Bacteriële cellulosebollen die vaste materialen inkapselen

Summary

Dit protocol presenteert een eenvoudige, goedkope methode om bacteriële cellulose (BC) bollen te vormen. Dit biomateriaal kan functioneren als een inkapselingsmedium voor vaste materialen, waaronder biochar, polymeerbollen en mijnafval.

Abstract

Bacteriële cellulose (BC) bollen worden steeds meer onderzocht sinds de popularisering van BC als nieuw materiaal. Dit protocol presenteert een betaalbare en eenvoudige methode voor bc sphere productie. Naast het produceren van deze bollen is ook een inkapselingsmethode voor vaste deeltjes geïdentificeerd. Om BC-bollen te produceren, worden water, zwarte thee, suiker, azijn en bacteriecultuur gecombineerd in een verbijsterde kolf en wordt de inhoud geagiteerd. Na het bepalen van de juiste kweekomstandigheden voor BC-bolvorming, werd hun vermogen om vaste deeltjes in te kapselen getest met behulp van biochar, polymeerparels en mijnafval. Bollen werden gekenmerkt met behulp van ImageJ-software en thermische gravimetrische analyse (TGA). De resultaten geven aan dat bollen met een diameter van 7,5 mm in 7 dagen kunnen worden gemaakt. Het toevoegen van verschillende deeltjes verhoogt het gemiddelde groottebereik van de BC-capsules. De bollen inkapselde 10 - 20% van hun droge massa. Deze methode toont goedkope sfeerproductie en inkapseling die mogelijk is met gemakkelijk verkrijgbare materialen. BC-bollen kunnen in de toekomst worden gebruikt als hulpmiddel voor het verwijderen van verontreinigingen, het aanbrengen van kunstmest met gereguleerde afgifte of het wijzigen van de bodem.

Introduction

Bacteriële cellulose (BC) is genoteerd voor zijn potentiële industriegebruik toe te schrijven aan zijn mechanische sterkte, hoge zuiverheid en kristallinity, waterretentiecapaciteiten, en ingewikkelde vezelstructuur^1,2,3,4. Deze kenmerken maken BC een gunstig biomateriaal voor een verscheidenheid aan toepassingen, waaronder biomedische, voedselverwerking en milieusaneringstoepassingen¹. De vorming van een BC-film kan worden gedaan met culturen van één organisme of gemengde culturen zoals die worden gebruikt voor kombucha^5,een gefermenteerde theedrank. Het brouwen van kombucha is gebaseerd op een "Symbiotische cultuur van bacteriën en gist", algemeen bekend als een SCOBY. Met behulp van deze symbiotische cultuur van organismen wordt een vergelijkbare techniek gebruikt om BC-sferen te creëren. Dit biomateriaal kan worden gebruikt om milieuverontreinigingen te helpen isoleren en landbouwamendementen zoals biochar te verankeren om een efficiëntere gewasproductie te bereiken.

Eerdere literatuur heeft besproken hoe de kenmerken van BC geproduceerd in geagiteerd omstandigheden zich verhouden tot BC geproduceerd in een stationaire cultuur. Een stationaire cultuur resulteert in een film die zich vormt op de vloeistof-lucht interface, terwijl een geschud cultuur resulteert in verschillende BC deeltjes, strengen en bollen opgehangen in de vloeistof⁶. Veel studies hebben verwezen naar de bewering dat commerciële productie van BC haalbaarder is in de dynamische omstandigheden^6,7, wat een reden is voor de toepassing van de methode van dit document. Daarnaast zijn er diverse onderzoeken gedaan naar de structuur en eigenschappen van BC bollen. Toyosaki et al.⁶ vergeleken verbijsterde en gladwandige Erlenmeyer kolven in hun roerige BC-productie. Een studie van Hu en Catchmark⁴ bepaalde de omstandigheden voor BC-bollen die werden gebruikt als richtlijnen voor het huidige BC-bolproductieproces, en hun resultaten geven aan dat de bolgrootte na 60 uur niet blijft toenemen. Een overzicht van bc productie door Mohammad et al.¹ geeft aan dat het schudden van de BC cultuur zorgt voor een gelijkmatige zuurstoftoevoer en -distributie, wat nodig is voor een succesvolle BC-groei. Holland et al.⁸ hebben de kristalliniteit en chemische structuur van BC bestudeerd met behulp van röntgendiffractie en Fourier transformeren infraroodspectroscopie. Er wordt aangenomen dat BC-capsules vergelijkbare kenmerken zullen vertonen en toekomstig onderzoek zal structurele eigenschappen onderzoeken. Studies hebben ook de gunstige effecten onderzocht van het gebruik van BC om verbeterde biocomposieten te produceren. Met epoxyhars als basis hebben onderzoekers laten zien dat de toevoeging van BC de materiaaleigenschappen verbetert, zoals vermoeidheid, taaiheid van breuken en trek- en buigsterkte^9,10. Zoals blijkt uit eerder en huidig onderzoek, zijn velen geïnteresseerd in het commercialiseren van BC-gebruik.

Veel onderzoekers hebben bacteriële cellulose onderzocht in systemen met gereguleerde afgifte, en de hier beschreven methode genereert capsules die kunnen worden gebruikt als systemen voor gecontroleerde afgifte. Veel van dit onderzoek richt zich op gecontroleerde afgifte op biomedisch gebied, evenals enige exploratie in controlled release fertilizer (CRF) toediening. Op basis van het succes van bc's gecontroleerde afgifte van amoxicilline¹¹, lidocaïne¹², en ibuprofen¹³, BC kan soortgelijke leveringskenmerken vertonen met andere stoffen, zoals een pelletmeststof. Een overzicht van CRF's van Shaviv en Mikkelsen¹⁴ erkent dat CRF's efficiënter zijn, arbeid besparen en over het algemeen minder aantasting van het milieu veroorzaken dan conventionele kunstmesttoepassingen. Bacteriële cellulose kan werken als een gunstig inkapselingsmateriaal voor CRF's. Meststoffen kunnen uit de BC-membranen uitlogen of ontladen als BC-biodegraden^15,16. Bc's hoge water zwelling capaciteit kan ook fungeren als een gunstige bodem amendement^17,18,19 omdat zowel meststof voedingsstoffen en vocht kan vrijgeven in de grond door toepassing van BC sferen. Met deze eigenschappen kan een CRF gevormd door BC-bolinkapseling een voordeel hebben ten opzichte van andere materialen voor het coaten van meststoffen die negatieve effecten kunnen hebben tijdens hun productie- en verwijderingsfasen. Het aanpassen van BC in een kunstmestcoating kan crf-technologieën verder verbeteren. Door de afgiftesnelheid van meststoffen te verlagen, hebben gewassen voldoende tijd om de meststof op te nemen en overtollige afvloeiing in waterlichamen te voorkomen, waardoor eutrofiëring en niet-oxygeneerde zones worden verminderd. Soortgelijke slow-release meststoffen zijn bereid en gepiloteerd met polymeercoatings²⁰.

In tegenstelling tot protocollen die in eerder onderzoek werden beschreven, richt deze zich op uniforme, samenhangende bolproductie in plaats van een hoge celluloseopbrengst. Bovendien is bc-inkapseling van andere vaste stoffen bestudeerd met cellulosefilms, maar niet met bollen²¹. Door het onderzoek naar bacteriële cellulosebollen uit te breiden, kunnen verdere stappen worden gezet om BC commercieel te produceren, wat gunstig is vanwege de milieuvriendelijke eigenschappen van BC. Deze methode van BC sphere fabricatie maakt gebruik van goedkope, direct beschikbare culinaire ingrediënten. Na de eerste montage beginnen BC-bollen zich binnen 2 dagen zonder interferentie te vormen. Het produceren van BC-bollen via deze strategie vereist weinig ruimte en heeft een eetbaar bijproduct, de gefermenteerde thee 'kombucha'. Inkapselingstechnieken die in andere studies worden genoemd , omvatten coatings die zijn gevormd door de fase-inversietechniek^22,23, matrixvorming²⁴, sproeidrogen²⁵, en directe inkapseling tijdens^{synthese 26}. De directe inkapselingsmethode die in dit manuscript wordt beschreven, is nuttig voor diegenen die een eenvoudig, goedkoop proces wensen dat gebruik maakt van direct beschikbare materialen.

Door dit onderzoek is een succesvol protocol voor BC sphere productie en inkapseling tot stand gekomen. BC-bollen kunnen vaste deeltjes biochar, mijnstaarten en polystyreenmicroben in hun individuele structuren inkapselen. Hoewel bc nog niet veel wordt gebruikt in de industrie, is het een praktisch, duurzaam gemaakt en natuurlijk materiaal dat kan worden gebruikt voor toekomstige toepassingen.

Protocol

1. Creatie en onderhoud van bacteriële cellulosestartcultuur

1. Verkrijg een startkweek van bacteriële cellulose, ongeveer 50 g, in de vorm van een SCOBY. Het kan commercieel worden gekocht (bijv. bij Cultures for Health). Plaats de SCOBY in een bekerglas van 1 L, bedekt met een papieren handdoek.
2. Kook 700 ml gedeioneerd water, breng het over naar een apart vat van het vat met de SCOBY en voeg 85 g sacharose toe.
3. Zodra de sacharose is opgelost, voeg je 2 zakjes zwarte thee (4,87 g) toe. Laat de thee 1 uur trekken en verwijder de theezakjes voorzichtig met een roerstaafje.
4. Voeg 200 ml gedestilleerde witte azijn toe aan de thee. Laat het mengsel afkoelen tot 25 °C. Voeg na afkoeling 700 ml thee op kamertemperatuur toe aan het bekerglas met de SCOBY.
   LET OP: Het toevoegen van de zure thee terwijl het te warm is, kan schadelijk zijn voor de organismen in de SCOBY.
5. Bedek het bekerglas met een papieren handdoek en zet het vast met een elastische band en plaats het bekerglas in een opslagruimte met een temperatuur van 25 °C. Dit schip wordt gewoonlijk aangeduid als voorraadcultuur of een hotel.
6. Om de SCOBY gezond te houden is onderhoud ongeveer 2 keer per maand nodig.
   1. Gebruik gehandschoende handen om de SCOBY-matten tegen te houden en giet de vloeistof uit het hotel af in een apart bekerglas. Voeg in de container met de vloeistof voldoende zure thee toe voor in totaal 700 ml oplossing.
   2. Los 65 g sacharose op in de container met de zure thee. Terwijl u wacht tot de sacharose is opgelost, spoelt u de SCOBY-matten voorzichtig af in DI-water.
   3. Zodra de sacharose volledig is opgelost, kan de vloeistof worden toegevoegd aan het bekerglas met de gespoelde SCOBY-matten. Bedek het bekerglas en breng het terug naar het incubatiegebied.

2. Productie van bacteriële cellulosebollen

OPMERKING: Wees voorzichtig bij het werken met kokend water. Zorg ervoor dat glaswerk bestand is tegen de kokende watertemperaturen, vrij is van defecten en de juiste maat heeft. Figuur 1geeft een schema dat de productie van BC-bollen beschrijft .

1. Kook 350 ml gedeioneerd water met een waterkoker. Breng het warme water over op een bekerglas van 500 ml. Los 42,5 g gegranuleerde sacharose op in het hete water met behulp van een roerstaaf.
2. Wanneer de sacharose volledig is opgelost, laat u 1 zakje zwarte thee (2,54 g) gedurende 1 uur in de kolf met de sacharose en het water trekken. Verwijder hierna het theezakje met een roerstaafje, zorg ervoor dat het theezakje niet openbreekt en gooi het vervolgens in de prullenbak.
3. Voeg 100 ml gedestilleerde witte azijn toe aan het bekerglas en roer het mengsel vervolgens grondig. Breng 80 ml van het zure theemengsel over in een verbijsterde kolf van 250 ml. Laat het theemengsel afkoelen tot kamertemperatuur, 20 - 25 °C.
   OPMERKING: Op dit punt kan het mengsel 's nachts worden laten afkoelen of tot het is voorbereid op de volgende stap.
4. Zodra de vloeistoftemperatuur op kamertemperatuur is (20 - 25 °C), voegt u 20 ml microbiële startkweekvloeistof toe aan de verbijsterde kolf. Deze vloeistof kan worden verkregen bij een SCOBY hotel. Bedek de kolf met parafilm.
5. Plaats de verbijsterde kolf op een orbitale schudtafel en stel de snelheid in op 125 omwentelingen per minuut (tpm). Laat het mengsel 3 dagen schudden in een kamer of incubator met een temperatuur van 20 - 25 °C om BC-bollen te produceren.
   OPMERKING: Als zich onregelmatige vormen vormen in de inhoud van de kolf of als celluloseklonters aan de wanden van de kolf blijven plakken, moeten deze worden verwijderd om verdere onregelmatige BC-massa's te voorkomen. Gebruik een pincet om ongewenste BC-massa's te verwijderen, waaronder dunne snaren, ringen, buisvormige vormen en andere duidelijk niet-bolvormige vormen.
6. Zodra de bollen zich hebben gevormd, giet u ze voorzichtig uit de kolf en analyseert, verwijdert of gebruikt u ze op een manier die niet in dit papier is beschreven.

3. Bacteriële cellulosebollen gebruiken om deeltjes of verontreinigingen in te kapselen

1. Volg de stappen 2.1-2.5 hierboven.
2. Voeg na 3 dagen schudden ongeveer 0,01 g fijngemalen deeltjes toe aan de verbijsterde kolf. Geschikte vaste stoffen zijn biochar (260 ± 140 μm), mijnafval (350 ± 140 μm) en polystyreen microbeads (3 μm). De gegevens voor deze materialen worden beschreven in de sectie Representatieve resultaten. Zie de bijgevoegde tabel met materialen voor verdere beschrijvingen van biochar, mijnafval en microbeads.
3. Bedek de kolf opnieuw met de parafilm en plaats deze nog 3 dagen terug op een orbitale shaker met dezelfde snelheid en omgevingstemperatuur (20 - 25 °C). Verwijder de BC ingekapselde deeltjes voor analyse, verwijdering of ander gebruik.

Figuur 1. Bacteriële cellulose bol fabricage en inkapseling van vaste deeltjes. Stap 1 omvat het combineren van bacteriële stamcultuur met zwarte thee, suiker en azijnmedia in een verbijsterde kolf. De schijven in de stamcultuur vertegenwoordigen BC matten. Vervolgens wordt de verbijsterde kolf gedurende 3 dagen op een orbitale schudtafel geplaatst. De middelste trede toont vaste stoffen die aan de kolf worden toegevoegd zodra BC-bollen zijn gevormd. De kolf wordt nog 3 dagen geschud. In de laatste stap zijn BC-bollen steeds groter worden en de vaste deeltjes ingekapseld. Klik hier om een grotere versie van deze afbeelding te bekijken.

Results

BC-bollen hebben de snelste groeisnelheid tijdens de eerste 48 uur van de cultuur (figuur 2). Figuur 2 laat ook zien hoe de bollen de neiging hebben om een maximale gemiddelde grootte te bereiken en vervolgens constant te blijven. In dit experiment bereikten de bollen een gemiddelde diameter van 7,5 ± 0,2 mm. Hoewel de BC-sferen nooit volledig verslechteren binnen de groeiperiode van 10 dagen, begonnen ze wel ranken te vormen die zich rond de achtste dag uitstre...

Discussion

Dit protocol schetst BC sphere productie- en inkapselingsmethoden die eenvoudig uit te voeren en kosteneffectief zijn. Door verschillende aanpassingen aan het oorspronkelijke protocol is een adequaat proces geïdentificeerd. Er moeten kritische stappen worden genomen om levensvatbare gebieden te waarborgen. Alle ingrediënten die betrokken zijn bij BC-vorming spelen een sleutelrol in de gezondheid en duurzaamheid van de bollen. De sacharose voedt organismen, de thee levert stikstof en de azijn verlaagt de pH tot optimale o...

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
100 mL graduaalcilinder
1000 mL beker
25 mL graduaalcilinder
250 mL Erlenmeyer verblinde kolf	Chemglass	CLS-2040-02
500 mL beker
Balans
Biochar			Ponderosa dennenhout verhit onder argongas, verhit met 15 °C per minuut tot 800 °C
Zwarte thee
De-ioniseren water
Gedestilleerde witte azijn
Elastieke band
Microbiële startercultuur	Cultures for Health
Mijnafval			Verzameld vanuit Butte, MT: 46.001978,-112.582465. Mijnafval bevat grond en metalen afkomstig van vroegere kopermijnen. Mn, Si, Ca, Al en Fe waren de vijf meest voorkomende elementen die gemeten zijn in het mijnafval door middel van röntgendiffractie.
Mortel en stamper
Orbitale shaker			Gebruikt verschillende merken
Papierdoek
Polystyreen microbeads	Polybead	17138	3 micron diameter
Roerstaaf
Sucrose
Theeketel
TGA	TA Instruments	TA Q500	400 °C/min tot 800 °C, 100 mL/min N2
Thermometer
XRF-analyser	ThermoFisher Scientific	10131166