heeft een proof of concept opgesteld voor nieuwe protocollen die de identificatie van kleine molecuul-RNA / DNA-interacties mogelijk maken. In de volgende secties van deze bijdrage wordt gerapporteerd dat de toepassing van screeningsroutines op eiwit- en RNA-monsters zich bewust maakt van de gevestigde protocollen voor een brede gebruikersbasis in biomacromoleculair onderzoek.

Protocol

1. Fragment bibliotheek

1. In-house fragmentenbibliotheek
   OPMERKING: In het kader van een van de gezamenlijke onderzoeksactiviteiten van de iNEXT werd een robuuste en downstream chemievriendelijke eerste generatie fragmentbibliotheek ontwikkeld¹² en vervolgens werd een tweede generatie van de bibliotheek samengesteld in samenwerking met Enamine en staat bekend als de DSI (Diamond-SGC-iNEXT) -gereed fragmentbibliotheek (vanaf nu aangeduid als "In-house bibliotheek"). Deze bibliotheek kan ter beschikking worden gesteld bij het BMRZ voor screeningsdoeleinden.
   1. Beoordeel de fragmentbibliotheek op integriteit en oplosbaarheid met behulp van een eerder gerapporteerd NMR-gebaseerd protocol⁹.
      OPMERKING: De interne bibliotheek bestaat uit 768 fragmenten met een zeer hoge chemische diversiteit (>200 Singleton). Het uitvoeren van de screening in fragmentmengsels kan de screeningscampagne aanzienlijk versnellen; het aantal fragmenten in een mix is echter beperkt vanwege signaaloverlapping in ¹H-NMR-spectrum. De hogere chemische diversiteit die de interne bibliotheek biedt, maakt het mogelijk om mengsels te bereiden die 12 verschillende fragmenten bevatten zonder enige significante chemische verschuivingsoverlapping in de ¹H waargenomen NMR-spectra.
   2. 103 fragmenten in de 768 fragmenten bezitten een fluoratoom. Verdeel voor ¹⁹F-screeningsdoeleinden alle 103 fragmenten die een fluorgroep bezitten in 5 mengsels op basis van minimaal ¹⁹F chemische verschuivingsoverlapping. Om signaaloverlapping in de ¹⁹F-screening te minimaliseren, gebruikt u de chemische verschuivingsinformatie van metingen met één verbinding om mengsels te ontwerpen met een maximaal aantal fragmenten en minimale signaaloverlapping. Elke mix heeft 20-21 fragmenten met verschillende chemische verschuivingen van ¹⁹F, waardoor een ondubbelzinnige toewijzing van fragmenten mogelijk is.
2. Door de gebruiker gedefinieerde/verstrekte fragmentbibliotheek
   1. Screeningscampagnes uitvoeren met de door de gebruiker gedefinieerde of verstrekte fragmentbibliotheek; De volgende stappen moeten echter voorafgaan aan de screeningscampagne.
   2. Indien niet vooraf door de gebruiker opgegeven, voert u nmr-gebaseerde kwaliteitscontrole van de fragmenten uit (bij de BMRZ worden hiervoor geavanceerde softwaretools gebruikt; ⁹, hoofdstuk 6.1.1).
   3. Controleer de oplosbaarheid van de fragmenten in de buffer-van-keuze voor het biomoleculaire doelwit, de integriteit van de structuur en de concentratie van fragmenten vóór gebruik.
   4. Ontwerp het mengsel om zowel signaaloverlapping in NMR-spectra als meettijd te verminderen.
   5. Ontwerp mengsels volgens stap 4.2.
   6. Scherm afzonderlijke fragmenten of een subset van mengsels in plaats van de hele bibliotheek.

2. Monstervoorbereiding

OPMERKING: High-throughput screening door NMR maakt gebruik van een pipetteerrobot voor monstervoorbereiding. NMR-spectra, maar ook stabiliteiten gedurende meerdere dagen van signaalacquisitie van eiwitten, RNA's en DNA zijn extreem gevoelig voor temperatuurschommelingen en daarom zullen temperatuurgecontroleerde geautomatiseerde systemen de stabiliteit van de monsters die worden gepipetteerd aanzienlijk vergemakkelijken. Voor dit doel wordt een extra add-on-apparaat, dat werkt tussen 4 en 40 °C, gekoppeld aan de pipetteerrobot voor vloeistofbehandeling van de NMR-monsters in een temperatuurgecontroleerde omgeving.

1. Bereiding van ligandmengsels
   1. Bereid screeningsmonsters voor NMR-metingen voor met behulp van een monstervoorbereidingsrobot. De flexibele configuratie van de robot maakt een breed scala aan toepassingen mogelijk (bijv. Terugwinning van de monsters uit NMR-buizen terug in opslagcontainers of algemene vloeistofbehandelingstaken). NMR-buizen met verschillende diameters (1,7, 2,0, 2,5, 3,0 en 5,0 mm) kunnen worden gebruikt. Het monsterrobotsysteem leest samen met de geavanceerde besturingssoftware de barcode die voor elk containertype is toegewezen en voert het vloeistofvulprotocol optimaal uit.
   2. Gebruik voor de bereiding van de interne ligandmengsels van de bibliotheek injectieflacons met streepjescode. De injectieflacons met streepjescode garanderen de hoogste betrouwbaarheid en optimale traceerbaarheid van de monsters.
   3. Verdeel 768 verbindingen over 8 platen van 96-well formaat. De voorraadconcentratie van elk afzonderlijk fragment is 50 mM in d_6-DMSO/D₂O (9:1). Bereid in totaal 64 mixen voor met elk 12 fragmenten. De uiteindelijke concentratie van elk fragment in een mengsel is 4,2 mM.
      OPMERKING: De pipetteerrobot is geschikt voor een verscheidenheid aan containertypen met verschillende geometrieën (cryo- of automatische samplerflacons, 96-putplaten rond of vierkant diep, standaardflacons met streepjescode, microcentrifugebuizen) en helpt bij een efficiënte uitvoering van de vloeistofoverdracht naar een verscheidenheid aan NMR-buizen en -rekken.

Figuur 1: (A) High-throughput NMR monstervoorbereiding en NMR-buis vulrobot geïnstalleerd bij BMRZ. B) Monsterwisselaar met hoge doorvoer met individuele temperatuurgeregelde rekken geïnstalleerd op een 600 MHz-spectrometer in de BMRZ-faciliteit. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

2. Screening monstervoorbereiding blanco (referentieligandspectrum) en met doel (ligand in aanwezigheid van doel)
   1. Gebruik voor de bereiding van de NMR-screeningsmonsters, in aanwezigheid van het doelbiomolecuul (eiwit/RNA/DNA) en het ligandmengsel, 3 mm NMR HT-monsterwisselaarbuizen geselecteerd uit het Bruker NMR-portfolio van standaard NMR-buizen.
   2. Breng het biomoleculaire doelwit (bijv. ¹H-screening: 10 μM RNA of eiwit) in een gedefinieerde screeningbuffer handmatig of met behulp van de pipetteerrobot over in de 3 mm NMR-buis (eindvolume van 200 μL).
   3. Breng 10 μL (bijv. ¹H Screening) van het ligandmengsel in de volgende stap met behulp van het robotsysteem over in de 3 mm NMR-buizen met streepjescode die het doelbiomolecuul bevatten en meng met behulp van het ingebouwde protocol van de besturingssoftware.
      OPMERKING: Het barcodenummer van de NMR-buis wordt gemakkelijk en automatisch opgenomen in de verworven NMR-dataset, waardoor een ID-georiënteerde workflow zonder enige verwarring wordt gegarandeerd. Het pipetteerrobot-temperatuurregelaccessoire maakt het mogelijk om de voorbereide monsters in de NMR-buizen onder constante temperatuur te houden.
3. In-house gedefinieerde voorwaarden en parameters
   1. Stel optimale buffercondities vast voor het uitvoeren van screening van RNA en eiwit tegen de interne fragmentbibliotheek. Voor het RNA bij de BMRZ wordt het volgende monster geconditioneerd: 25 mM KPi, 50 mM KCl, pH 6,2. Mg²⁺ is optioneel.
   2. Eiwitten zijn extreem gevoelig voor oplossingsomstandigheden; Gebruik buffers die optimaal zijn voor het doel van keuze. Verkrijg voor elk van deze buffers aanvullende referentiespectra van de liganden om als blanco voor de analyse te dienen.
4. Door de gebruiker gespecificeerde voorwaarden
   OPMERKING: In gevallen waarin de intern vastgestelde omstandigheden niet geschikt zijn om de doelen te screenen van een potentiële gebruiker, moeten de volgende stappen worden uitgevoerd.
   1. Voer ^{alleen 1}H-NMR van de buffer uit om minimale interferentie van de componenten van de buffer te garanderen bij het uitvoeren en analyseren van de ligand-geobserveerde screeningsexperimenten. Storende componenten kunnen op passende wijze worden vervangen door gedeutereerde equivalenten.
5. Beperkingen in de monsterproductie (streefhoeveelheden)/omstandigheden en beschikbaarheid
   OPMERKING: Isolatie of recombinante productie van bepaalde biomacromoleculen kan in bepaalde gevallen een uitdaging zijn en resulteren in een beperkte beschikbaarheid van het doelwit om een succesvolle screeningcampagne voor geneesmiddelen na te streven. In gevallen van beperkte of onbeperkte beschikbaarheid van de doelen, kunnen de volgende alternatieven worden gebruikt voor het uitvoeren van een succesvolle NMR-gebaseerde fragmentscreening.
   1. Indien beperkt, gebruik ¹⁹F-NMR gebaseerde screening. Typische gefluoreerde liganden hebben een enkel signaal van ¹⁹F; Gebruik daarom cocktails met 25-30 fragmenten zonder enige signaaloverlapping. Er zijn minder signalen om te analyseren, geen signaalinterferentie van buffercomponenten en minder signalen om op te vertrouwen voor hitidentificatie.
   2. Indien onbeperkt, gebruik dan grotere schermen zoals ¹H-NMR. De grotere fragmentenbibliotheek kan worden gescreend. Meestal zijn fragmenten samengesteld uit meer dan één proton, wat betekent dat er meer signalen zijn om op te vertrouwen voor de analyse.

3. NMR-verwervingsvoorwaarden

1. In-house algemeen gedefinieerde voorwaarden
   1. Spectrometer uitgerust met HT-monsterwisselaar (automatisering)
      1. Gebruik voor high-throughput screening 96-well platen die alleen kunnen worden gemeten met behulp van een HT-monsterwisselaar. De HT-monsterwisselaar biedt ook de mogelijkheid om elk rek afzonderlijk te temperen.
      2. Gebruik voor een optimale signaal-ruis een spectrometer met een cryogene sonde die helium- of stikstofgekoeld is. Een geautomatiseerde tunning en matching module (ATM) zijn noodzakelijk voor automatisering.
   2. Parametersets & pulssequenties
      OPMERKING: Veel NMR-experimenten kunnen bindingsgebeurtenissen karakteriseren. De hitidentificatie varieert afhankelijk van de experimentele opstelling. De volgende experimenten worden routinematig gebruikt in BMRZ-screeningscampagnes. Niettemin kunnen wijzigingen worden aangebracht voor door de gebruiker gedefinieerde screeningcampagnes en volgens gebruikersspecificaties.
      1. Als u TopSpin-software gebruikt, neemt u de parameterset op voor op ligand gebaseerde experimenten: SCREEN_STD, SCREEN_T1R, SCREEN_T2, SCREEN_WLOGSY. De parameterset omvat alle benodigde parameters en de pulssequenties: STD: stddiffesgp.3; T_1ρ: t1rho_esgp2d; T₂: cpmg_esgp2d; en waterLOGSY: ephogsygpno.2.
      2. Gebruik voor alle genoemde experimenten excitatiesculptuur¹³ als wateronderdrukking. Gebruik voor een referentie 1D excitatiesculpting (zgesgp). Het aantal scans is afhankelijk van de gevoeligheid van het systeem (magnetische veldsterkte en sondekop), de monsterconcentratie en de keuze van het experiment. Een aanbeveling is: 1D met NS=64, T_1ρ &_{T 2} met NS=128, STD met NS=256 en waterLOGSY met NS= 384 of 512.
      3. Gebruik voor de 19 F-screening zowel 1D- als T 2-experimenten: 1D: F19CPD (pp = zgig) voor 19 F {1 H}-sondekop en F19 (pp = zg) voor ¹⁹F / ¹H-sondekop; SCREEN_19F_T2 (pp = cpmgigsp).
      4. Gebruik een spectrale breedte van 220 ppm en een excitatiefrequentie bij -140 ppm. De experimenteertijd ligt tussen 1 en 5 uur (zorg voor de stabiliteit van het biomacromolecuul op lange termijn), afhankelijk van de hardware en de monsterconcentratie. Voor T₂ moet de CPMG-tijd afwisselend tussen 0 ms en 200 ms liggen.
   3. Verwerking
      1. Registreer de SOA-, T-_{, 1ρ} - en T-2-experimenten als_pseudo-2D . Om de twee enkele 1D-spectra te verwerken, gebruikt IconNMR het au-programma proc_std met of zonder de optie ontspannen. De eerste optie biedt de referentie 1D en het verschil van twee spectra. De tweede optie levert twee afzonderlijke spectra op met korte en lange ontspanningstijd. De waterLOGSY is een enkele 1D die gefaseerd moet worden met een negatief voor het oplosmiddelsignaal.
2. Gebruikersspecifieke voorwaarden
   1. Pas een van de eerder genoemde parameters aan de door de gebruiker gedefinieerde omstandigheden aan. Als een door de gebruiker geleverde eiwit bijvoorbeeld niet stabiel is bij de algemeen gebruikte temperatuur, kunnen optimalisatie-experimenten worden uitgevoerd met verschillende temperaturen, concentratie, buffercondities, enz.

4. Data-analyse

1. Fragmentbibliotheek QC (d6-DMSO/specifieke buffer) en kwantificering
   1. Cmc-q
      OPMERKING: Kwaliteitscontrole van fragmentbibliotheken is essentieel voorafgaand aan het starten van screeningcampagnes. Bovendien moet de stabiliteit van de fragmentenbibliotheek op lange termijn worden gewaarborgd voor de toepassing van verschillende screeningscampagnes, daarom moet een periodieke evaluatie van de kwaliteit van de bibliotheek worden uitgevoerd. Hiervoor wordt de geïntegreerde software CMC-q en CMC-a van TopSpin gebruikt voor kwaliteits- en kwantiteitsbeoordeling. De CMC-q en CMC-a zijn softwaremodules binnen Topspin die een soepele acquisitie, analyse inclusief structuurverificatie mogelijk maken met behulp van ¹H-NMR-spectrum verkregen uit kleine organische moleculen ⁹.
      1. Bereid voor de integriteit beoordelingsmonsters voor met een fragmentconcentratie van 1 mM in d6-DMSO. Bereid monsters op een geautomatiseerde manier voor met een pipetteerrobot door vloeistofmonsterverzameling in een NMR-buis van 3 mm te vullen.
      2. Gebruik voor de beoordeling van de oplosbaarheid een monster bestaande uit 1 mM-verbinding in 50 mM natriumfosfaatbuffer bij pH 7,4, 150 mM natriumchloride, 90% H 2 O/ 10% D 2O en 1 mM 3-(trimethylsilyl)propionzuur-2,2,3,3-d4 zuur natriumzout (TMSP-Na).
      3. Verzamel NMR-spectra bij 298 K of 293 K met behulp van een 600 MHz NMR-spectrometer uitgerust met drievoudige resonantie 5 mm TCI cryogene sonde en een HT-monsterwisselaar, die 579 monsters tegelijk kan verwerken.
      4. Volg voor het instellen van CMC-q-software de instructies van de gebruikershandleiding, die het maken van een IconNMR-gebruiker, de activering van FastLaneNMR en het wijzigen van de HT-monsterwisselaar implementeert.
      5. Kalibreer de 90° puls en sla deze op in de TopSpin prosol tabel.
      6. Plaats de 96 monsterputplaat in een van de 5 rackposities in de HT-monsterwisselaar.
      7. Als u een SDF-bestand (structuurgegevensbestand) wilt laden dat de voorgestelde chemische structuur, een unieke id en de positie in de HT-monsterwisselaar van elk monster in een batch moet bevatten, gaat u naar Bladeren in het venster CMC-q-instellingen en klikt u op Openen nadat u een bestand hebt geselecteerd dat eindigt op .sdf.
      8. Stel in de cmc.q Batch Automation-instellingen het verificatietype in dat het experiment definieert dat wordt gemeten, de IconNMR-gebruiker en definieer het oplosmiddel.
      9. Definieer SDF-bestanden voor het pad voor SDF-bestand, de molecuul-ID en de monsterpositie.
      10. Start de acquisitie door op Start te klikken. Klik nogmaals op Acquisitie starten . De CMC-q Setup kan ook worden opgeslagen door op Opslaan te klikken.
      11. Voor een gedetailleerde beschrijving van de installatiestappen van CMC-q volgt u de instructies van de gebruikershandleiding van Bruker.
   2. Cmc-a
      1. Gebruik voor CMC-a de softwaremodule binnen Topspin die analyse mogelijk maakt, inclusief structuurverificatie met behulp van 1H-NMR-spectrum verkregen uit kleine organische moleculen⁹.
2. Mengsel ontwerp
   OPMERKING: Een goed mengselontwerp speelt een belangrijke rol bij het screenen met NMR als platform. Een hoog aantal fragmenten per mengsel maakt een snellere screening mogelijk, maar verhoogt het risico op fout-positieve en negatieven. Een lager aantal vermindert dat risico, maar verhoogt de tijd die nodig is om de screening uit te voeren. Over het algemeen moet een signaaloverlapping worden vermeden bij het maken van mengsels. Met behulp van de interne bibliotheek kan dit worden verwaarloosd voor de ¹H-screening, omdat de bibliotheek specifiek is ontworpen om divers te zijn en weinig signaaloverlapping te vertonen met behoud van een hoge chemische diversiteit. Dit betekent op zijn beurt dat er geen speciale ontwerpprocedure hoeft te worden ondergaan voor het maken van de 64 mixen.
   1. Aangezien de ¹⁹F-screening afhankelijk is van de fragmenten van de interne bibliotheek die fluor bevatten en de bibliotheek niet is gemaakt om de signaaloverlapping voor deze specifieke fragmenten te verminderen, ontwerpt u een goed mengsel.
   2. Meet enkelvoudige samengestelde spectra voor alle fragmenten die ¹⁹F bevatten.
   3. Noteer de chemische verschuivingsinformatie van elk signaal.
   4. Kies volgens deze informatie 20-21 fragmenten per mengsel. Dit geeft op zijn beurt 5 mengsels die elk 20-21 fragmenten bevatten zonder signaaloverlapping en maakt een semi-geautomatiseerde analyse van de gegevens mogelijk.
3. Voer hitidentificatie uit binnen een ligand waargenomen biomacromolecuul-ligand interactie
   OPMERKING: Er zijn verschillende definities van een hit tussen de ¹⁹F- en ¹H-screeningsprocedure. De volgende hitidentificaties zijn door ons opgezet en volgen specifieke regels. Het onderwerp hitbepaling is een zeer subjectieve manier en kan van gebruiker tot gebruiker verschillen. Niettemin is het van het grootste belang dat de regels voor hitidentificatie niet veranderen zodra ze zijn overeengekomen om de validatie en geloofwaardigheid te behouden.
   1. ¹H-scherm
      1. Om met vertrouwen treffers te bepalen, verwerven 1D ¹H-spectra, waterLOGSY en T 2-relaxatie-experimenten, zowel in de aan- als afwezigheid van het doelwit om bindmiddelen te identificeren. Alle drie de experimenten hebben het potentieel om een bindende gebeurtenis aan te tonen. Als een CSP van meer dan 6 Hz zichtbaar is in de monsterspectra in vergelijking met de blancospectra, wordt dit beschouwd als een indicatie voor een treffer. Hetzelfde geldt als een sterk positief signaal in de waterLOGSY en meer dan 30% T_2-reductie in de monsterspectra zichtbaar is. Bindingsgebeurtenissen kunnen in alle drie de experimenten worden getoond wanneer het monster met spectra wordt vergeleken met hun respectieve blancospectra. Het is echter mogelijk dat bindingsgebeurtenissen niet in alle drie de experimenten zichtbaar zijn. Daarom werd afgesproken dat ten minste twee van de eerder beschreven gebeurtenissen moeten plaatsvinden om een fragment als bindende treffer te classificeren.
      2. Gebruik het FBS-gereedschap in TopSpin om de status van fragmenten te definiëren in bindend, dubbelzinnig, onbekend, geaggregeerd en niet-bindend.
      3. Wanneer u klaar bent met een mix, keurt u deze goed in de FBS-tool.
      4. Klik op het tabblad Samenvatting binnen het FBS-project op Een screeningsrapport maken. Dit opent een venster dat een .xlsx bestand maakt. De gebruiker kan er dan voor kiezen om te kiezen tussen alle liganden, alleen bindend ligand, niet bindend ligand alleen en dubbelzinnige liganden die in de spreadsheet moeten worden gerapporteerd.
   2. ¹⁹F-scherm
      1. Om onderscheid te maken tussen niet-bindmiddel, weekbindmiddel en sterk-bindmiddel, deelt u het integratiequotiënt tussen de doelmeting van 200 ms en de blancometing van 200 ms door het quotiënt van de 0 ms-doelmeting en wordt de blancometing van 0 ms gebruikt:
         
         OPMERKING: Dit geeft waarden variërend van 0 tot ~1 (de hit-score), waardoor het mogelijk is om drempels toe te wijzen voor elke bindingsstatus.
      2. Gebruik het gemiddelde van de referentiemeting van 200 ms als basisdrempel om gevallen te markeren waarin de hitscore hoger is dan 1. Dit kan gebeuren als de geïmporteerde integralen negatieve waarden bevatten of als de referentiemeting hoger is dan de doelmeting. Een hit-score van ≤ 0,67 wordt beschouwd als een zwakke hit, < 0,33 als een sterke hit en alles > 0,67 als no-hit. Een voorbeeld is te zien in figuur 2.

Figuur 2: Hitidentificatie voor de ¹⁹F-screening. Sectie van ¹⁹F CPMG NMR spectra van een voorbeeldige verbinding. Deze afbeelding verklaart de eigenschappen van een bindmiddel. ¹⁹F-CPMG-spectra van een verbinding verkregen van mengselmonsters in de aan- en afwezigheid van RNA. De waarden vertegenwoordigen de genormeerde integraalwaarden van de overeenkomstige piek. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

4. Data-analyse
   1. Gegevens voorbereiden voor analyse
      OPMERKING: Het is belangrijk dat de verkregen gegevens geen zichtbare gebreken hebben. Dit betekent dat gegevens waarbij de shimming problematisch was of wateronderdrukking onvoldoende was, niet in aanmerking mogen worden genomen voor analyse. In plaats daarvan wordt aanbevolen om gegevens opnieuw vast te leggen en ervoor te zorgen dat alles in orde is met het monster (bijvoorbeeld geen luchtbellen), met de temperatuur, het schuiven en wateronderdrukking. De juistheid van gegevens kan altijd worden beoordeeld bij het vergelijken van DMSO-signalen.
   2. ¹H-screening
      1. Om ¹H-screeningsgegevens te analyseren, gebruikt u de FBS-tool (heeft een extra licentie nodig) in TopSpin 4.0.9.
      2. Volg de instructies in de handleiding van de FBS-tool om te beginnen met de gegevensanalyse. De volgende stappen vatten de procedure samen die in de handleiding wordt beschreven.
      3. Sla de BMRZ NMR-gegevens van screeningscampagnes zodanig op dat elk verschillend screeningsmengsel een eigen directory heeft waarin een subdirectory de verschillende experimenten bevat die op het monster zijn gemeten.
      4. Voor het gebruik van de FBS-tool slaat u de referentiespectra op met alle gegevens die zijn opgeslagen uit monsters zonder het biomoleculaire doelwit, maar met de mengsels en de enkele verbinding gemeten in verschillende /nmr-mappen. Dit is belangrijk omdat de FBS-tool om het mappad van elk afzonderlijk vraagt.
         OPMERKING: De FBS-tool herkent een map als een screeningsproject als de volgende gegevenssets zijn opgeslagen in dezelfde map waar de mengsels van een screeningsmonster zijn opgeslagen (csv, FragmentScreen XML-documenten en BAK-bestand).
      5. Maak bij gebruik van TopSpin 4.0.9 een direct pad naar de map met de verkregen gegevens, een zogenaamde DIR. Kies de /nmr-map waarin alle mengsels een aparte map moeten hebben.
      6. Als u het FBS-gereedschap van een gescreend voorbeeld wilt starten, sleept u het symbool FBS-project naar het midden van het TopSpin-venster. In de gekozen map moet het FBS-projectsymbool verschijnen als eerder genoemde gegevenssets erin zijn gekopieerd.
      7. Het venster Opties voor fragmentgebaseerde screening wordt automatisch geopend wanneer een nieuw FBS-project voor het eerst wordt geladen. Kies in dit venster een cocktailbestand. Het cocktailbestand is een csv-bestand met de toewijzing van de naam van de mixen, de naam van elk fragment en hun verdeling in de mixen. Definieer ook een referentie ligand spectra map die alle gemeten spectra van de afzonderlijke fragmenten heeft. Definieer ten slotte een lege referentie-experimentmap, meestal de map met de gegevenssets van de mixen zonder het onderzochte doel.
      8. De Fragment Based Screening Options heeft een tabblad genaamd Spectra types waarmee men de onderzochte spectra kan definiëren, evenals de kleur voor het weergeven van de spectra. Stel het Spectype in op basis van de vooraf verwerkte gegevens. Definieer op het tabblad Weergave-indeling de spectra die met elkaar worden vergeleken op basis van hun spectypes.
      9. Druk op OK om het FBS-project te starten.
      10. Terwijl u naar de gegevens kijkt, wordt een apart venster geopend met een samenvatting van alle cocktailmixen en alle liganden van elke mix in een tabel. Door te dubbelklikken op een cel, worden de respectievelijke datasets geopend, waarbij bijvoorbeeld 1 H ^1DBlank spectra wordt vergeleken met de dataset die het doel bevat.
      11. Voordat u bindmiddelen toewijst, moet u ervoor zorgen dat referentiepieken (DMSO van alle metingen en de afzonderlijke verbindingen) met elkaar overeenkomen en dezelfde chemische verschuiving hebben. Als er verschillen worden waargenomen, corrigeer deze dan met behulp van de seriële verwerkingsoptie van TopSpin.
      12. De optie voor seriële verwerking bevindt zich op het tabblad Proces onder Geavanceerd. Het past wijzigingen toe op alle geselecteerde spectra uit een gegevensset. Op deze manier kunnen spectypes eenvoudig worden toegewezen aan experimentnummers en kunnen alle spectra in één keer worden verschoven om uit te lijnen met de referentie.
   3. ¹⁹F Screening
      1. Maak voor de eerste analyse van de ¹⁹F-mengsels een integratiebestand voor elke mix. Om het integratiegebied te definiëren, klikt u op de functie Integreren op het tabblad Analyseren . Zorg ervoor dat voor elk fragment in het mengsel een duidelijk integratiegebied voor de ^{overeenkomstige 19}F-singal is gedefinieerd.
      2. Gebruik de knop Integratiegebieden opslaan/ exporteren om het integratiebestand te exporteren voor toekomstig gebruik. Sla alle gebruikte integratiebestanden op in C:\Bruker\TopSpin4.0.9\exp\stan\nmr\lists\intrng, of het bijbehorende pad van de TopSpin installatiemap.
      3. Voor ¹⁹F-gegevens opent u een gegevensset met of zonder het onderzochte doel.
      4. Om het integratie-bestand in het huidige spectrum te laden, opent u het tabblad Analyseren opnieuw, gaat u naar Integreren en gebruikt u de knop Integratiegebieden lezen/importeren en laadt u het bijbehorende integratiebestand. Hiermee worden alle gedefinieerde regio's van dat bestand in het huidige spectrum geladen.
      5. Sla op en ga terug naar een lijst met alle geïntegreerde regio's op het tabblad Integralen . Kopieer dit naar een spreadsheet of een andere tool die wordt gebruikt voor de verdere analyse van de gegevens.
      6. Herhaal deze procedure voor elke mix, met en zonder doel.
   4. Gegevensbeheer
      1. Zorg voor gebruiksgemak en productiviteit voor een uniforme werkstroom voor de verdere analyse en opslag van de verkregen gegevens. Gebruik voor ^{zowel de 1}H- als de ¹⁹F-screening een speciaal ontworpen spreadsheet voor elk.
         OPMERKING: Voor de ¹H-screening werd dit puur gebruikt voor gegevensbeheer en om elk doel samen te vatten, terwijl het voor de ¹⁹F-screening het in hoofdstuk 4.3 uitgelegde quotiënt gebruikte om elk fragment automatisch als hit / geen hit te labelen nadat de integrale gegevens erin waren gekopieerd. Dit vermindert het risico op menselijke fouten tijdens de analyse, ervan uitgaande dat het bestand correct is ingesteld, en maakt het delen van informatie gemakkelijker, omdat alle belangrijke informatie op één plaats wordt verzameld in een bestand dat door vrijwel iedereen kan worden geopend zonder dat er verdere programma's nodig zijn om de gegevens voor het eerst bekijken.

Results

Kwaliteitscontrole van fragmentenbibliotheek
De fragmenten uit de eigen bibliotheek werden geleverd als 50 mM stockoplossingen in 90% d6-DMSO en 10% D 2 O (10% van D₂O zorgt voor minimalisering van de afbraak van verbindingen als gevolg van herhaalde vries-dooicycli¹⁴). Enkelvoudige samengestelde monsters bestonden uit 1 mM ligand in 50 mM fosfaatbuffer (25 mM KPi pH 6,2 + 50 mM KCl + 5 mM MgCl 2), pH 6,0 in 90% H 2 O/9% D₂O/1% d6-DMSO. ¹H-NMR experimenten van fragmenten uit de iNEXT bibliotheek werden gemeten op een 500/600 MHz NMR spectrometer. Deze gegevens werden verder gebruikt voor het identificeren van de afzonderlijke verbindingen in ¹H-screeningscampagnes met behulp van de CMC-q-software waarmee de gebruiker op een geautomatiseerde manier spectra volledig kan verwerven en de analyse-addon CMC-a de kwaliteit (oplosbaarheid en integriteit) van fragmenten werd beoordeeld. De resultaten van de geautomatiseerde analyse van CMC-a worden weergegeven als een grafische uitvoer die vergelijkbaar is met wat wordt weergegeven in figuur 3. De grafische uitvoer toont een weergave van een 96-well plaat. Een rood gekleurde cirkel betekent dat dit fragment inconsistentie in structuur of concentratie vertoont. Groen gekleurde putjes geven aan dat het fragment consistent is.

Figuur 3: Kwaliteitscontrole van fragmentbibliotheek. Schematische weergave van CMC-a gebaseerde geautomatiseerde uitvoer. Fragmenteigenschappen zoals concentratie en structurele integriteit worden beoordeeld. Groen staat voor consistent, oranje staat in dit geval voor inconsistent. Inconsistente fragmenten worden handmatig herzien volgens de weergegeven workflow. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Ongeveer 65% en 35% van de fragmenten werden geclassificeerd als respectievelijk consistent en inconsistent, in zowel DMSO als buffer. Verder werd 30% van de inconsistente geclassificeerde liganden consistent na een zorgvuldige handmatige inspectie van de spectra⁹.

¹⁹F Mengsel ontwerp
103 fragmenten met een of meerdere fluorgroepen uit de eigen bibliotheek werden verdeeld in 5 mixen (A, B, C, D, E). Elke mix heeft 20 tot 21 fragmenten. In dit geval moesten de mengsels zorgvuldig worden ontworpen om signaaloverlapping te voorkomen. ¹⁹F transversale relaxatie-experimenten werden gemeten voor elk mengsel dat CPMG-pulstreinen toepast. Deze experimenten kunnen worden aangepast door de ontspanningsvertragingen te variëren. De chemische verschuiving van ¹⁹F van mengsels A-E is te zien in figuur 4.

Figuur 4: ¹⁹F 1D-NMR spectra van mengselmonsters uit de eigen bibliotheek. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Monstervoorbereiding
De monstervoorbereiding in de ¹⁹F-screeningsprocedure werd handmatig uitgevoerd of met geautomatiseerd pipetteren met behulp van een pipetteerrobot. De fragmenten in elk mengsel hadden een concentratie van 2,5 mM in 90% d6-DMSO en 10% D₂O. Het uiteindelijke volume van een zeefmonster was 170 μL met 5% D₂O als vergrendelingsmiddel. Elk mengsel werd twee keer gepipetteerd, één in een bufferhoudende oplossing (zonder doel) en één in een doelhoudende bufferoplossing. De verhouding tussen doel en fragment werd ingesteld op 1:1, wat resulteerde in een uiteindelijke doel/ligandconcentratie van 50 μM. Bovendien zijn controlemonsters het doelbiomolecuul in de screeningsbuffer zonder mengsel om de doelintegriteit te waarborgen, evenals een controlemonster met alleen buffer en D₂O om de bufferkwaliteit te waarborgen.

NMR-screeningsgegevens van 19 F-1D en ¹⁹F-CPMG-T₂ waren metingen zoals beschreven in rubriek 3.1. In het geval van RNA werd bijvoorbeeld een jump-return echosequentie (pp = zggpjrse,15) verkregen voor het enkele doelmonster in buffer.

Data-analyse
De ¹⁹F-screeningsprocedure werd toegepast op de TPP-riboswitch thiM van E. coli en eiwittyrosinekinase (PtkA) van M. tuberculosis onder verschillende andere doelen¹⁶. De ¹⁹F-zeefbibliotheek heeft 103 fragmenten die zijn verdeeld in 5 mixen met het label van Mix A tot E. Voorbereiding van zeefmonsters kan handmatig worden uitgevoerd zonder het gebruik van een monsterpipetteerrobot. 40 μM thiM RNA bevattende oplossing (buffercondities) werd gemengd met 3,2 μL uit de mengsels. Verdere controlemonsters werden bereid bestaande uit alleen buffer, buffer met 5% DMSO (voorheen zorgen voor de stabiliteit van het biomacromolecuul in aanwezigheid van de gewenste DMSO-concentratie) en buffer met RNA. Deze 13 zeefmonsters werden voorbereid en overgebracht naar 3 mm NMR-buizen. Barcodes van NMR-buizen worden gescand en elk mengsel in de aan- en afwezigheid van RNA, evenals controlemonsters werden gemeten volgens de bovengenoemde ¹⁹F NMR-experimenten uitgevoerd bij 298 K. Screening van thiM-RNA tegen de interne bibliotheek werd uitgevoerd door T_2-metingen uit te voeren met CPMG's van 0 ms en 200 ms voor elk verschillend monster. De juiste shimming en wateronderdrukking werden na het voltooien van de metingen gecontroleerd door alle DMSO-pieken te vergelijken in termen van lijnverbreding en intensiteitsverlies van aanvullend gemeten ¹H 1D-experimenten voor alle monsters. De verwerking van verkregen CPMG T₂¹⁹F relaxatiespectra werd uitgevoerd met behulp van respectievelijk een eerder voorbereide en geautomatiseerde macro in TopSpin. De gegevensanalyse werd uitgevoerd volgens de instructies in de protocolsectie. De integrale gegevens verkregen van TopSpin (volgens de instructies in het protocol) kunnen snel en eenvoudig worden geëvalueerd met behulp van een vooraf gemaakte spreadsheet of een vergelijkbaar programma, door de juiste voorwaarden en drempels in te stellen. Zoals eerder beschreven, zijn drempelwaarden nuttig bij het definiëren van bindmiddel, zwak bindmiddel of niet-bindmiddel. Figuur 5 toont typische resultaten van CPMG-spectra van respectievelijk thiM-RNA en PtkA. In sommige gevallen was verdere herziening door deskundigen nodig. 

Figuur 5: Uitgesneden uit ¹⁹F CPMG NMR-spectra die de intensiteitsveranderingen laten zien die zijn verkregen uit verschillende vertragingstijden van CPMG-gebaseerde experimenten . (A) Representatie van een bindmiddel (hit) en een niet-bindmiddel in ¹⁹F fragment-gebaseerde screening uitgevoerd op TPP riboswitch thiM RNA van E. coli. (B) Weergave van een bindmiddel en een niet-bindmiddel in ¹⁹F fragment-gebaseerde screening uitgevoerd op PtkA van M. tuberculosis. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

¹uur screening

Mengsel ontwerp
De gebruikte in-house bibliotheek is zo divers dat voor ¹H screening doeleinden geen mengsel ontwerp werd uitgevoerd. Dit betekent dat 64 mixen werden bereid door willekeurig 12 te kiezen om in één mengsel te mengen.

Monstervoorbereiding
Voor de ¹H-screening van een voorbeeldig SARS-CoV-2 RNA werd geautomatiseerd pipetteren met behulp van een pipetteerrobot uitgevoerd om de monsters voor te bereiden. De fragmenten in elk mengsel hadden een concentratie van 4,2 mM in 90% d6-DMSO en 10% D₂O. Het uiteindelijke volume van een zeefmonster was 200 μL met 5% D₂O als vergrendelingsmiddel. 64 monsters die elk een ander mengsel bevatten in 25 mM KPi, 50 mM KCl bij pH 6,2 werden gepipetteerd zonder doel-RNA. Respectievelijk werden 64 monsters gepipetteerd met doel-RNA, elk met een ander mengsel. De RNA:Ligand verhouding werd ingesteld op 1:20, wat resulteerde in een RNA-concentratie van 10 μM en een ligandconcentratie van 200 μM.

Data-analyse
Voor de ¹H-analyse is gebruik gemaakt van de FBS-tool in TopSpin. Om te bepalen of een fragment een hit is, werden 1D chemische verschuiving, waterLOGSY en T₂ relaxatie-experimenten uitgevoerd. Voor T_2-relaxatie werd een afname van de intensiteit groter dan 30% als een hit geteld, terwijl voor de chemische verschuiving een verschuiving van meer dan 6 Hz de cut-off was. De waterLOGSY moest een significante signaalverandering laten zien (van negatief naar positief in dit geval). Als twee van deze drie criteria positief waren, werd een fragment als een hit geteld. Twee voorbeelden hiervan zijn te zien in figuur 6.

Figuur 6: ¹H-screening uitgevoerd op een voorbeeldig SARS-CoV-2 RNA met hitbepalingscriteria. Acquisitie van drie verschillende experimenten (1 H T₂ CPMG (5/100 ms), waterLOGSY en 1D ¹H). Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Hit-1 toont een T₂ afname van ~50% en een CSP ≥ 6 Hz. De waterLOGSY vertoont niet significant genoeg verandering in signaal om ook als positief te worden geteld. Omdat twee van de drie experimenten positief zijn, wordt dit fragment als een hit geteld. Voor Hit-2 vertoont de T₂ een afname van ~80% signaalintensiteit en is er een duidelijke signaalverandering te zien voor de waterLOGSY. De CSP is in dit geval niet voldoende, maar omdat de twee voorgaande criteria positief zijn, wordt deze nog steeds als een hit geteld.

Discussion

Veelzijdigheid van de NMR-gebaseerde fragment/drug screening. BMRZ heeft met succes state-of-the-art geautomatiseerde NMR-instrumentatie geïmplementeerd, evenals STD-NMR, waterLOGSY en ontspanningsexperimenten om fragmenten te identificeren binnen een breed scala aan affiniteitsregimes voor het ontdekken van geneesmiddelen. De geïnstalleerde hardware omvat een high-throughput monstervoorbereidingsrobot en high-throughput monsteropslag, wisselaar en data-acquisitie-eenheid gekoppeld aan een 600 MHz spectrometer. Een recent aangeschafte cryogene sonde voor 1 H, 19 F, ¹³C en ¹⁵N zorgt voor de vereiste gevoeligheid voor de voorgestelde metingen ^{en maakt 1}H (¹) ontkoppeling mogelijk tijdens ¹⁹F detectie. Deze sonde is aangesloten op de nieuwste generatie NMR-console die de mogelijkheid biedt om de geavanceerde softwaretools van Bruker te gebruiken, waaronder CMC-q, CMC-assist, CMC-se en FBS (inbegrepen in TopSpin). De fragment-based screening (FBS) tool is opgenomen in de nieuwste versie van TopSpin en helpt bij het analyseren van de high-throughput data bestaande uit STD, waterLOGSY, T₂/T_1r-relaxatie experimenten. De vloeibare 1D 1H monsterverzameling kan op geautomatiseerde wijze in de NMR-buizen worden gevuld met behulp van de monstervulrobot. Meestal wordt een blok van 96 buizen (3 mm) in ongeveer twee uur gevuld. De 96-well-plate-racks zijn direct geplaatst in de HT-monsterwisselaar, die de barcode van het blok leest en de NMR-buizen toewijst aan de experimenten die worden bestuurd door de automatiseringssoftware (IconNMR). Vijf 96-well-plate-racks kunnen tegelijkertijd in de HT-monsterwisselaar worden opgeslagen en geprogrammeerd. De temperatuur van elk van de afzonderlijke racks kan afzonderlijk worden geregeld en geregeld. Bovendien kan elk afzonderlijk monster vóór de meting worden voorgeconditioneerd (voorverwarmen en buisdrogen voor het verwijderen van gecondenseerde vochtigheid) tot de gewenste temperatuur.

Geschikt voor een breed scala aan toepassingen. Een van de brede toepassingen van deze geautomatiseerde NMR-gebaseerde screening is het identificeren en ontwikkelen van nieuwe liganden die binden aan een biomacromoleculair doelwit (DNA/RNA/Eiwitten). Deze liganden kunnen orthosterische en allosterische remmers bevatten die meestal niet-covalent binden. Verder wordt FBDD door NMR meestal gebruikt als een eerste stap om veelbelovende verbindingen te selecteren, de vereisten waaraan moet worden voldaan, zijn beschikbaarheid van het biomoleculaire doelwit in voldoende hoeveelheden. Deze doelstelling is verdeeld in twee grote taken.

Taak één is het ontwikkelen en karakteriseren van een interne fragmentenbibliotheek om de volgende redenen: initiële en periodieke kwaliteitscontrole, karakterisering en kwantificering van meer dan 1000 fragmenten; bepaling van de oplosbaarheid van de fragmenten in buffers die voor elk doelwit zijn geoptimaliseerd, met name voor eiwitdoelen; en de oprichting van verschillende bibliotheken om verschillende steigers te huisvesten en uit te breiden naar andere macromolecuulklassen. Taak twee is het integreren van workflows voor fragment-based drug design (FBDD) door NMR met behulp van: geautomatiseerde 1D-ligand geobserveerde screening (¹H en ¹⁹F waargenomen); geautomatiseerde vervangingstesten (competitie-experimenten met (natuurlijk) ligand) om orthosterische en allosterische binding te onderscheiden; geautomatiseerde secundaire screenings met meerdere fragmenten; geautomatiseerde 2D-eiwitscreening en secundaire screening van een reeks derivaten rond een eerste treffer waarbij gebruik wordt gemaakt van de EU-OPENSCREEN-bibliotheek of een andere bibliotheek; en herprofilering screening van FDA-bibliotheek tegen de gekozen doelen.

Bovendien kan metabotypering van verschillende cellijnen (ziekterelevant) worden uitgevoerd om de regulerende mechanismen te ontrafelen die de controle van de celcyclus en het metabolisme met elkaar verbinden. Ook is er functionele karakterisering van RNA / DNA / eiwitregulatie-elementen in vivo en in vitro voor optimalisatie van construct / domeinoptimalisatie (stabiliteitsoptimalisatie voor structureel onderzoek (buffer-, pH-, temperatuur- en zoutscreening), en een uitbreiding van NMR-gebaseerde fragmentscreening naar membraaneiwitten en intrinsiek ongeordende eiwitten, die over het algemeen ontoegankelijk zijn voor andere technieken.

Beperkingen. Het gebruik van ¹⁹F- en ¹H-fragmentenbibliotheken heeft zijn voor- en nadelen, waarvan er enkele in het volgende zullen worden genoemd. Het grootste voordeel van ¹⁹F versus ¹H-metingen is de snelheid van zowel de werkelijke meettijd als de daaropvolgende analyse, omdat de mengsels bijna het dubbele aantal fragmenten bevatten en er minder experimenten hoeven te worden uitgevoerd. De vervolganalyse is ook eenvoudiger voor ¹⁹F-screening, omdat er geen interferentie van buffers is en bovendien een breder chemisch verschuivingsbereik biedt met bijna geen signaaloverlapping voor een optimaal ontworpen fragmentmengsel. De spectra zelf zijn sterk vereenvoudigd en hebben meestal slechts één of twee signalen per fragment, afhankelijk van het aantal fluoratomen. De analyse van deze spectra kan daarom worden geautomatiseerd, waardoor de tijd opnieuw wordt verkort. Dit gaat ten koste van de chemische diversiteit, althans voor de bibliotheek die in deze studie wordt gebruikt. Omdat slechts ~ 13% van de bibliotheek 19 F bevat, maar ze natuurlijk allemaal bruikbaar zijn in ¹H-screening, zal de diversiteit van de ¹⁹F-screeningsfragmenten lager zijn. Dit kan worden omzeild met behulp van speciaal ontworpen ¹⁹F-bibliotheken met meer fragmenten en een grotere chemische diversiteit. Een ander nadeel voor ¹⁹F-screening is het lage aantal signalen per fragment. Fragmenten bestaan over het algemeen uit meer dan één waterstofatoom. Daarom kunnen ¹H geobserveerde screeningsexperimenten vertrouwen op verschillende signalen voor hetzelfde fragment voor het detecteren van binding. Dit geeft een hogere mate van vertrouwen bij het identificeren van treffers voor de ¹H-screening, terwijl de ¹⁹F-screening moet vertrouwen op de één of twee signalen die per fragment worden gegeven.

Een gedetailleerd verslag over de moderne geautomatiseerde NMR-gebaseerde fragmentscreening-instrumentatie, software en analysemethoden en protocollen daarvan is gepresenteerd. De geïnstalleerde hardware omvat een high-throughput monstervoorbereidingsrobot en een high-throughput monsteropslag, wisselaar en data-acquisitie-eenheid gekoppeld aan een 600 MHz spectrometer. Een recent geïnstalleerde cryogene sondekop voor 1 H, 19 F, ¹³C en ¹⁵N zorgt voor de vereiste gevoeligheid voor de voorgestelde metingen ^{en maakt 1}H ontkoppeling mogelijk tijdens ¹⁹F detectie. Verder biedt de nieuwste generatie NMR-console de mogelijkheid om geavanceerde analytische software te gebruiken voor het ondersteunen van acquisitie en on-the-fly analyse. De hierboven besproken technologie, workflows en de beschreven protocollen zouden opmerkelijk succes moeten bevorderen voor gebruikers die FBS door NMR nastreven.

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
Bruker Avance III HD		Bruker	600 MHz NMR Spectrometer
Matrix Clear Polypropylene 2D Barcoded Open-Top Storage Tubes	3731-11 0.75ML V-BOTTOM TUBE/LATCH RACK	ThermoFisher Scientific	Barcoded Tubes
Matrix SepraSeal und DuraSeal&	4463 Cap Mat, SeptraSeal 10/CS	ThermoFisher Scientific
SampleJet		Bruker	HT Sample Changer
SamplePro Tube		Bruker	Pipetting Robot