Een tijdsefficiënte fluorescentiespectroscopie-gebaseerde test voor het evalueren van de Actin-polymerisatiestatus in knaagdier- en menselijke hersenweefsels

Summary

We rapporteren een eenvoudige, tijdsefficiënte en op fluorescentiespectroscopie gebaseerde test met hoge doorvoer voor de kwantificering van actinefilamenten in ex vivo biologische monsters van hersenweefsels van knaagdieren en menselijke proefpersonen.

Abstract

Actine, de belangrijkste component van cytoskelet, speelt een cruciale rol bij het behoud van neuronale structuur en functie. Onder fysiologische toestanden komt actine in evenwicht in zijn twee vormen voor: monomere bolvormige (G-actine) en gepolymeriseerde filamenteuze (F-actine). Op de synaptische terminals vormt actinecytoskelet de basis voor kritische pre- en postsynaptische functies. Bovendien zijn dynamische veranderingen in de actinepolymerisatiestatus (interconversie tussen bolvormige en filamenteuze vormen van actine) nauw verbonden met plasticiteitsgerelateerde veranderingen in synaptische structuur en functie. We rapporteren hier een aangepaste fluorescentiegebaseerde methodologie om de polymerisatiestatus van actine in ex vivo omstandigheden te beoordelen. De test maakt gebruik van fluorescerend gelabelde falloïdine, een phallotoxine dat zich specifiek bindt aan actinefilamenten (F-actine), wat een directe meting van gepolymeriseerde filamenteuze actine biedt. Als principieel bewijs leveren we bewijs voor de geschiktheid van de test, zowel bij knaagdier- als postmortale homogenaten van menselijk hersenweefsel. Met behulp van latrunculine A (een medicijn dat actinefilamenten depolymeriseert), bevestigen we het nut van de test bij het monitoren van veranderingen in F-actineniveaus. Verder breiden we de test uit naar biochemische fracties van geïsoleerde synaptische terminals waarin we een verhoogde actinepolymerisatie bevestigen bij stimulatie door depolarisatie met hoge extracellulaire K⁺.

Introduction

Cytoskelet eiwit actine is betrokken bij meerdere cellulaire functies, met inbegrip van structurele ondersteuning, cellulair transport, celmotiliteit en deling. Actine komt in evenwicht in twee vormen voor: monomere bolvormige actine (G-actine) en gepolymeriseerde filamenteuze actine (F-actine). Snelle veranderingen in de polymerisatiestatus van actine (interconversie tussen de G- en F-vormen) resulteren in snelle filamentassemblage en demontage en liggen ten grondslag aan de regulerende rol in de cellulaire fysiologie. Actine vormt het belangrijkste bestanddeel van de neuronale cytoskeletstructuur en beïnvloedt een breed scala aan neuronale functies^....

Protocol

Alle experimentele procedures werden uitgevoerd in overeenstemming met de voorschriften van de Commissie ethiek van de Universiteit van Otago voor de verzorging en het gebruik van proefdieren (ethisch protocol nr. AUP95/18 en AUP80/17) en Nieuw-Zeelandse wetgevende macht. Menselijke hersenweefsels werden verkregen van de Neurologische Weefselbank van ziekenhuis Clínic-IDIBAPS BioBank in Barcelona, Spanje. Alle protocollen voor weefselverzameling werden goedgekeurd door de Ethische Commissie van Hospital Clínic, Barcelona, en geïnformeerde toestemming werd verkregen van de families.

1. Bereiding van buffers en reagentia

1. Bereid de v....

Results

Lineariteit van de test voor de evaluatie van F-actineniveaus
Ten eerste werd een standaardcurve voor de lineaire toename van fluorescentie van Alexa Fluor 647 Phalloidin vastgesteld en herhaald voor elke reeks experimenten (figuur 1). Om het lineaire bereik van de test te onderzoeken, werden verschillende hoeveelheden hersenhomogenaten van knaagdieren (figuren 2A en 2B) en postmortale menselijke proefpersonen (figuur.......

Discussion

De hier beschreven test, in wezen aangepast aan een eerdere studie³⁰ met modificaties, maakt gebruik van een phallotoxine, falloïdine gelabeld met een fluorescerend label. Fluorescerende falloïdenanalogen worden beschouwd als de gouden standaard voor het kleuren van actinefilamenten in vaste weefsels^47,48,49. In feite zijn ze de oudste instrumenten om actinefilamenten⁵⁰ specifiek t.......

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
3.5 mL, open-top thickwall polycarbonate tube	Beckman Coulter	349622	For gradient centrifugation (synaptosome prep)
Alexa Fluor 647 Phalloidin	Thermo Fisher Scientific	A22287	F-actin specific ligand
Antibody against  b-actin	Santa Cruz Biotechnology	Sc-47778	For evaluation of total actin levels by immunoblotting
Antibody against GAPDH	Abcam	Ab181602	For evaluation of GAPDH levels by immunoblotting
Bio-Rad Protein Assay Dye Reagent Concentrate	Bio-Rad	5000006	Bradford based protein estimation
Calcium chloride dihydrate (CaCl2·2H2O)	Sigma-Aldrich	C3306	Krebs buffer component
cOmplete, Mini, EDTA-free Protease Inhibitor Cocktail	Sigma-Aldrich	4693159001	For inhibition of endogenous protease activity during sample preparation
Corning 96-well Clear Flat Bottom Polystyrene	Corning	3596	For light-scattering measurements
D-(+)-Glucose	Sigma-Aldrich	G8270	Krebs buffer component
Dimethyl sulfoxide	Sigma-Aldrich	D5879	Solvent for phalloidin and latrunculin A
Fluorescent flatbed scanner (Odyssey Infrared Scanner)	Li-Cor Biosciences		For detection of immunoreactive signals on immunoblots
Glutaraldehyde solution (25% in water) Grade II	Sigma-Aldrich	G6257	Fixative
HEPES	Sigma-Aldrich	H3375	Buffer ingredient for sample preparation and Krebs buffer component
Latrunculin A	Sigma-Aldrich	L5163	Depolymerizer of actin filaments
Magnesium chloride hexahydrate (MgCl2·6H2O)	Sigma-Aldrich	M2670	Krebs buffer component
Microplates
Mitex membrane filter 5 mm	Millipore	LSWP01300	Preparation of synaptoneurosomes
Nunc F96 MicroWell Black Plate	Thermo Fisher Scientific	237105	For fluorometric measurements
Nylon net filter 100 mm	Millipore	NY1H02500	Preparation of synaptoneurosomes
Phosphatase Inhibitor Cocktail IV	Abcam	ab201115	For inhibition of endogenous phosphatase activity during sample preparation
Potassium chloride (KCl)	Sigma-Aldrich	P9541	Krebs buffer component and for depolarization of synaptic terminals
Potassium phosphate monobasic ((KH2PO4)	Sigma-Aldrich	P9791	Krebs buffer component
Sodium borohydride (NaBH4)	Sigma-Aldrich	71320	Component of Permeabilization buffer
Sodium chloride (NaCl)	LabServ (Thermo Fisher Scientific)	BSPSL944	Krebs buffer component
Sodium hydrogen carbonate (NaHCO3)	LabServ (Thermo Fisher Scientific)	BSPSL900	Krebs buffer component
SpectraMax i3x	Molecular Devices		For fluorometric measurements
Sucrose	Fisher Chemical	S/8600/60	Buffer ingredient for sample preparation
Swimnex Filter Holder	Millipore	Sx0001300	Preparation of synaptoneurosomes
Tissue grinder 5 mL Potter-Elvehjem	Duran Wheaton Kimble	358034	For tissue homogenization
Triton X-100	Sigma-Aldrich	X100	Component of Permeabilization buffer
Trizma base	Sigma-Aldrich	T6066	Buffer ingredient for sample preparation