Method Article

Een tijdsefficiënte fluorescentiespectroscopie-gebaseerde test voor het evalueren van de Actin-polymerisatiestatus in knaagdier- en menselijke hersenweefsels

DOI:

10.3791/62268

⸱

June 3rd, 2021

 , 
1Department of Anatomy, School of Biomedical Sciences, University of Otago

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

We rapporteren een eenvoudige, tijdsefficiënte en op fluorescentiespectroscopie gebaseerde test met hoge doorvoer voor de kwantificering van actinefilamenten in ex vivo biologische monsters van hersenweefsels van knaagdieren en menselijke proefpersonen.

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Actine, de belangrijkste component van cytoskelet, speelt een cruciale rol bij het behoud van neuronale structuur en functie. Onder fysiologische toestanden komt actine in evenwicht in zijn twee vormen voor: monomere bolvormige (G-actine) en gepolymeriseerde filamenteuze (F-actine). Op de synaptische terminals vormt actinecytoskelet de basis voor kritische pre- en postsynaptische functies. Bovendien zijn dynamische veranderingen in de actinepolymerisatiestatus (interconversie tussen bolvormige en filamenteuze vormen van actine) nauw verbonden met plasticiteitsgerelateerde veranderingen in synaptische structuur en functie. We rapporteren hier een aangepaste fluorescentiegebaseerde methodologie om de polymerisatiestatus van actine in ex vivo omstandigheden te beoordelen. De test maakt gebruik van fluorescerend gelabelde falloïdine, een phallotoxine dat zich specifiek bindt aan actinefilamenten (F-actine), wat een directe meting van gepolymeriseerde filamenteuze actine biedt. Als principieel bewijs leveren we bewijs voor de geschiktheid van de test, zowel bij knaagdier- als postmortale homogenaten van menselijk hersenweefsel. Met behulp van latrunculine A (een medicijn dat actinefilamenten depolymeriseert), bevestigen we het nut van de test bij het monitoren van veranderingen in F-actineniveaus. Verder breiden we de test uit naar biochemische fracties van geïsoleerde synaptische terminals waarin we een verhoogde actinepolymerisatie bevestigen bij stimulatie door depolarisatie met hoge extracellulaire K+.

Introduction

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Cytoskelet eiwit actine is betrokken bij meerdere cellulaire functies, met inbegrip van structurele ondersteuning, cellulair transport, celmotiliteit en deling. Actine komt in evenwicht in twee vormen voor: monomere bolvormige actine (G-actine) en gepolymeriseerde filamenteuze actine (F-actine). Snelle veranderingen in de polymerisatiestatus van actine (interconversie tussen de G- en F-vormen) resulteren in snelle filamentassemblage en demontage en liggen ten grondslag aan de regulerende rol in de cellulaire fysiologie. Actine vormt het belangrijkste bestanddeel van de neuronale cytoskeletstructuur en beïnvloedt een breed scala aan neuronale functies1,2. Opmerkelijk is dat het actinecytoskelet een integraal onderdeel vormt van het structurele platform van de synaptische terminals. Als zodanig is het een belangrijke determinant van synaptische morfogenese en fysiologie en speelt het een fundamentele rol bij de controle van de grootte, het aantal en de morfologie van synapsen3,4,5. In het bijzonder is dynamische actinepolymerisatie-depolymerisatie een belangrijke determinant van de synaptische remodellering geassocieerd met synaptische plasticiteit die ten grondslag ligt aan het geheugen en leerprocessen. Zowel presynaptische (zoals neurotransmitter release6,7,8,9,10) als postsynaptische functies (plasticiteit gerelateerde dynamische remodellering11,12,13,14) vertrouwen kritisch op dynamische veranderingen in de polymerisatiestatus van het actinecytoskelet.

Onder fysiologische omstandigheden worden de F-actinespiegels dynamisch en strak gereguleerd via een multimodaal traject met posttranslationele modificatie4,15,16 en actinebindende eiwitten (ACP 's)4,17. ABPs kunnen de actinedynamiek op meerdere niveaus beïnvloeden (zoals het initiëren of remmen van polymerisatie, het induceren van filamentvertakking, het afsnijden van filamenten tot kleinere stukken, het bevorderen van depolymerisatie en het beschermen tegen depolymerisatie), en staan op hun beurt onder een strikte modulerende controle die gevoelig is voor verschillende extra- en intracellulaire signalen18,19,20. Dergelijke regelgevende controles op meerdere niveaus dicteren een strikte regulering van de actinedynamiek in het synaptische cytoskelet, waarbij pre- en postsynaptische aspecten van neuronale fysiologie worden verfijnd, zowel in de basale als activiteitsgeïnduceerde toestanden.

Gezien de belangrijke rol van actine in de neuronale fysiologie, is het niet verwonderlijk dat verschillende studies bewijs hebben geleverd voor veranderingen in de actinedynamiek als kritieke pathogene gebeurtenissen die verband houden met een breed scala aan neurologische aandoeningen, waaronder neurodegeneratie, psychologische ziekten en neuroontwikkelingsaandoeningen3,21,22,23,24,25,26,27. Ondanks de schat aan onderzoeksgegevens die wijzen op belangrijke rollen van actine in neuronale fysiologie en pathofysiologie, blijven er echter nog steeds aanzienlijke hiaten in het begrip van actinedynamiek, met name bij het synaptische cytoskelet. Meer onderzoeken zijn nodig om een beter begrip van neuronale actine en de veranderingen ervan onder pathologische omstandigheden te hebben. Een belangrijk aandachtsgebied in deze context is de beoordeling van de actinepolymerisatiestatus. Er zijn westerse blotting-gebaseerde commerciële kits (G-Actin / F-Actin in vivo assay biochemische kit; Cytoskelet SKU BK03728,29) en zelfgemaakte assays voor de beoordeling van F-actineniveaus6. Omdat deze echter biochemische isolatie van F-actine en G-actine vereisen en omdat hun daaropvolgende kwantificering is gebaseerd op immunoblottingprotocollen, kunnen ze tijdrovend zijn. We rapporteren hierin een fluorescentiespectroscopie-gebaseerde assay aangepast aan een eerdere studie30 met wijzigingen die kunnen worden gebruikt om zowel basale niveaus van F-actine te evalueren, als dynamische veranderingen in de assemblage-demontage. Met name hebben we het oorspronkelijke protocol dat monsters vereist die geschikt zijn voor een cuvette van 1 ml efficiënt aangepast aan het huidige 96-put plaatformaat. Het gewijzigde protocol heeft daarom de hoeveelheid weefsel/monster die nodig is voor de test aanzienlijk verminderd. Verder leveren we bewijs dat het protocol niet alleen geschikt is voor homogenaten van hersenweefsel, maar ook voor subcellulaire fracties zoals geïsoleerde synaptische terminals (synafosomen en synaptoneurosomen). Ten slotte kan de test worden gebruikt voor vers ontleed hersenweefsel van knaagdieren en langdurige opgeslagen postmortale menselijke hersenmonsters. Van belang, terwijl de test wordt gepresenteerd in een neuronale context, kan het op passende wijze worden uitgebreid tot andere celtypen en fysiologische processen die ermee verband houden.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Alle experimentele procedures werden uitgevoerd in overeenstemming met de voorschriften van de Commissie ethiek van de Universiteit van Otago voor de verzorging en het gebruik van proefdieren (ethisch protocol nr. AUP95/18 en AUP80/17) en Nieuw-Zeelandse wetgevende macht. Menselijke hersenweefsels werden verkregen van de Neurologische Weefselbank van ziekenhuis Clínic-IDIBAPS BioBank in Barcelona, Spanje. Alle protocollen voor weefselverzameling werden goedgekeurd door de Ethische Commissie van Hospital Clínic, Barcelona, en geïnformeerde toestemming werd verkregen van de families.

1. Bereiding van buffers en reagentia

  1. Bereid de volgende buffers voor op de homogenisatie van hersenweefsel en de bereiding van verrijkte fractie synaptische terminals:
    Homogenisatiebuffer: 5 mM HEPES, pH 7,4 aangevuld met 0,32 M sucrose
    Resuspensiebuffer: 5 mM Tris, pH 7,4 aangevuld met 0,32 M sucrose
    Wasbuffer: 5 mM Tris, pH 8,1
    1.2 M sucrose
    1.0 M sucrose
    0.85 M sucrose
  2. Voeg zelfgemaakte of commerciële mix van protease en fosfataseremmers toe.
    OPMERKING: We hebben een EDTA-vrije versie van Complete Protease Inhibitor mix (1 tablet per 10 ml buffer) en fosfataseremmer cocktail IV (1:100; volume: volume) gebruikt.
  3. Bereid de volgende buffers en reagentia voor op de fixatie, permeabilisatie en binding van phalloïdine:
    Krebs buffer: 118,5 mM NaCl, 4,7 mM KCl, 1,2 mM MgCl2,2 mM CaCl2,0,1 mM KH2PO4,5 mM NaHCO3,10 mM glucose, 20 mM HEPES, pH 7,4
    1 M KCl
    25% glutaraldehyde (stamoplossing)
    Krebs buffer met 0,1 % Triton X-100 en 1 mg/ml NaBH4
    400x Alexa Fluor 647 Phalloidin in DMSO
    Krebs buffer met 0,32 M sacharose
    50 μM latrunculine A in DMSO (stamoplossing)
    1 M KCl (voorraadoplossing)
    LET OP: Phalloidine is giftig (LD50 = 2 mg/kg) en moet met zorg worden behandeld. Inademing van glutaraldehyde is giftig en moet worden behandeld in een zuurkast.
  4. Bewaar de buffers bij 4 °C en falloïdine en latrunculine A bij -20 °C voor langdurige opslag.
    OPMERKING: Langdurige opslag van buffers wordt niet aanbevolen. Het protocol kan hier worden onderbroken.

2. Homogenisatie van hersenweefsel

  1. Homogeniseer het cryopreserved of vers ontleed rattenhersenweefsel in 10 volumes homogenisatiebuffer in eenPotter-Elvehjem glazen buis en stamper op ijs.
    OPMERKING: Optimale homogenisatie wordt bereikt door 15-20 slagen van de stamper met de hand voor hersenweefsels. Succesvolle homogenisatie kan worden bevestigd door een soepele stroom van de suspensie door de glazen buis. Het protocol kan hier worden onderbroken.
  2. Bepaal de eiwitconcentratie in het homogenaat met behulp van een Bradford-test31.
    OPMERKING: Alternatieve zelfgemaakte of commerciële tests voor eiwitschatting kunnen ook worden gebruikt.
  3. Verdun homogenaatmonsters in Krebs-buffer bij een concentratie van 2-3 mg eiwit/ml in een volume van 50 μL.
    OPMERKING: In sommige van onze experimenten incuberen we homogenaten met 2 μM latrunculine A of DMSO (controles) bij 37 °C gedurende 1 uur. Hiervoor worden homogenaten geresuspendeerd in 48 μL Krebs-buffer en wordt 2 μL van 50 μM latrunculine A of 2 μL DMSO toegevoegd. Verder voor immunoblotting wordt een kleine hoeveelheid monster (10 μg) verzameld na de incubatie.
  4. Bevestig de homogenaatmonsters (rubriek 5).

3. Voorbereiding van geïsoleerde zenuwterminals

  1. Bereiding van synasptosomen
    OPMERKING: Alternatieve protocollen32,33 voor synaptosomen kunnen ook worden gebruikt.
    1. Centrifugeer hersenhomogenaat bij 1.200 x g gedurende 10 min bij 4 °C.
    2. Gooi de pellet weg, de ruwe kernfractie.
    3. Centrifugeer het supernatant (S1) dat in stap 3.1.1 bij 12.000 x g wordt verkregen gedurende 15 min bij 4 °C.
    4. Verwijder het supernatant (S2), de oplosbare cytosolische fractie.
    5. Resuspend de pellet (P2) verkregen in stap 3.1.3, de ruwe synaptosomale fractie in resuspensiebuffer.
      OPMERKING: Het volume van de resuspensiebuffer is afhankelijk van de hoeveelheid startweefsel en de hoeveelheid verkregen pellet. Bijvoorbeeld, wanneer beginnend met 150-300 mg hersenweefsels, kan de verkregen pellet worden geresuspendeerd in 200 μL resuspensiebuffer.
    6. Laad de geresuspendeerde ruwe synasptosomen op een discontinue sacharosegradiënt van gelijke volumes van 0,85-1,0-1,2 M sucrose.
      OPMERKING: We gebruiken meestal 1 ml per sucrose-oplossing (voor 150-300 mg weefsel). Dit kan worden veranderd volgens grotere weefselhoeveelheden. Discontinue gradiënten kunnen worden gemaakt met behulp van een 25G-spuit die tegen de binnenwand van de ultracentrifugebuis wordt gedrukt en zachte gelaagdheid van de sacharoselagen.
    7. Centrifugeer bij 85.000 x g gedurende 2 uur bij 4 °C.
      OPMERKING: Vanwege de hoge centrifugesnelheid is een ultracentrifuge nodig die een vacuüm kan creëren om de verwarming te verminderen.
    8. Verzamel de synaptosomale fractie op het raakvlak tussen 1,0 en 1,2 M sucrose met behulp van een pipetpunt van 200 μL.
    9. Was de synaptosomale fractie met ijskoude wasbuffer door centrifugeren op 18.000 x g gedurende 10 minuten bij 4 °C.
      OPMERKING: Voor het wassen wordt de synaptosomale fractie verkregen op het raakvlak van 1,0 en 1,2 M sacharose verzameld in een verse buis van 1,5 ml en wordt een gelijk volume wasbuffer toegevoegd, waardoor hoge sacharose uit het medium wordt verwijderd.
    10. Was de synaptosomale pellet opnieuw met een ijskoude homogenisatiebuffer op 12.000 g gedurende 10 minuten bij 4 °C.
    11. Resuspend de synasptosomen in homogenisatie buffer op ijs.
      OPMERKING: Het protocol kan hier kort worden gepauzeerd.
    12. Bepaal de eiwitconcentratie met behulp van een Bradford-test.
    13. Resuspendeer de synasptosomen in krebsbuffer bij een concentratie van 2-3 mg eiwit/ml in een volume van 50 μL (47,5 μL als synafosomen door KCl moeten worden gedepolariseerd; zie rubriek 4).
      OPMERKING: Voor resuspensie wordt de synaptosomale fractie eerst gesponnen op 12.000 x g gedurende 5 min bij 4 °C en wordt het supernatant (buffer) verwijderd. De synaptosomale pellet wordt vervolgens in Krebs buffer geresuspendeerd door zachte pipetten met behulp van een pipetpunt van 200 μL.
    14. Ga verder met depolarisatie (sectie 4).
  2. Bereiding van synaptoneurosomen
    OPMERKING: Alternatieve protocollen34,35 voor synaptoneurosomen kunnen ook worden gebruikt.
    1. Breng het homogenaat van de hersenen door een voorge bevochtigd netfilter van 100 μm poriegrootte in een filterhouder met behulp van een spuit van 1 ml.
      OPMERKING: Het vooraf bevochtigen van alle filters is belangrijk om verlies van monster te voorkomen en moet worden gedaan met behulp van homogenisatiebuffer. Hiervoor wordt de homogenisatiebuffer met behulp van een spuit van 1 ml door de filters in de filterhouder gepasseerd totdat de buffer uitstroomt.
    2. Verzamel het filtraat (F1) in een voorgekoelde buis van 1,5 ml op ijs.
    3. Herhaal het proces (stappen 3.2.1 en 3.2.2) voor F1-fractie om het tweede filtraat (F2) te verkrijgen.
    4. Passeer F2 filtraat door een nettofilter van 5 μm poriegrootte.
    5. Verzamel het filtraat (F3) in een voorgekoelde buis van 1,5 ml op ijs.
    6. Centrifugeer filtraat F3 bij 1.500 x g gedurende 10 min bij 4 °C.
    7. Resuspendeer de pellet (synaptoneurosomen) in Krebs buffer op ijs bij een concentratie van 2-3 mg eiwit/ml in een volume van 50 μL (47,5 μL als synaptosomen door KCl moeten worden gedepolariseerd; zie rubriek 4).
      OPMERKING: Het protocol kan hier kort worden gepauzeerd.
    8. Schat de eiwitconcentratie met behulp van een Bradford-test.
    9. Ga verder met depolarisatie (sectie 4).

4. KCl-gemedieerde depolarisatie van geïsoleerde synaptische terminals

  1. Equilibreren synasptosomen/synaptonurosomen bij 37 °C gedurende 5-10 min.
  2. Stimuleer synasptosomen/synaptoneurosomen door KCl toe te voegen om extracellulaire K+ tot 50 mM te verhogen gedurende 30 s bij 37 °C en voeg een gelijk volume Krebs-buffer toe aan de respectieve ongestimuleerde controleset.
    OPMERKING: Voeg bijvoorbeeld 2,5 μL 1 M KCl toe aan synasptosomen die zijn geresuspendeerd in 47,5 μL Krebs-buffer; en voeg 2,5 μL Krebs-buffer toe aan het respectieve ongestimuleerde controlesysptosom. Voor experimenten waarbij een groot aantal monsters betrokken is, mag niet meer dan 2 monsters tegelijk worden gebruikt, zodat de depolarisatietijd niet langer is dan 30 s.
  3. Beëindig de stimulatie door glutaraldehyde toe te voegen (rubriek 5).

5. Fixatie en falloïdinekleuring van monsters

  1. Voeg glutaraldehyde toe aan homogenaat/synaptosomale/synaptoneurosomale monsters tot een eindconcentratie van 2,5% gedurende 2-3 minuten bij kamertemperatuur.
    OPMERKING: We hebben 6 μL 25% glutaraldehydeoplossing toegevoegd, zodat de uiteindelijke concentratie glutaraldehyde in de 50 μL-monsters (homogenaten/synaptosomen/synaptoneurosomen) ca. 2,5% bedroeg. Fixatie is van cruciaal belang en moet snel zijn en daarom onmiddellijk na toevoeging van glutaraldehyde moet het monster krachtig worden geko vortexed.
  2. Sediment de monsters op 20.000 x g gedurende 5 min.
  3. Verwijder het supernatant.
    OPMERKING: Gooi het supernatant weg in een zuurkast omdat glutaraldehyde giftig is.
  4. Permeabiliseer de pellet door resuspensie in 100 μL Krebs buffer met 0,1% Triton X-100 en 1 mg/ml NaHB4 gedurende 2-3 min bij kamertemperatuur.
  5. Sediment de monsters op 20.000 x g gedurende 5 min.
  6. Verwijder de permeabilisatiebuffer.
  7. Was de pellet met 200 μL Krebs buffer door centrifugeren op 20.000 x g gedurende 5 min.
  8. Resuspend en beits de pellet met 1x Alexa Fluor 647 Phalloidin (overeenkomend met 500 μU) in 100 μL Krebs buffer gedurende 10 minuten in het donker bij kamertemperatuur.
    OPMERKING: Andere variëteiten van fluorescerende falloïden analogen zijn in de handel verkrijgbaar en kunnen worden vervangen voor de test. De concentratie van falloïdine en het totale incubatievolume van het monster moeten mogelijk worden aangepast aan de hoeveelheid en het type weefsel/monster dat wordt getest en de optimale omstandigheden moeten dienovereenkomstig worden gestandaardiseerd.
  9. Centrifugeer de bevlekte monsters gedurende 5 minuten op 20.000 x g.
  10. Verwijder de ongebonden falloidine (supernatant).
  11. Was het monster met 200 μL Krebs buffer door centrifugeren op 20.000 x g gedurende 5 min.
  12. Resuspend in 200 μL Krebs buffer met 0,32 M sacharose.
    OPMERKING: Het protocol kan hier kort worden gepauzeerd.

6. Fluormetrische analyse en lichtverstrooiing

  1. Doseer Alexa Fluor 647 Phalloidin-bevlekte monsters in een zwarte 96-put plaat.
  2. Meet de fluorescentie-intensiteit bij een excitatiegolflengte van 645 nm en een emissiegolflengte van 670 nm in een plaatlezer bij kamertemperatuur.
  3. Breng de monsters van de zwarte 96-putplaat over op de transparante 96-putplaat met behulp van 200 μL pipetpunten.
  4. Meet de lichtverstrooiing bij 540 nm om eventuele verliezen te corrigeren die zich tijdens de vorige stappen van fixatie, permeabilisatie en kleuring hebben voorgedaan.
    OPMERKING: Variaties in biologisch materiaal die in de bevlekte monsters worden vastgehouden, kunnen prominenter zijn voor kleinere hoeveelheden uitgangsmateriaal (zie Discussie).
  5. Neem een set Alexa Fluor 647 Phalloidin in Krebs buffer op bij verschillende concentraties (0,05x, 0,1x, 0,25x, 0,35x, 0,75x, 0,5x en 1x overeenkomend met 25, 50, 125, 175, 250, 375 en 500 μU).
    OPMERKING: Dit is een optionele stap en heeft geen invloed op de resultaten van de test, met name wanneer de F-actinespiegels relatief worden uitgedrukt (artikel 7). Het protocol kan hier worden onderbroken.

7. Gegevensanalyse

  1. De hoeveelheid F-actine in de monsters is direct evenredig met de fluorescentie-intensiteit van gebonden falloïdine. Express in absolute termen van eenheden van falloïdine gebonden berekend op basis van de lineaire curve van de gelabelde falloïdinestandaard.
    OPMERKING: Zie bijvoorbeeld de figuren 2A-B, 3A, 4A-B en aanvullende figuur 2.
  2. Express F-actine niveaus als een fractie van de controle monsters.
    OPMERKING: Zie bijvoorbeeld de figuren 5A-B.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Results

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Lineariteit van de test voor de evaluatie van F-actineniveaus
Ten eerste werd een standaardcurve voor de lineaire toename van fluorescentie van Alexa Fluor 647 Phalloidin vastgesteld en herhaald voor elke reeks experimenten (figuur 1). Om het lineaire bereik van de test te onderzoeken, werden verschillende hoeveelheden hersenhomogenaten van knaagdieren (figuren 2A en 2B) en postmortale menselijke proefpersonen (figuur...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Discussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

De hier beschreven test, in wezen aangepast aan een eerdere studie30 met modificaties, maakt gebruik van een phallotoxine, falloïdine gelabeld met een fluorescerend label. Fluorescerende falloïdenanalogen worden beschouwd als de gouden standaard voor het kleuren van actinefilamenten in vaste weefsels47,48,49. In feite zijn ze de oudste instrumenten om actinefilamenten50 specifiek t...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Disclosures

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

De auteurs hebben niets bekend te maken.

Acknowledgements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Dit werk werd ondersteund door de Neurological Foundation of New Zealand (1835-PG), de New Zealand Health Research Council (#16-597) en het Department of Anatomy, University of Otago, Nieuw-Zeeland. We zijn de Neurologische Weefselbank van HCB-IDIBAPS BioBank (Spanje) voor menselijke hersenweefsels te schulden. We danken Jiaxian Zhang voor haar hulp bij het opnemen en bewerken van de video.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
3.5 mL, open-top thickwall polycarbonate tubeBeckman Coulter349622Voor gradiëntcentrifugatie (synaptosome prep)
Alexa Fluor 647 PhalloidinThermo Fisher ScientificA22287F-actin specifiek ligand
Antibody against  b-actinSanta Cruz BiotechnologySc-47778Voor evaluatie van totale actin niveaus door immunoblotting
Antibody against GAPDHAbcamAb181602Voor evaluatie van GAPDH niveaus door immunoblotting
Bio-Rad Protein Assay Dye Reagent ConcentrateBio-Rad5000006Bradford gebaseerde eiwitschatting
Calcium chloride dihydrate (CaCl2·2H2O)Sigma-AldrichC3306Krebs buffer component
cOmplete, Mini, EDTA-free Protease Inhibitor CocktailSigma-Aldrich4693159001Voor remming van endogene protease activiteit tijdens monstervoorbereiding
Corning 96-well Clear Flat Bottom PolystyreneCorning3596Voor lichtverstrooiingsmetingen
D-(+)-GlucoseSigma-AldrichG8270Krebs buffer component
Dimethyl sulfoxideSigma-AldrichD5879Solvent voor phalloidin en latrunculin A
Fluorescent flatbed scanner (Odyssey Infrared Scanner)Li-Cor BiosciencesVoor detectie van immunoreactieve signalen op immunoblots
Glutaraldehyde solution (25% in water) Grade IISigma-AldrichG6257Fixeermiddel
HEPESSigma-AldrichH3375Buffer ingredient voor monstervoorbereiding en Krebs buffer component
Latrunculin ASigma-AldrichL5163Depolymerisator van actin filamenten
Magnesium chloride hexahydrate (MgCl2·6H2O)Sigma-AldrichM2670Krebs buffer component
Microplates
Mitex membrane filter 5 mmMilliporeLSWP01300Bereiding van synaptoneurosomes
Nunc F96 MicroWell Black PlateThermo Fisher Scientific237105Voor fluorometrische metingen
Nylon net filter 100 mmMilliporeNY1H02500Bereiding van synaptoneurosomes
Phosphatase Inhibitor Cocktail IVAbcamab201115Voor remming van endogene fosfatase activiteit tijdens monstervoorbereiding
Potassium chloride (KCl)Sigma-AldrichP9541Krebs buffer component en voor depolarisatie van synaptische terminalen
Potassium phosphate monobasic ((KH2PO4)Sigma-AldrichP9791Krebs buffer component
Sodium borohydride (NaBH4)Sigma-Aldrich71320Component van Permeabilisatie buffer
Sodium chloride (NaCl)LabServ (Thermo Fisher Scientific)BSPSL944Krebs buffer component
Sodium hydrogen carbonate (NaHCO3)LabServ (Thermo Fisher Scientific)BSPSL900Krebs buffer component
SpectraMax i3xMolecular DevicesVoor fluorometrische metingen
SucroseFisher ChemicalS/8600/60Buffer ingredient voor monstervoorbereiding
Swimnex Filter HolderMilliporeSx0001300Bereiding van synaptoneurosomes
Tissue grinder 5 mL Potter-ElvehjemDuran Wheaton Kimble358034Voor weefsel homogenisatie
Triton X-100Sigma-AldrichX100Component van Permeabilisatie buffer
Trizma baseSigma-AldrichT6066Buffer ingredient voor monstervoorbereiding

References

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Penzes, P., Rafalovich, I. Regulation of the actin cytoskeleton in dendritic spines. Advances in Experimental Medicine and Biology. 970, 81-95 (2012).
  2. Venkatesh, K., Mathew, A., Koushika, S. P. Role of actin in organelle trafficking in neurons. Cytoskeleton. 77 (3-4), 97-109 (2020).
  3. Shirao, T., González-Billault, C. Actin filaments and microtubules in dendritic spines. Journal of Neurochemistry. 126 (2), 155-164 (2013).
  4. Bertling, E., Hotulainen, P. New waves in dendritic spine actin cytoskeleton: From branches and bundles to rings, from actin binding proteins to post-translational modifications. Molecular and Cellular Neuroscience. 84, 77-84 (2017).
  5. Bellot, A., et al. The structure and function of actin cytoskeleton in mature glutamatergic dendritic spines. Brain Research. 1573, 1-16 (2014).
  6. Wolf, M., et al. ADF/Cofilin controls synaptic actin dynamics and regulates synaptic vesicle mobilization and exocytosis. Cerebral Cortex. 25 (9), 2863-2875 (2015).
  7. Morales, M., Colicos, M. A., Goda, Y. Actin-dependent regulation of neurotransmitter release at central synapses. Neuron. 27 (3), 539-550 (2000).
  8. Doussau, F., Augustine, G. J. The actin cytoskeleton and neurotransmitter release: An overview. Biochimie. 82 (4), 353-363 (2000).
  9. Sakaba, T., Neher, E. Involvement of actin polymerization in vesicle recruitment at the calyx of held synapse. Journal of Neuroscience. , (2003).
  10. Lee, J. S., Ho, W. K., Lee, S. H. Actin-dependent rapid recruitment of reluctant synaptic vesicles into a fast-releasing vesicle pool. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. , (2012).
  11. Rust, M. B., et al. Learning, AMPA receptor mobility and synaptic plasticity depend on n-cofilin-mediated actin dynamics. EMBO Journal. 29, 1889-1902 (2010).
  12. Bosch, M., et al. Structural and molecular remodeling of dendritic spine substructures during long-term potentiation. Neuron. 82, 444-459 (2014).
  13. Hanley, J. G. Actin-dependent mechanisms in AMPA receptor trafficking. Frontiers in Cellular Neuroscience. 8, 381(2014).
  14. Kasai, H., Fukuda, M., Watanabe, S., Hayashi-Takagi, A., Noguchi, J. Structural dynamics of dendritic spines in memory and cognition. Trends in Neurosciences. 33, 121-129 (2010).
  15. Terman, J. R., Kashina, A. Post-translational modification and regulation of actin. Current Opinion in Cell Biology. 25 (1), 30-38 (2013).
  16. Wilson, C., Terman, J. R., González-Billault, C., Ahmed, G. Actin filaments-A target for redox regulation. Cytoskeleton. 73, 577-595 (2016).
  17. Borovac, J., Bosch, M., Okamoto, K. Regulation of actin dynamics during structural plasticity of dendritic spines: Signaling messengers and actin-binding proteins. Molecular and Cellular Neuroscience. 91, 122-130 (2018).
  18. Saneyoshi, T., Hayashi, Y. The Ca2+ and Rho GTPase signaling pathways underlying activity-dependent actin remodeling at dendritic spines. Cytoskeleton. 69 (8), 545-554 (2012).
  19. Mizuno, K. Signaling mechanisms and functional roles of cofilin phosphorylation and dephosphorylation. Cellular Signalling. 25 (2), 457-469 (2013).
  20. Dos Remedios, C. G., et al. Actin binding proteins: Regulation of cytoskeletal microfilaments. Physiological Reviews. 83 (2), 433-473 (2003).
  21. Bamburg, J. R., Bernstein, B. W. Actin dynamics and cofilin-actin rods in Alzheimer disease. Cytoskeleton. 73 (9), 477-497 (2016).
  22. Penzes, P., VanLeeuwen, J. E. Impaired regulation of synaptic actin cytoskeleton in Alzheimer's disease. Brain Research Reviews. 67 (1-2), 184-192 (2011).
  23. Pelucchi, S., Stringhi, R., Marcello, E. Dendritic spines in Alzheimer's disease: How the actin cytoskeleton contributes to synaptic failure. International Journal of Molecular Sciences. 21 (3), 908(2020).
  24. Kounakis, K., Tavernarakis, N. The Cytoskeleton as a Modulator of Aging and Neurodegeneration. Advances in Experimental Medicine and Biology. 1178, 227-245 (2019).
  25. Nishiyama, J. Plasticity of dendritic spines: Molecular function and dysfunction in neurodevelopmental disorders. Psychiatry and Clinical Neurosciences. 73 (9), 541-550 (2019).
  26. Michaelsen-Preusse, K., Feuge, J., Korte, M. Imbalance of synaptic actin dynamics as a key to fragile X syndrome. Journal of Physiology. 596 (14), 2773-2782 (2018).
  27. Hensel, N., Claus, P. The Actin Cytoskeleton in SMA and ALS: How Does It Contribute to Motoneuron Degeneration. Neuroscientist. 24 (1), 54-72 (2018).
  28. Kommaddi, R. P., et al. Aβ mediates F-actin disassembly in dendritic spines leading to cognitive deficits in alzheimer's disease. Journal of Neuroscience. 38 (5), 1085-1099 (2018).
  29. Kommaddi, R. P., et al. Glutaredoxin1 Diminishes Amyloid Beta-Mediated Oxidation of F-Actin and Reverses Cognitive Deficits in an Alzheimer's Disease Mouse Model. Antioxidants and Redox Signaling. 31 (18), 1321-1338 (2019).
  30. Bernstein, B. W., Bamburg, J. R. Cycling of actin assembly in synaptosomes and neurotransmitter release. Neuron. 3 (2), 257-265 (1989).
  31. Sapan, C. V., Lundblad, R. L., Price, N. C. Colorimetric protein assay techniques. Biotechnology and applied biochemistry. 29 (2), Pt 2 99-108 (1999).
  32. Kolodziej, A., et al. High resolution quantitative synaptic proteome profiling of mouse brain regions after auditory discrimination learning. Journal of Visualized Experiments. (118), e54992(2016).
  33. Byun, Y. G., Chung, W. S. A novel in vitro live-imaging assay of astrocyte-mediated phagocytosis using pH indicator-conjugated synaptosomes. Journal of Visualized Experiments. (132), e56647(2018).
  34. Chmielewska, J. J., Kuzniewska, B., Milek, J., Urbanska, K., Dziembowska, M. Neuroligin 1, 2, and 3 Regulation at the Synapse: FMRP-Dependent Translation and Activity-Induced Proteolytic Cleavage. Molecular Neurobiology. 56 (4), 2741-2759 (2019).
  35. Kuzniewska, B., Chojnacka, M., Milek, J., Dziembowska, M. Preparation of polysomal fractions from mouse brain synaptoneurosomes and analysis of polysomal-bound mRNAs. Journal of Neuroscience Methods. 293, 226-233 (2018).
  36. Fischer, M., Kaech, S., Knutti, D., Matus, A. Rapid actin-based plasticity in dendritic spines. Neuron. 20 (5), 847-854 (1998).
  37. Caesar, M., Felk, S., Aasly, J. O., Gillardon, F. Changes in actin dynamics and F-actin structure both in synaptoneurosomes of LRRK2(R1441G) mutant mice and in primary human fibroblasts of LRRK2(G2019S) mutation carriers. Neuroscience. 284, 311-324 (2015).
  38. Star, E. N., Kwiatkowski, D. J., Murthy, V. N. Rapid turnover of actin in dendritic spines and its regulation by activity. Nature Neuroscience. 5, 239-246 (2002).
  39. Okamoto, K. I., Nagai, T., Miyawaki, A., Hayashi, Y. Rapid and persistent modulation of actin dynamics regulates postsynaptic reorganization underlying bidirectional plasticity. Nature Neuroscience. 7, 1104-1112 (2004).
  40. Bernstein, B. W., Dewit, M., Bamburg, J. R. Actin disassembles reversibly during electrically induced recycling of synaptic vesicles in cultured neurons. Molecular Brain Research. 53 (1-2), 236-250 (1998).
  41. Ahmad, F., Liu, P. Synaptosome as a tool in Alzheimer's disease research. Brain Research. 1746, 147009(2020).
  42. Ahmad, F., et al. Isoform-specific hyperactivation of calpain-2 occurs presymptomatically at the synapse in Alzheimer's disease mice and correlates with memory deficits in human subjects. Scientific Reports. 8 (1), 13119(2018).
  43. Ahmad, F., et al. Reactive Oxygen Species-Mediated Loss of Synaptic Akt1 Signaling Leads to Deficient Activity-Dependent Protein Translation Early in Alzheimer's Disease. Antioxidants and Redox Signaling. 27 (16), 1269-1280 (2017).
  44. Ahmad, F., et al. Developmental lead (Pb)-induced deficits in redox and bioenergetic status of cerebellar synapses are ameliorated by ascorbate supplementation. Toxicology. 440, 152492(2020).
  45. Ahmad, F., Salahuddin, M., Alsamman, K., Herzallah, H. K., Al-Otaibi, S. T. Neonatal maternal deprivation impairs localized de novo activity-induced protein translation at the synapse in the rat hippocampus. Bioscience Reports. 38 (3), 0118(2018).
  46. Ahmad, F., Salahuddin, M., Alsamman, K., Almulla, A. A., Salama, K. F. Developmental lead (Pb)-induced deficits in hippocampal protein translation at the synapses are ameliorated by ascorbate supplementation. Neuropsychiatric Disease and Treatment. 14, 3289-3298 (2018).
  47. Melak, M., Plessner, M., Grosse, R. Actin visualization at a glance. Journal of Cell Science. 130 (3), 525-530 (2017).
  48. Adams, A. E. M., Pringle, J. R. Staining of actin with fluorochrome-conjugated phalloidin. Methods in Enzymology. 194, 729-731 (1991).
  49. Belin, B. J., Goins, L. M., Mullins, R. D. Comparative analysis of tools for live cell imaging of actin network architecture. BioArchitecture. 4 (6), 189-202 (2014).
  50. Wulf, E., Deboben, A., Bautz, F. A., Faulstich, H., Wieland, T. Fluorescent phallotoxin, a tool for the visualization of cellular actin. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 76, 4498-4502 (1979).
  51. Taffarel, M., de Souza, M. F., Machado, R. D., de Souza, W. Localization of actin in the electrocyte of Electrophorus electricus L. Cell and Tissue Research. 242, 453-455 (1985).
  52. Glebov, O. O. Distinct molecular mechanisms control levels of synaptic F-actin. Cell Biology International. 44 (1), 336-342 (2020).
  53. Dancker, P., Löw, I., Hasselbach, W., Wieland, T. Interaction of actin with phalloidin:. Polymerization and stabilization of F-actin. BBA - Protein Structure. , (1975).
  54. Lengsfeld, A. M., Löw, I., Wieland, T., Dancker, P., Hasselbach, W. Interaction of phalloidin with actin. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 71 (7), 2803-2807 (1974).
  55. Coluccio, L. M., Tilney, L. G. Phalloidin enhances actin assembly by preventing monomer dissociation. Journal of Cell Biology. 99, 529-535 (1984).
  56. Colicos, M. A., Collins, B. E., Sailor, M. J., Goda, Y. Remodeling of synaptic actin induced by photoconductive stimulation. Cell. 107 (5), 605-616 (2001).
  57. Lemieux, M. G., et al. Visualization of the actin cytoskeleton: Different F-actin-binding probes tell different stories. Cytoskeleton. 71, 157-169 (2014).
  58. Bubb, M. R., Senderowicz, A. M. J., Sausville, E. A., Duncan, K. L. K., Korn, E. D. Jasplakinolide, a cytotoxic natural product, induces actin polymerization and competitively inhibits the binding of phalloidin to F-actin. Journal of Biological Chemistry. , (1994).
  59. Holzinger, A. Jasplakinolide: an actin-specific reagent that promotes actin polymerization. Methods in molecular biology. 269, Clifton, N.J. 14869-14871 (2009).

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Tags

Actin PolymerizationFluorescence SpectroscopyF Actin QuantificationBrain Tissue AssayPhalloidin StainingSynaptic TerminalsSynaptosome PreparationLatrunculin AHigh Throughput Assay96 Well Plate

Related Articles