Vitrificatie van in vitro gerijpte oöcyten verzameld uit volwassen en prepubertale eierstokken bij schapen

Samenvatting

Het protocol is gericht op het bieden van een standaardmethode voor de vitrificatie van volwassen en juveniele schapenoöcyten. Het omvat alle stappen van de bereiding van de in vitro rijpingsmedia tot de post-opwarmingscultuur. Oöcyten worden in het MII-stadium ge verglaasd met behulp van Cryotop om het minimale essentiële volume te garanderen.

Samenvatting

Bij vee kunnen in vitro embryoproductiesystemen worden ontwikkeld en onderhouden dankzij het grote aantal eierstokken en oöcyten dat gemakkelijk uit een slachthuis kan worden verkregen. Volwassen eierstokken dragen altijd verschillende antrale follikels, terwijl bij pre-puberale donoren de maximale aantallen oöcyten beschikbaar zijn op de leeftijd van 4 weken, wanneer eierstokken piekaantallen antrale follikels dragen. 4 weken oude lammeren worden dus beschouwd als goede donoren, zelfs als de ontwikkelingscompetentie van prepubertale oöcyten lager is in vergelijking met hun volwassen tegenhanger.

Fundamenteel onderzoek en commerciële toepassingen zouden worden versterkt door de mogelijkheid om met succes gepreserveerde oöcyten te cryopreserveren die zijn verkregen van zowel volwassen als prepuberale donoren. De vitrificatie van oöcyt verzameld van prepuberale donoren zou ook het mogelijk maken om het generatie-interval te verkorten en zo de genetische winst in fokprogramma's te vergroten. Het verlies van ontwikkelingspotentieel na cryopreservatie maakt zoogdieroöcyten echter waarschijnlijk een van de moeilijkste celtypen om te cryopreserveren. Onder de beschikbare cryopreservatietechnieken wordt vitrificatie op grote schaal toegepast op dierlijke en menselijke oöcyten. Ondanks recente vooruitgang in de techniek veroorzaken blootstellingen aan hoge concentraties cryoprotectieve middelen, evenals koelschade en osmotische stress nog steeds verschillende structurele en moleculaire veranderingen en verminderen ze het ontwikkelingspotentieel van zoogdieroocyten. Hier beschrijven we een protocol voor de vitrificatie van schapenoöcyten verzameld bij jonge en volwassen donoren en gerijpt in vitro voorafgaand aan cryopreservatie. Het protocol omvat alle procedures, van oöcyt in vitro rijping tot vitrificatie, opwarming en incubatieperiode na opwarming. Oöcyten die in het MII-stadium worden geprefereerd, kunnen inderdaad worden bevrucht na opwarming, maar ze hebben extra tijd nodig voorafgaand aan de bevruchting om schade als gevolg van cryopreservatieprocedures te herstellen en hun ontwikkelingspotentieel te vergroten. Zo zijn de omstandigheden en timing van de cultuur na de opwarming cruciale stappen voor het herstel van het ontwikkelingsmogelijkheden van oöcyt, vooral wanneer oöcyt wordt verzameld bij jonge donoren.

Inleiding

Langdurige opslag van de vrouwelijke gameten kan een breed scala aan toepassingen bieden, zoals het verbeteren van de fokkerij van huisdieren door genetische selectieprogramma's, het bijdragen aan het behoud van de biodiversiteit door middel van het ex-situ programma voor het behoud van diersoorten in de natuur, en het stimuleren van in vitro biotechnologisch onderzoek en toepassingen dankzij de beschikbaarheid van opgeslagen oöcyten die moeten worden opgenomen in in vitro embryoproductie of nucleaire transplantatieprogramma 's^1,2,3. Juveniele oöcyt vitrificatie zou ook de ge....

Protocol

Het dierprotocol en de hieronder beschreven geïmplementeerde procedures zijn in overeenstemming met de ethische richtsnoeren die van kracht zijn aan de Universiteit van Sassari, in overeenstemming met Richtlijn 86/609/EG van de Europese Unie en de aanbeveling van de Commissie van de Europese Gemeenschappen 2007/526/EG.

1. Voorbereiding van media op oöcytmanipulatie

1. Bereid het medium voor op het transport van verzamelde eierstokken door dulbecco's fosfaat gebufferde zoutoplossing aan te vullen met 0,1 g/L penicilline en 0,1 g/L streptomycine (PBS).
2. Bereid het medium voor op het verzamelen en rijpen van oöcyten door 9,5 g ....

Resultaten

De cryotolerantie van oöcyt van jonge donoren is lager in vergelijking met volwassen donoren. Het eerste waargenomen effect is een lagere overlevingskans na opwarming in vergelijking met volwassen oöcyten (figuur 1A; χ² test P<0,001). Juveniele oöcyten vertoonden een lagere membraanintegriteit na opwarming (figuur 1B). Het gebruik van trehalose in het rijpingsmedium was bedoeld om te controleren of deze suiker cryo-verwondingen in juveniele oöcyten ko.......

Discussie

Oöcyt cryopreservatie bij huisdieren kan niet alleen de instandhouding van vrouwelijke genetische hulpbronnen op lange termijn mogelijk maken, maar ook de ontwikkeling van embryonale biotechnologie bevorderen. De ontwikkeling van een standaardmethode voor oöcyt vitrificatie zou dus zowel de veehouderij als de onderzoekssector ten goed komen. In dit protocol wordt een volledige methode voor volwassen schapenocyt vitrificatie gepresenteerd en zou een solide uitgangspunt kunnen zijn voor de ontwikkeling van een efficiënt vi.......

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel

Naam	Bedrijf	Catalogusnummer	Opmerkingen
2′,7′-Dichlorofluorescin diacetate	Sigma-Aldrich	D-6883
Albumine bovijn fraction V, protease vrij	Sigma-Aldrich	A3059
Bisbenzimide H 33342 trihydrochloride (Hoechst 33342)	Sigma-Aldrich	14533
Calciumchloride (CaCl2 2H20)	Sigma-Aldrich	C8106
Citroenzuur	Sigma-Aldrich	C2404
Confocale laserscanningmicroscoop	Leica Microsystems GmbH,Wetzlar	TCS SP5 DMI 6000CS
Cryotop Kitazato	Medical Biological Technologies
Cysteamine	Sigma-Aldrich	M9768
D- (-) Fructose	Sigma-Aldrich	F0127
D(+)Trehalose dehydraat	Sigma-Aldrich	T0167
Dimethylsulfoxide (DMSO)	Sigma-Aldrich	D2438
Dulbecco fosfaat gebufferde zoutoplossing	Sigma-Aldrich	D8537
Eigeel	Sigma-Aldrich	P3556
Ethyleenglycol (EG)	Sigma-Aldrich	324558
FSH	Sigma-Aldrich	F4021
Glutaminzuur	Sigma-Aldrich	G5638
Glutaraldehyde	Sigma-Aldrich	G5882
Glycerol	Sigma-Aldrich	G5516
Glycine	Sigma-Aldrich	G8790
Heparine	Sigma-Aldrich	H4149
HEPES	Sigma-Aldrich	H4034
Hypoutarine	Sigma-Aldrich	H1384
Omgekeerd microscoop	Diaphot, Nikon
L-Alanine	Sigma-Aldrich	A3534
L-Arginine	Sigma-Aldrich	A3784
L-Asparagine	Sigma-Aldrich	A4284
L-Asparaginezuur	Sigma-Aldrich	A4534
L-Cysteïne	Sigma-Aldrich	C7352
L-Cystine	Sigma-Aldrich	C8786
L-Glutamine	Sigma-Aldrich	G3126
LH	Sigma-Aldrich	L6420
L-Histidine	Sigma-Aldrich	H9511
L-Isoleucine	Sigma-Aldrich	I7383
L-Leucine	Sigma-Aldrich	L1512
L-Lysine	Sigma-Aldrich	L1137
L-Methionine	Sigma-Aldrich	M2893
L-Ornithine	Sigma-Aldrich	O6503
L-Phenylalanine	Sigma-Aldrich	P5030
L-Proline	Sigma-Aldrich	P4655
L-Serine	Sigma-Aldrich	S5511
L-Tyrosine	Sigma-Aldrich	T1020
L-Valine	Sigma-Aldrich	V6504
Magnesiumchloride heptahydraat (MgSO4.7H2O)	Sigma-Aldrich	M2393
Makler Countkamer	Sefi-Medical Instruments ltd.Biosigma S.r.l.
Medium 199	Sigma-Aldrich	M5017
Mineralolie	Sigma-Aldrich	M8410
MitoTracker Red CM-H2XRos	ThermoFisher	M7512
Nieuwgeboren kalfs serum hitte ingeactiveerd (FCS)	Sigma-Aldrich	N4762
Penicilline G natriumzout	Sigma-Aldrich	P3032
Fenolrood	Sigma-Aldrich	P3532
Polyvinylalcohol (87-90% gehydrolyseerd, gemiddelde mol wt 30.000-70.000)	Sigma-Aldrich	P8136
Kaliumchloride (KCl)	Sigma-Aldrich	P5405
Kaliumfosfaat monobasisch (KH2PO4)	Sigma-Aldrich	P5655
Propidiumjodide	Sigma-Aldrich	P4170
Schapenserum	Sigma-Aldrich	S2263
Natriumazide	Sigma-Aldrich	S2202
Natriumbicarbonaat (NaHCO3)	Sigma-Aldrich	S5761
Natriumchloride (NaCl)	Sigma-Aldrich	S9888
Natrium-dl-lactaat oplossingstroop	Sigma-Aldrich	L4263
Natriumpyruvaat	Sigma-Aldrich	P2256
Sperma Class Analyzer	Microptic S.L.	S.C.A. v 3.2.0
Statistisch software Minitab 18.1	2017 Minitab
Stereomicroscoop	Olimpus	SZ61
Streptomycinesulfaat	Sigma-Aldrich	S9137
Taurine	Sigma-Aldrich	T7146
TRIS	Sigma-Aldrich	15.456-3