Methodenartikel

Tweestaps omgekeerde transcriptiedruppel digitale PCR-protocollen voor SARS-CoV-2-detectie en kwantificering

5.3K weergaven

⸱

DOI:

10.3791/62295

⸱

31 maart 2021

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Key Laboratory of Special Pathogens and Biosafety, Center for Biosafety Mega-Science, Wuhan Institute of Virology, Chinese Academy of Sciences, 2International College, University of Chinese Academy of Sciences, 3Sino-Africa Joint Research Center, 4CAS Key Laboratory of Molecular Virology & Immunology, Institut Pasteur of Shanghai, Chinese Academy of Sciences, 5Center for Infectious and Parasitic Diseases Control Research, Kenya Medical Research Institute

In dit artikel

Samenvatting

Dit werk vat stappen samen voor het ontwikkelen van verschillende testen voor SARS-CoV-2-detectie met behulp van een tweekleurig ddPCR-systeem. De stappen zijn uitgebreid en er zijn opmerkingen opgenomen over hoe de assays en experimentprestaties kunnen worden verbeterd. Deze testen kunnen worden gebruikt voor meerdere SARS-CoV-2 RT-ddPCR-toepassingen.

Samenvatting

Diagnose van de aanhoudende SARS-CoV-2-pandemie is een prioriteit voor alle landen over de hele wereld. Momenteel is reverse transcription quantitative PCR (RT-qPCR) de gouden standaard voor SARS-CoV-2-diagnose omdat er geen permanente oplossing beschikbaar is. Hoe effectief deze techniek ook is, er is onderzoek naar voren gekomen dat de beperkingen ervan in detectie en diagnose aantoont, vooral als het gaat om lage overvloedige doelen. Daarentegen is aangetoond dat droplet digital PCR (ddPCR), een recente opkomende technologie met superieure voordelen ten opzichte van qPCR, de uitdagingen van RT-qPCR bij de diagnose van SARS-CoV-2 uit laagovervloedige doelmonsters overwint. In dit artikel worden de mogelijkheden van RT-ddPCR verder uitgebreid door stappen te laten zien voor het ontwikkelen van simplex-, duplex-, triplex-sondemix- en quadruplex-assays met behulp van een tweekleurendetectiesysteem. Met behulp van primers en probes gericht op specifieke locaties van het SARS-CoV-2-genoom (N, ORF1ab, RPP30 en RBD2), wordt aangetoond dat de ontwikkeling van deze testen mogelijk is. Daarnaast worden stap voor stap gedetailleerde protocollen, notities en suggesties gegeven over hoe de testworkflow te verbeteren en gegevens te analyseren. Door deze workflow in toekomstige werkzaamheden aan te passen, wordt ervoor gezorgd dat het maximale aantal doelen gevoelig kan worden gedetecteerd in een kleine steekproef, waardoor de kosten en de monsterdoorvoer aanzienlijk worden verbeterd.

Inleiding

Polymerasekettingreactie (PCR), een algemeen erkende techniek, heeft sinds zijn komst verschillende transformaties ondergaan om een krachtige techniek te worden die antwoorden kan bieden op nucleïnezuuronderzoek. Deze transformaties zijn een constante verbetering van de oude techniek. Deze transformaties zijn samen te vatten in drie generaties1. De eerste generatie is conventionele PCR die afhankelijk is van gel-elektroforese om versterkte doelen te kwantificeren en te detecteren. De tweede generatie is kwantitatieve real-time PCR (qPCR) die monsters in realtime kan detecteren en vertrouwt op een standaardcurve om doelen in een monster direct te kwantificeren. De derde generatie, digitale PCR (dPCR), kan zowel detectie als absolute kwantificering van nucleïnezuurdoelen uitvoeren zonder dat een standaardcurve nodig is. dPCR is ook verder verbeterd van reactiekamers die worden gescheiden door de putten van een muur in emulsies van olie, water en stabiliserende chemicaliën in dezelfde put als te zien in op druppels gebaseerde digitale PCR2. In droplet digital PCR (ddPCR) wordt een monster verdeeld in duizenden druppels ter grootte van nanoliter met individuele doelen die later zullen worden gekwantificeerd met behulp van Poisson-statistieken 2,3,4. Deze techniek geeft ddPCR een voorsprong bij het kwantificeren van lage abundante doelen in vergelijking met de andere generaties PCR.

Onlangs hebben meerdere toepassingen de superioriteit van ddPCR ten opzichte van de veelgebruikte qPCR benadrukt bij het detecteren en kwantificeren van lage overvloedige doelen 1,5,6. SARS-CoV-2 is geen uitzondering op deze toepassingen 7,8,9,10,11,12. Sinds de uitbraak van SARS-CoV-2 werken wetenschappers op alle fronten aan oplossingen om het virus te diagnosticeren en efficiënt op te sporen. De huidige gouden standaard moet nog steeds qPCR13 zijn. Van RT-ddPCR is echter aangetoond dat het nauwkeuriger is in het detecteren van lage overvloedige SARS-CoV-2-doelen uit zowel omgevings- als klinische monsters in vergelijking met RT-qPCR 7,8,9,10,11,12. De meeste van de SARS-CoV-2 ddPCR gepubliceerde werken zijn afhankelijk van simplex assays met de multiplex assays afhankelijk van commerciële assays. Daarom moet er meer worden gedaan om uit te leggen hoe multiplex RT-dPCR-assays voor SARS-CoV-2-detectie kunnen worden ontwikkeld.

In een goed testontwerp kan multiplexing worden gebruikt om kosten te besparen, de monsterdoorvoer te verhogen en het aantal doelen te maximaliseren dat gevoelig kan worden gedetecteerd in een klein monster. Bij multiplexing met ddPCR moet men rekening houden met het aantal fluoroforen dat in een bepaald systeem kan worden gedetecteerd. Sommige ddPCR-platforms kunnen maximaal drie kanalen ondersteunen, terwijl andere slechts twee kanalen ondersteunen. Daarom moet men bij multiplexing met twee kanalen verschillende benaderingen gebruiken, waaronder multiplexing van hogere orde om meer dan twee doelente detecteren 14,15,16. In dit werk wordt een tweekleurig ddPCR-detectiesysteem gebruikt om stappen te laten zien voor het ontwikkelen van verschillende SARS-CoV-2 RT-ddPCR-assays die kunnen worden aangepast voor verschillende onderzoekstoepassingen.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Protocol

Ethische verklaring
Wuhan Institute of Virology (WHIOV) is een van de laboratoria en instituten die zijn goedgekeurd door China CDC van de stad Wuhan om onderzoek te doen naar SARS-CoV-2 en COVID-19 te detecteren uit klinische monsters. Onderzoek naar de ontwikkeling van nieuwe diagnostische technieken voor COVID-19 met behulp van klinische monsters is ook goedgekeurd door de ethische commissie van het Wuhan Institute of Virology (2020FCA001).

1. Workflow voor monsterverwerking (figuur 1A)

OPMERKING: In het hele protocol is het belangrijk om aparte ruimtes te gebruiken met speciale pipetten voor monsterbehandeling (extractie en opslag), reagens/mastermix-bereiding en -opslag, reactiemixvoorbereiding (monster plus mastermix) en detectie, om kruisbesmetting te voorkomen. De te ontwikkelen assays kunnen worden gebruikt bij de detectie van klinische monsters of onderzoeksmonsters. Alle monsters moeten worden behandeld alsof ze infectieuze agentia kunnen overbrengen, zelfs bij gebruik van veilige laboratoriumprocedures. De monsterverwerkingsstappen moeten worden uitgevoerd in een laboratorium van bioveiligheidsniveau 2 (BSL-2) volgens strikte BSL-2-regels, inclusief het dragen van geschikte persoonlijke beschermingsmiddelen (PBM).

  1. Voorbeeld inactivatie
    1. Neem 1 ml SARS-CoV-2-monster mee naar een BSL-2-laboratorium. Warmte-inactiveer monsters bij 65 °C gedurende 30 min.
      OPMERKING: Monsters kunnen afkomstig zijn van verschillende bronnen, daarom moet men ervoor zorgen dat het te inactiveren volume voldoende is om latere RNA-extractie te garanderen. De meeste extractiekits vereisen een klein monstervolume van maximaal 200 μL, vandaar dat een monstervolume van ongeveer 1 ml voldoende zou zijn voor inactivering. Oppervlakteactieve stoffen, kits en lysisbuffers kunnen ook worden gebruikt voor directe inactivatie en RNA-extractie volgens de eigen SOP van de laboratoria.
    2. Neem monsters mee naar een bioveiligheidskast (BSC) en laat ze 10 minuten op kamertemperatuur staan om potentiële aerosolen te laten bezinken. Bewaar monsters in 4 °C gedurende maximaal 24 uur als ze niet onmiddellijk worden verwerkt.
      OPMERKING: Er is geen specifieke container vereist voor monsteropslag. Monsters kunnen worden opgeslagen in de buizen of containers die tijdens de inactivering worden gebruikt. Voor dit werk werden de meeste monsters opgeslagen in virale transportmedia (VTM) buizen of 1,5 ml buizen.
  2. RNA-extractie
    OPMERKING: Veel RNA-extractie-instrumenten en -kits met specifieke protocollen zijn beschikbaar voor gebruik voor gebruik. Hier wordt een geautomatiseerde procedure volgens de instructies van de fabrikant gepresenteerd.
    1. Haal de voorgevulde 96-diepe putopeningplaat eruit; Keer het zachtjes ondersteboven om de magnetische kralen te mengen. Schud de plaat na het mengen voorzichtig op een plat oppervlak om reagens en magnetische kralen die zich op de muur kunnen bevinden naar de bodem van de plaat te concentreren.
    2. Scheur de afdichtingsfilm van aluminiumfolie voorzichtig af om trillingen van de plaat en morsen van vloeistof te voorkomen. Voeg 20 μL proteïnase K en 200 μL van het monster per put toe in rijen 2 en 8 van de 96-putplaat. Plaats vervolgens de 96-putplaat op de basis van het 32-kanaals automatische nucleïnezuurextractie-instrument.
      OPMERKING: Voer het programma uit op de computer binnen 1 uur na het toevoegen van het voorbeeld.
    3. Plaats de magnetische staafhuls in de kaartsleuf van het 32-kanaals automatische nucleïnezuurextractie-instrument. Selecteer het programma GF-FM502T5-TR"1"GF-FM502T5YH (snelle versie) en voer het uit.
    4. Na voltooiing van de extractie neemt u de nucleïnezuurmonsters in rijen 6 en 12 (ongeveer 100 μL / monster) en verdeelt u deze in een schone nucleasevrije 96-putplaat. Bewaar de monsters bij 4 °C gedurende maximaal 24 uur tot gebruik of bij -20 °C gedurende langere tijd.
      OPMERKING: Het wordt aanbevolen om een meerkanaalspipet van 100 μL te gebruiken om monsters over te brengen naar een nieuwe plaat van 100-200 μL, omdat deze rechtstreeks overeenkomt met de kolommen van de monsterplaat.
  3. cDNA generatie
    OPMERKING: Voor monsters die lange tijd zijn opgeslagen, vermijdt u meerdere vries-/dooicycli. Voer cDNA-generatie uit met behulp van een cDNA-kit volgens de instructies van de fabrikant.
    1. Voeg in een PCR-buis van 100 of 200 μL op ijs/koelblok 2 μL 5x RT-mastermix (bijv. Perfect Real Time), 5 μL monster-RNA en 3 μL RNase-vrije ddH2O per reactie (totaal volume 10 μL) toe.
    2. Plaats de PCR-buis in een thermische cycler die is ingesteld op 37 °C gedurende 15 minuten (omgekeerde transcriptie), 85 °C gedurende 5 s (warmte-inactivatie van reverse transcriptase) en 4 °C gedurende een oneindige tijd.
      OPMERKING: Verwerk de monsters onmiddellijk of bewaar ze bij 4 °C gedurende maximaal 24 uur tot gebruik of bij -20 °C gedurende maximaal 6 maanden.

2. Optimalisatie van ddPCR assay en workflow

OPMERKING: Optimaliseer de testen voor/na het lezen van de druppels. Afhankelijk van de resultaten kunnen ze op elk moment van het werk worden geoptimaliseerd om betere resultaten te bereiken. Hieronder vindt u enkele veelvoorkomende factoren waarmee rekening moet worden gehouden bij het optimaliseren van ddPCR-experimenten.

  1. Valideer de ddPCR primers en probes (tabel 1).
    OPMERKING: De primers ORF1ab en N zijn aangepast van China CDC17, het menselijke endogene controlegen (RPP30) van Lu et al.18 en RBD2 van Nyaruaba et al.13. Alle primers en probes behalve RBD2 waren al ddPCR getest en geoptimaliseerd 7,8,18.
  2. Voer de ddPCR-testmonsterbesturingselementen uit die bestaan uit een positieve controle (een voorbeeld met alle vier de doelen), Geen sjabloonbesturingselement (NTC; Nucleasevrij water of monster zonder doelen) en extractie/negatieve controle (totaal nucleïnezuur geëxtraheerd uit een niet-infectieuze gekweekte menselijke cel of gepoolde monsters van gezondheidsvrijwilligers).
    OPMERKING: Standaard controlemonsters met bekende kopieën van doelgenen hebben de voorkeur. Als er echter geen normen zijn, gebruikt u de beschikbare steekproeven om hun controles of monstermatrix te definiëren. Voer de besturingselementen samen met testvoorbeelden uit.
  3. Optimaliseer de gloeitemperatuur (figuur 2D) door een temperatuurgradiënt van 55 °C tot 65 °C in de gloeistap van PCR in te brengen (stap 3.2).
    OPMERKING: Optimalisatie van de gloeitemperatuur helpt bij het vinden van de beste temperatuur waarbij de druppelscheiding maximaal is (eenvoudige doelidentificatie) met minimale regen. Na het verkrijgen van de resultaten, verklein het temperatuurbereik voor een betere optimalisatie, bijvoorbeeld 55 °C tot 60 °C.
  4. Optimaliseer de primer- en sondeconcentraties. Als in de testen geen optimale scheiding tussen positieve en negatieve druppels wordt bereikt, varieer dan de primer (300-900 nM) en/of probe (100-400 nM) concentraties.
    OPMERKING: Het verlagen van primer/probe-concentraties resulteert in een lagere doeldruppelamplitude en het verhogen ervan verhoogt ook de amplitude van het doelwit. Dit kan nuttig zijn bij multiplexing op basis van amplitude.
  5. Test de analytische gevoeligheid rekening houdend met verschillende parameters, waaronder de limiet van blanco (LoB), detectiegrens (LoD), specificiteit en gevoeligheid met behulp van zowel standaard- als testmonsters, zoals gewenst.

3. ddPCR-workflow (figuur 1B) en testontwikkeling (tabel 2)

OPMERKING: Net als andere ddPCR-detectiesystemen bestaat deze workflow ook uit vier stappen (figuur 1B), waaronder reactiemixvoorbereiding, druppelgeneratie, PCR-versterking en druppellezing.

  1. Voorbereiding van de reactiemix
    OPMERKING: Bereid alle testen voor in een schone aparte ruimte en in een BSC. Neem de standaardvoorzorgsmaatregelen in acht, waaronder het gebruik van schone handschoenen, schone pipetten, nucleasevrij water en ontsmettingsmiddelen. Aliquote reagentia in afzonderlijke buizen en bewaren bij -20 oC om herhaalde vriesontdooicycli te voorkomen. Bereid assays voor zoals aangegeven in tabel 2. Primer- en sonde-stamoplossingen moeten in hoge concentraties van 100 μM worden bewaard. De werkoplossingen kunnen worden opgeslagen in aliquots van 20-40 μM (verdund in nucleasevrij water).
    1. Gemeenschappelijke stappen in alle assays
      OPMERKING: Bereken voordat u de assays voorbereidt het totale benodigde volume mastermix op basis van het aantal monsters. Hier werd elk mastermix-componentvolume vermenigvuldigd met 1,05 om rekening te houden met eventuele pipetteerfouten.
      1. Ontdooi en balanceer reactiematerialen tot kamertemperatuur. Vortex de reactiecomponenten kort (30 s) om homogeniteit te garanderen en kort centrifugeren om de inhoud op de bodem van de buis te verzamelen.
      2. Bereid per test een primer-probe (PP) mengsel voor door specifieke reactievolumes zoals beschreven in tabel 2 van de werkoplossingen te mengen.
      3. Bereid de mastermix door 11 μL (1x) 2x ddPCR supermix voor sondes (Geen dUTP), PP-mix (afhankelijk van de test zoals weergegeven in tabel 2 van de werkoplossing) en nucleasevrij water te mengen tot een eindvolume van 19,8 μL per put. Verdeel de mastermix in de putjes van een nucleasevrije 96-well ddPCR-plaat op basis van het aantal monsters.
        OPMERKING: Zorg ervoor dat alle 8 putjes in één kolom de oplossing hebben. Als slechts een paar putten worden gebruikt, bijvoorbeeld 5 monsters, vul dan de andere 3 putten met elk 22 μL nucleasevrij water of controlebuffer.
      4. Om het uiteindelijke reactiemengselvolume (22 μL) te krijgen, voegt u 2,2 μL cDNA-monster toe per put met mastermix. Sluit de plaat af met een wegwerp PCR-plaatsealer.
        OPMERKING: Voer de monstertoevoegingen uit in de daarvoor bestemde ruimte. Neem de controles op, d.w.z. positief, NTC en extractie. Bovendien, als de RNA-monsters een lage concentratie hebben, vermindert u het volume water in de mastermix en verhoogt u het monstervolume dienovereenkomstig tot 5,5 uL.
      5. Zodra het reactiemengsel per put is verdeeld, vortex kort (15-30 s) en centrifugeer (10-15 s) om de inhoud aan de onderkant van de plaat te verzamelen. Ga verder met het genereren van druppels.
  2. Geautomatiseerde druppelgeneratie (aanvullende figuur 1)
    OPMERKING: Verschillende druppelgeneratoren kunnen worden gebruikt; deze studie werd echter uitgevoerd met een geautomatiseerde druppelgenerator (AutoDG). Om ampliconbesmetting te voorkomen, moet u ervoor zorgen dat de druppelgenerator en lezers speciale ruimte hebben in afzonderlijke gebieden. Bij het laden van verbruiksartikelen wordt aanbevolen om te beginnen met laden vanaf de achterkant van het instrument en naar voren toe te werken om te voorkomen dat de handen over de verbruiksartikelen bewegen om kruisbesmetting te voorkomen.
    1. Verkrijg alle verbruiksartikelen die nodig zijn om de AutoDG in te stellen, inclusief AutoDG-olie voor sondes, DG32-cartridges, pipetpunten, koelblok, monsterplaat, druppelplaat (nieuwe schone ddPCR-plaat) en een afvalbak.
    2. Tik op het AutoDG-aanraakscherm op Monsterplaat configureren en selecteer kolommen waar monsters zich op de monsterplaat bevinden en druk op OK.
      OPMERKING: Het scherm wordt geel en geeft aan te geven dat er verbruiksartikelen moeten worden geladen.
    3. Open de AutoDG-deur en laad verbruiksartikelen op hun respectievelijke plaatsen.
      OPMERKING: De respectievelijke plaatsen waar verbruiksartikelen moeten worden geladen, hebben een gele indicator die later groen wordt als de verbruiksartikelen worden geladen. Dit is vergelijkbaar met het touchscreen.
    4. Laad de monsterplaat en druppelgeneratieplaat.
      OPMERKING: De druppelgeneratieplaat moet op het koelblok worden geplaatst. Zorg ervoor dat het koelblok paars is (klaar voor gebruik) en niet roze (moet in een vriezer worden bewaard totdat de kleur weer paars wordt).
    5. Sluit de AutoDG-klep, zorg ervoor dat het scherm groen is (verbruiksartikelen geladen) en selecteer/zorg ervoor dat het olietype Olie voor sondes is voordat u op Start Droplet Generation drukt.
    6. Wacht tot de druppels zijn gegenereerd. Open de deur zodra het scherm Droplets Ready toont en verwijder de plaat met de druppels.
    7. Sluit de plaat af met een doorboorbare folieafdichting met behulp van een plaatsealer die is ingesteld om gedurende 5 s op 185 oC te draaien. Ga verder met PCR-versterking.
      OPMERKING: PCR-versterking moet binnen 30 minuten na het genereren van druppels worden gestart.
  3. PCR-versterking
    1. Plaats de verzegelde druppelplaat in een 96-diepe bronthermische cycler, stel het monstervolume in op 40 μL en de temperatuur van het deksel op 105 °C.
    2. PCR versterkt de druppels met behulp van het programma: 95 °C gedurende 10 minuten (enzymactivering), 40 cycli van denaturatie bij 94 °C gedurende 30 s en 1 min gloeien / extensie bij 57 ° C, enzymdeactivering bij 98 ° C gedurende 10 minuten en stap voor onbepaalde tijd bij 4 °C vasthouden. Lees na de PCR de druppels af of bewaar ze maximaal 24 uur bij 4 °C.
      OPMERKING: Gebruik een hellingsnelheid van 2 °C /s bij alle stappen, omdat de hellingsnelheden kunnen verschillen voor verschillende thermische cyclers. Houd de plaat ten minste 30 minuten bij 4 °C om druppelstabilisatie mogelijk te maken voordat u de druppels afleest.
  4. Druppel lezen
    1. Breng de thermisch gefietste 96-well plaat over in een druppellezer en open / start op een computer die is aangesloten op de druppellezer de bijbehorende software.
    2. Selecteer in de installatiemodus Nieuw en dubbelklik vervolgens op een put om het dialoogvenster Broneditor te openen. Selecteer de te lezen putjes en kies Experiment: ABS, Supermix: ddPCR Supermix for Probes (geen dUTP), Target 1 Type: Ch1 Unknown, Target 2 Type: Ch2 Unknown.
      OPMERKING: Negatief, leeg, NTC of positief kan worden geselecteerd in het vervolgkeuzemenu van het doeltype 1/2 voor de controlemonsters.
    3. Wijs de doel- of voorbeeldnamen toe op basis van de plaatindeling en selecteer Toepassen. Als u klaar bent, selecteert u OK en slaat u de gemaakte sjabloon op. Klik op Uitvoeren en kies desgevraagd de juiste kleur (FAM/HEX).
      OPMERKING: Het wordt aanbevolen om het systeem voor de eerste keer dat u het uitvoert te primen voordat u het uitvoert. Controleer ook of alle lampjes in de lezer groen zijn en zo niet, volg dan de aanbevolen toepassing op de status van de tooltip.
    4. Nadat de gegevensverzameling is voltooid, verwijdert u de plaat uit de lezer. Analyseer gegevens indien nodig.
      OPMERKING: Aangezien voorlopige resultaten op het scherm te zien zijn, kan het uitvoeren van de positieve monsters in de eerste putten worden gebruikt voor realtime kwaliteitscontrole.

4. Gegevensanalyse (aanvullende figuren 2 en 3)

  1. Controleer de gegevens van alle putten voor het totale aantal druppels. Als het aantal druppels < 10.000 is, gooit u de resultaten weg en herhaalt u de test. Stel een cut-off in om positieve en negatieve resultaten te accepteren. Een druppeltelling van maximaal 3 of meer positieve druppels kan bijvoorbeeld worden beschouwd als de afsnijding voor positieve resultaten.
    OPMERKING: Gegevens voor alle assays, inclusief simplex, duplex, triplex probe mix en quadruplex assays worden gegenereerd met behulp van de bijbehorende software. Deze software is echter alleen geschikt voor simplex en duplex assays. Voor high order multiplex assays (>3 targets) is externe software nodig.
  2. Simplex en duplex assays
    OPMERKING: De externe software kan ook simplex- en duplexgegevens analyseren. Het gebruik van de bijbehorende software is echter gemakkelijker voor deze testen, vandaar dat deze in dit artikel worden gebruikt.
    1. Dubbelklik op het te analyseren .qlp-bestand om het te openen en selecteer Analyseren.
    2. Gebruik de drempelgereedschappen in de 1D-amplitude en 2D-amplitude om onderscheid te maken tussen positieve en negatieve druppels voor elke put in het juiste kanaal. De NTC- en positieve controlemonsters kunnen worden gebruikt als leidraad voor het instellen van drempels.
      OPMERKING: FAM-resultaten zijn te zien in kanaal 1 en HEX/VIC in kanaal 2.
    3. Na het instellen van de drempel kunnen de resultaten worden geëxporteerd als een .csv bestand en verder worden geanalyseerd in Excel of worden vastgelegd door rechtstreeks in het resultatenvenster te lezen.
  3. Triplex probe mix (aanvullende figuur 2) en quadruplex assays (aanvullende figuur 2)
    OPMERKING: Voordat u de triplex probe mix en de quadruplex assay analyseert, downloadt u de externe software. Raadpleeg de minimale systeemvereisten voordat u installeert.
    1. Open het .qlp-bestand door er met de rechtermuisknop op te klikken en Openen met de externe software te kiezen, of door de externe software te openen en op de optie Bladeren te klikken om het .qlp-bestand in uw map te zoeken, of door gewoon het .qlp-bestand te slepen en neer te zetten op de reeds geopende externe software.
    2. Selecteer op het tabblad plaateditor de putten die u wilt analyseren aan de rechterkant van het tabblad.
      1. Voor triplex probe mix selecteert u Direct Quantification (DQ) als experimenttype, selecteert u Probe Mix Triplex als assay-informatie en voert u dienovereenkomstig doelnamen in en klikt u vervolgens op Toepassen.
      2. Voor quadruplex selecteert u Direct Quantification (DQ) als experimenttype, selecteert u Amplitude Multiplex als testinformatie en voert u dienovereenkomstig doelnamen in en klikt u vervolgens op Toepassen.
    3. Gebruik aan de linkerkant van het tabblad 2D-amplitude de Hulpmiddelen voor grafieken om specifieke kleuren toe te wijzen aan verschillende doelclusters na de pop-upsuggesties voor het venster Selecteren om cluster toe te wijzen .
      OPMERKING: De voorkeursclustermodus kan worden toegepast op basis van de voorkeur van de gebruiker.
    4. Zodra de doelkleuren zijn toegewezen, kunnen kwantificeringsgegevens worden gelezen in het venster Putgegevens rechtsonder. Exporteer gegevens naar Excel /csv voor verdere analyse met behulp van het pictogram met drie balken in de rechterbovenhoek van de brongegevenstabel.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Resultaten

In een proof-of-concept studie werden de analytische prestaties van de multiplex assays getest op klinische en onderzoeksmonsters19. De prestaties van de multiplex assays waren superieur aan die van een RT-PCR19. Omdat lage aantallen druppels kunnen wijzen op een probleem tijdens het genereren van druppels, is in dit artikel een cutoff van 10.000 druppels per put ingesteld op basis van empirische gegevens.

Een goede scheiding tussen positieve en ...

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Discussie

Er zijn weinig bronnen beschikbaar over het ontwikkelen van RT-ddPCR-assays voor SARS-CoV-2-detectie. Hoewel niet gebruikt in dit artikel, kunnen standaardmonsters met bekende kopieën worden gebruikt om assays te ontwikkelen en te optimaliseren. In dit werk werden SARS-CoV-2-monsters gekweekt in Vero-E6-cellen echter geprikt in een achtergrond van menselijk genomisch RNA en gebruikt als standaardmonsters om de assays te ontwikkelen. Goede primer- en sondesequenties zijn essentieel bij het ontwikkelen van assays. Aangezie...

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Openbaarmakingen

De auteurs hebben geen conflicten te onthullen.

Dankbetuigingen

Dit onderzoek werd gefinancierd door Megaproject of Infectious Disease Control van het Ministerie van Volksgezondheid van China, subsidienummer 2017ZX10302301-005 en Sino-Africa Joint Research Center, subsidienummer SAJC201605.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel
NaamBedrijfCatalogusnummerOpmerkingen
32-kanaals volledig automatische nucleïnezuur extractor Purifier 32Genfine BiotechFHT101-32Geautomatiseerde extractor voor RNA
AutoDG Olie voor ProbesBioRad12003017QX200 AutoDG verbruiksartikel
ddPCR 96-Well PlatenBioRad12003185
ddPCR Supermix voor Probes (geen dUTP)BioRad1863024Maken van ddPCR assay mastermix
DG32 AutoDG CartridgesBioRad1864108QX200 AutoDG verbruiksartikel
Elektronische thermostatische waterbadpotBeijing Changfeng Instrument and Meter CompanyXMTD-8000Hitte-inactivatie van monsters
FineMag Rapid Bead Virus DNA/RNA Extractie KitGenfine BiotechFMY502T5Magneetparel extractie van geïnactiveerde RNA-monsters
Doorboorbare Folie HittesluitingenBioRad1814040
Pipettips voor de AutoDGBioRad1864120QX200 AutoDG verbruiksartikel
Pipettip Afvalbakken voor de AutoDGBioRad1864125QX200 AutoDG verbruiksartikel
PrimeScript RT Master Mix (Perfect Real Time)TaKaRaRR036AcDNA generatie
PX1 PCR Plate SealerBioRad1814000De druppelplaat van AutoDG afdichten
QuantaSoft 1.7 SoftwareBioRad10026368Data acquisitie en analyse
QuantaSoft Analysis Pro 1.0BioRadN/AData analyse
QX200 Geautomatiseerde Druppel Generator (AutoDG)BioRad1864101QX200 AutoDG verbruiksartikel
QX200 Druppel ReaderBioRad1864003Druppel lezen en data acquisitie
T100 ThermocyclerBioRad1861096Druppel doelversterking (PCR) en cDNA generatie

Referenties

  1. Nyaruaba, R., Mwaliko, C., Kering, K. K., Wei, H. Droplet digital PCR applications in the tuberculosis world. Tuberculosis. 117, 85-92 (2019).
  2. Baker, M. Digital PCR hits its stride. Nature Methods. 9 (6), 541-544 (2012).
  3. Quan, P. L., Sauzade, M., Brouzes, E. dPCR: a technology review. Sensors. 18 (4), Basel, Switzerland. 1271(2018).
  4. Vogelstein, B., Kinzler, K. W. Digital PCR. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 96 (16), 9236(1999).
  5. Kuypers, J., Jerome, K. R. Applications of digital PCR for clinical microbiology. Journal of Clinical Microbiology. 55 (6), 1621(2017).
  6. Li, H., et al. Application of droplet digital PCR to detect the pathogens of infectious diseases. Bioscience Reports. 38 (6), (2018).
  7. Liu, X., et al. Analytical comparisons of SARS-COV-2 detection by qRT-PCR and ddPCR with multiple primer/probe sets. Emerging Microbes & Infections. 9 (1), 1175-1179 (2020).
  8. Suo, T., et al. ddPCR: a more accurate tool for SARS-CoV-2 detection in low viral load specimens. Emerging Microbes & Infections. 9 (1), 1259-1268 (2020).
  9. Liu, Y., et al. Aerodynamic analysis of SARS-CoV-2 in two Wuhan hospitals. Nature. 582 (7813), 557-560 (2020).
  10. Lv, J., et al. Detection of SARS-CoV-2 RNA residue on object surfaces in nucleic acid testing laboratory using droplet digital PCR. Science of The Total Environment. 742, 140370(2020).
  11. Yu, F., et al. Quantitative detection and viral load analysis of SARS-CoV-2 in infected patients. Clinical Infectious Diseases. 71 (15), 793-798 (2020).
  12. Scutari, R., et al. Long-term SARS-CoV-2 infection associated with viral dissemination in different body fluids including bile in two patients with acute cholecystitis. Life. 10 (11), 302(2020).
  13. Nyaruaba, R., et al. Development of a field-deployable RT-qPCR workflow for COVID-19 detection. Preprints. , (2020).
  14. Whale, A. S., Huggett, J. F., Tzonev, S. Fundamentals of multiplexing with digital PCR. Biomolecular Detection and Quantification. 10, 15-23 (2016).
  15. Dobnik, D., Štebih, D., Blejec, A., Morisset, D., Žel, J. Multiplex quantification of four DNA targets in one reaction with Bio-Rad droplet digital PCR system for GMO detection. Scientific Reports. 6 (1), 35451(2016).
  16. Nyaruaba, R., et al. Development and evaluation of a single dye duplex droplet digital PCR assay for the rapid detection and quantification of mycobacterium tuberculosis. Microorganisms. 8 (5), 701(2020).
  17. VDC Institute. Specific primers and probes for detection 2019 novel coronavirus. , Available from: http://www.chinaivdc.cn/kyjz/202001/t20200121_211337.html (2020).
  18. Lu, R., et al. SARS-CoV-2 detection using digital PCR for COVID-19 diagnosis, treatment monitoring and criteria for discharge. medRxiv. , (2020).
  19. Nyaruaba, R., et al. Developing multiplex ddPCR assays for SARS-CoV-2 detection based on probe mix and amplitude based multiplexing. Expert Review of Molecular Diagnostics. , 1-11 (2020).

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Herprints en machtigingen

Toestemming aanvragen om de tekst of afbeeldingen van dit JoVE-artikel te hergebruiken

Toestemming aanvragen

Trefwoorden

Omgekeerde transcriptie PCRMultiplex ddPCR assayTweestaps RT ddPCRVirale kwantificeringDuplex assayTriplex sondemixQuadruplex assayAbsolute kwantificering

Gerelateerde artikelen