Methodenartikel

Gerichte inductie van retinale organoïden uit menselijke pluripotente stamcellen

DOI:

10.3791/62298

⸱

21 april 2021

 , 
1Beijing Institute of Ophthalmology, Beijing Tongren Eye Center, Beijing Tongren Hospital, Capital Medical University, Beijing Ophthalmology & Visual Science Key Laboratory

In dit artikel

Samenvatting

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Met behulp van een zelforganiserende methode ontwikkelen we met de toevoeging van COCO een protocol dat de generatie van fotoreceptoren aanzienlijk zou kunnen verhogen.

Samenvatting

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Retinale celtransplantatie is een veelbelovende therapeutische aanpak, die de retinale architectuur kan herstellen en de visuele mogelijkheden voor het gedegenereerde netvlies kan stabiliseren of zelfs verbeteren. Niettemin wordt de vooruitgang in celvervangingstherapie momenteel geconfronteerd met de uitdagingen van het vereisen van een kant-en-klare bron van hoogwaardige en gestandaardiseerde menselijke netvliezen. Daarom is een eenvoudig en stabiel protocol nodig voor de experimenten. Hier ontwikkelen we een geoptimaliseerd protocol, gebaseerd op een zelforganiserende methode met behulp van exogene moleculen en reagens A, evenals handmatige excisie om de driedimensionale human retina organoids (RO) te genereren. De van menselijke pluripotente stamcellen (PSC's) afgeleide RO drukt specifieke markers voor fotoreceptoren uit. Met de toevoeging van COCO, een multifunctionele antagonist, wordt de differentiatie-efficiëntie van voorlopers en kegels van fotoreceptoren aanzienlijk verhoogd. Het efficiënte gebruik van dit systeem, dat de voordelen heeft van cellijnen en primaire cellen, en zonder de bronproblemen die met de laatste gepaard gaan, zou confluente retinale cellen kunnen produceren, vooral fotoreceptoren. De differentiatie van PSC's naar RO biedt dus een optimaal en biorelevant platform voor ziektemodellering, geneesmiddelenscreening en celtransplantatie.

Inleiding

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Pluripotente stamcellen (PSC's) worden gekenmerkt door hun zelfvernieuwing en het vermogen om te differentiëren in allerlei somatische cellen. Zo zijn organoïden afgeleid van PSC's een belangrijke hulpbron geworden in onderzoek naar regeneratieve geneeskunde. Retinale degeneratie wordt gekenmerkt door het verlies van fotoreceptoren (staafjes en kegeltjes) en retinaal pigmentepitheel. Retinale celvervanging kan een bemoedigende behandeling zijn voor deze ziekte. Het is echter niet haalbaar om menselijke netvliezen te verkrijgen voor ziekteonderzoek en therapie. Daarom zijn retinale organoïden (RO's) afgeleid van PSC's, die effectief en met succes meerlagige inheemse retinale cellen recapituleren, gunstig voor fundamenteel en translationeel onderzoek 1,2,3. Ons onderzoek richt zich op RO-differentiatie om voldoende en kwaliteitscellen te leveren voor het bestuderen van retinale degeneratie4.

Methoden voor het differentiëren van RO's zijn voortdurend in opkomst, met driedimensionale (3D) suspensiedifferentiatie die in 2012 door het Sasai-laboratorium werd gepionierd5. We introduceerden de CRX-tdTomato-tag in de menselijke embryonale stamcellen (hESCs) om specifiek de voorlopercellen van de fotoreceptor te volgen en pasten de methode aan met de toevoeging van COCO, een multifunctionele antagonist van de Wnt-, TGF-β- en BMP-routes6. Van COCO is aangetoond dat het de differentiatie-efficiëntie van fotoreceptorvoorlopers en kegels efficiënt verbetert 6,7.

Al met al hebben we, door de klassieke differentiatiemethode aan te passen, een toegankelijk protocol ontwikkeld om overvloedige voorlopers en kegels van fotoreceptoren van menselijke RO's te oogsten voor het analyseren van de retinale ziekte geassocieerd met de fotoreceptoren door middel van laboratoriumonderzoek en voor verdere klinische toepassing / transplantatie.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Deze studie werd goedgekeurd door de institutionele ethische commissie van het Beijing Tongren Hospital, Capital Medical University. H9 hESCs werden verkregen van het WiCell Research Institute en genetisch gemanipuleerd tot tdTomato-gelabelde cellijn.

1. Generatie van menselijke RO's

  1. Kweek de hESCs onder feedervrije omstandigheden.
    1. Bekleed een putje van een 6-wellsplaat met 1 ml reagens A (materiaaltabel) bij 37 °C gedurende ten minste een half uur volgens de instructies van de fabrikant. Ontdooi een aliquot van 1x106 hESCs.
      OPMERKING: Bereid 3 ml voorverwarmd reagens B (materiaaltabel) en breng de gecryopreserveerde cellen (1 ml) over in 3 ml vers medium. Pipetteer de hESCs niet naar afzonderlijke cellen.
    2. Centrifugeer op 200 x g gedurende 5 min en verwijder het supernatant.
    3. Zaai de cellen in de reagens A-gecoate plaat met 2 ml reagens B en verander dagelijks 2 ml reagens B. Passagecellen bij het bereiken van ongeveer 80% confluency (meestal ongeveer 4 dagen).
  2. Dag 0
    1. Dissociëer hESCs naar een eencellige suspensie met behulp van medium I (tabel 1). Bereid medium I door het volgende te mengen: 20% (v/v) KnockOut serumvervanging (KSR), 0,1 mM MEM niet-essentiële aminozuren oplossing (NEAA), 1 mM pyruvaat,3 μM IWR-1-endo (IWR1e), 30 ng/ml COCO, 100 U/ml penicilline, 100 μg/ml streptomycine (PS), 0,1 mM β-mercaptoethanol en Glasgow's Eagle's minimal essential medium (GMEM).
      OPMERKING: Bereid vóór het begin van de dissociatie medium I en breng 12 ml medium I met 20 μM Y-27632 over in een petrischaaltje van 10 cm, 500 μL reagens C (materiaaltabel) met 0,05 mg/ml reagens D (materiaaltabel) en 20 μM Y-27632 in een buis van 1,5 ml. Voer de bovenstaande stappen uit in het donker, omdat component IWR1e in medium I lichtgevoelig is.
    2. Was de hESCs met voorverwarmde 1x Dulbecco's fosfaat-gebufferde zoutoplossing (DPBS) buffer.
    3. Voeg het bereide reagens van 500 μL (in de buis van 1,5 ml) toe en incubeer de hESCs gedurende 3,5 min bij 37 °C en 5% CO2.
    4. Maak de cellen los door de zijkant en onderkant van de plaat gedurende enkele seconden te vegen en voeg 500 μL bereid medium I uit de petrischaal toe aan de hESC-plaat.
      OPMERKING: Bereid een buis van 1,5 ml voor met 900 μL 1x DPBS en gebruik een hemocytometer voor het tellen van cellen.
    5. Oogst de cellen in een nieuwe buis van 1,5 ml en pipetteer de celsuspensie op en neer en haal vervolgens 100 μL uit de buis en voeg vervolgens toe aan de buis met 900 μL DPBS voor het tellen van cellen.
    6. Dispergeer de linker celsuspensie van 900 μL en verdun de cellen vervolgens met bereid medium I in de petrischaal tot 9 x 104 cellen/ml.
      OPMERKING: Het hele volume van het medium is 12 ml; In totaal zijn er 1,08 x 106 cellen nodig.
    7. Voeg 100 μL celsuspensie toe aan elke put van een niet-aanhangende, V-bodem, 96-well plaat (Tabel met materialen).
      OPMERKING: Gebruik een meerkanaals pipet om de tijd te verkorten en zorg ervoor dat elke put een gelijkwaardig celnummer bevat. Schud de petrischaal elke keer voordat u 100 μL porties verwijdert. Het is belangrijk dat de cellen gelijkmatig verdeeld zijn.
    8. Draai de 96-well plaat lichtjes in een low-speed shaker gedurende 5 minuten en incubeer vervolgens bij 37 °C en 5% CO2.
      LET OP: Houd de plaat in het donker. Stel de dag in als dag 0.
  3. Dag 2
    1. Voeg 1% reagens A toe (materiaaltabel). Bereid reagens A (eiwitconcentratie van 10 mg/ml) door 133,4 μL reagens A toe te voegen aan 2 ml medium I.
      OPMERKING: Houd reagens A 's nachts voor gebruik op 4 °C om volledig en gelijkmatig smelten te bereiken. Let op de productinformatie en zoek op het catalogusnummer de en het lotnummer op de officiële website van het bedrijf om de eiwitconcentratie van reagens A te hebben, omdat elke fles reagens A een andere eiwitconcentratie heeft. Als de eiwitconcentratie laag is, zou een verhoogd volume reagens A nuttig zijn.
    2. Voeg 20 μL bereid reagens A toe aan elk putje en pipetteer tweemaal in het midden om de dode cellen te verspreiden.
      OPMERKING: Onderhoud het reagens A en de 96-well plaat onder koele omstandigheden en voltooi alle stappen op ijs. Plaats het bord in het donker.
  4. Dag 2-12
    1. Reinig de bodem van de 96-well plaat en incubeer bij 37 °C en 5% CO2 tot dag 6. Verander op dag 6 de helft van het medium door 58 μL van het medium uit elke put te verwijderen en 60 μL medium I toe te voegen.
      OPMERKING: Gebruik een meerkanaals pipet om de halve mediumwissel te voltooien. Voer deze stap voorzichtig uit om ervoor te zorgen dat er geen celpellets uit de put worden verwijderd. Giet het medium aan tot een schone petrischaal van 10 cm. Als er celpellets in zitten, voeg ze dan weer toe aan de 96-well plaat.
  5. Dag 12- 18
    1. Verander het medium in medium II (tabel 1) op dag 12. Bereid medium II met 1% (v/v) reagens A door het volgende te mengen: 10% foetaal runderserum (FBS), 0,1 mM NEAA, 1 mM pyruvaat,100 U/ml penicilline, 100 μg/ml streptomycine, 0,1 mM β-mercaptoethanol, 100 nM SAG dihydrochloride en GMEM. Bewaar het onder koele en donkere omstandigheden.
    2. Oogst de celpellets in een conische buis van 15 ml uit de 96-wellsplaat en laat de pellets 5 minuten op natuurlijke wijze bezinken bij kamertemperatuur.
      OPMERKING: Verwijder het medium en de pellets voorzichtig onder het oppervlak om bubbels te voorkomen.
    3. Verwijder het supernatant terwijl u voor de organoïden zorgt. Breng de celaggregaten over in een suspensieschaal van 10 cm met 18 ml bereid medium II met reagens A.
      OPMERKING: Voeg het bereide medium II niet van tevoren toe aan de schaal van 10 cm, omdat het reagens A bij 4 °C moet zijn.
    4. Incubeer bij 37 °C en 5% CO2 tot dag 18.
  6. Vanaf dag 18
    1. Verander het medium in medium III (tabel 1). Bereid medium III onder donkere omstandigheden door het volgende te mengen: 10% FBS, 1xsupplement 1, 0,5 μM retinoïnezuur (RA), 100 μM taurine, 100 U/ml penicilline, 100 μg/ml streptomycine en 1:1 mengsel van Dulbecco's gemodificeerde adelaarsmedium (DMEM)/nutriëntenmengsel F-12.
    2. Op dag 18, wanneer een semitransparant optisch blaasje wordt gegenereerd, snijdt u de organoïden met behulp van een microchirurgisch mes.
      OPMERKING: Splits de organoïde, meestal in vier stukken, in een petrischaal met medium II. Elk stuk moet in de volgende weken uitgroeien tot een intacte optische beker.
    3. Verzamel alle pellets naar het midden van het gerecht. Oogst de cellen in een conische valkbuis van 15 ml en laat natuurlijke bezinking toe. Verwijder vervolgens voorzichtig het supernatant.
      OPMERKING: Vanwege hun grootte kunnen organoïden in het midden worden geaggregeerd door de petrischaal een paar keer in één richting te draaien gedurende 90 ° op een horizontaal vlak.
    4. Suspensieer en dispergeer de pellets in twee petrischalen van 10 cm, met 18 ml medium III per schaal, en breng de schotels voorzichtig over naar de incubator om celaggregatie te voorkomen. Blijf kweken in medium III bij 37 °C en 5% CO2 en verander het medium wekelijks. De CRX uitgedrukt na dag 45 en tot dag 120 konden we het out-segment van de fotoreceptor detecteren.

2. Menselijke RO's analyseren

  1. FACS-analyse
    1. Monteer drie CRX-tdTomato en drie van H9 ES afgeleide organoïden uit de gerechten met behulp van de gesneden 1 ml tips. Was de organoïden met 1 ml voorverwarmde (kamertemperatuur) DPBS.
    2. Bereid de digestiebuffer door 0,25% trypsine-EDTA-oplossing te mengen met 0,05 mg/ml reagens D.
    3. Dissocieer de organoïden in afzonderlijke cellen met behulp van de bereide digestiebuffer gedurende 8 minuten bij 37 °C. Voeg vervolgens hetzelfde volume DPBS toe met 10% FBS en 0,05 mg/ml reagens D om de reactie te inactiveren.
    4. Suspensie en verstrooi de cellen licht en filter vervolgens met behulp van een celzeef van 100 μm en gebruik een fluorescence-activated cell sorting (FACS) -systeem bij 561 nm excitatielaserlijn en 780/60-filter om de CRX-tdTomato-positieve signalen te analyseren.
      OPMERKING: CRX drukt zich aanvankelijk uit op dag 45 en neemt toe met de rijping van organoïden. Tienduizend cellen worden gebruikt voor elke test, voor elk tijdstip worden ten minste drie herhalingen voltooid.
  2. Fluorescentie-intensiteit kwantificering van RO's
    1. Bereid de levensvatbare organoïden willekeurig voor op beeldvorming.
      OPMERKING: Stel de parameters in en gebruik dezelfde filters en parameters voor alle fluorescentie-intensiteitsmonitoren.
    2. Leg beelden vast en analyseer de gemiddelde fluorescentie-intensiteit met behulp van geschikte software (bijv. ImageJ).
    3. Importeer de afbeeldingen en converteer vervolgens naar 8-bits met behulp van Image | Typen.
    4. Pas de drempel aan met behulp van de standaardparameters van Image | | aanpassen Drempel.
    5. Bepaal het gemeten gebied en evalueer vervolgens de grijswaarde met behulp van Analyseren | Meten.
      OPMERKING: De gemiddelde waarden in het resultatenpaneel zijn de gemiddelde fluorescentie-intensiteit van het gemeten gebied.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Resultaten

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

De schematische illustratie toont het differentiatieprotocol om voorlopercellen met COCO te verbeteren (figuur 1). Van PSC tot RO's, tal van details kunnen resultaatvariaties veroorzaken. Het wordt aanbevolen om elke stap en zelfs het catalogusnummer en het lotnummer van elk medium vast te leggen om de hele procedure bij te houden.

Hierin bieden we heldere veldbeelden voor dag 6, 12, 18 en 45 (figuur 2). Op dag 6 hebben de organoïden ...

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Discussie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Retinale organoïde differentiatie is een wenselijke methode voor het genereren van ruime functionele retinale cellen. De RO is een samenstelling van verschillende retinale cellen, zoals ganglioncellen, bipolaire cellen en fotoreceptoren, gegenereerd door pluripotente stamcellen in de richting van het neurale netvlies 4,5,8,9. Hoewel confluente RO's kunnen worden geoogst, is het tijdrovend, wat ...

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Dankbetuigingen

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

We bedanken de leden van het 502-laboratorium voor hun technische ondersteuning en nuttige opmerkingen over het manuscript. Dit werk werd gedeeltelijk ondersteund door de Beijing Municipal Natural Science Foundation (Z200014) en het National Key R&D Program of China (2017YFA0105300).

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Materialen

```html

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel
NaamBedrijfCatalogusnummerOpmerkingen
2-mercaptoethanolLife Technologies21985-023
COCOR&D Systems3047-CC-050DAN Domain family of BMP antagonists
DMEM/F-12Gibco10565-042
DMSOSigmaD2650
DPBSGibcoC141905005BT
EDTAThermo15575020
Fetal Bovine Serum (FBS), Qualified for Human Embryonic Stem CellsBiological Industry04-002-1A
GMEMGibco11710-035
KnockOut Serum Replacement-Multi-SpeciesGibcoA3181502
MEM Non-essential Amino Acid Solution (100X)sigmaM7145
Pen StrepGibco15140-122
Primesurface 96 V-plateSbioMS9096SZCellaggregatie in 1.2.7
PyruvateSigmaS8636
Reagent ABD356231Matrigel in 1.1.1
Reagent BStemCell5990mTeSR- E8, PSCs basaal medium in 1.1.2
Reagent CGibco12563-011TrypLE Express in 1.2
Reagent DRoche11284932001DNase I, in 1.2
Retinoic acidSigmaR2625-100MG
SAGEnzo Life ScienceALX-270-426-M001
Supplement 1Life Technologies17502-048N-2 Supplement (100X), Liquid, supplemet in medum III
TaurineSigmaT-8691-25G
Trypsin-EDTA (0.25%), phenol redGibco25200056Organoïde dissociatie in 2.1.3
Wnt Antagonist I, IWR-1-endo - CalbiochemSigma681669Wnt inhibitor
Y-27632 2HClSelleckS1049
```

Referenties

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Xie, H., et al. Chromatin accessibility analysis reveals regulatory dynamics of developing human retina and hiPSC-derived retinal organoids. Science Advances. 6 (6), 5247(2020).
  2. Lu, Y. F., et al. Single-Cell Analysis of Human Retina Identifies Evolutionarily Conserved and Species-Specific Mechanisms Controlling Development. Developmental Cell. 53 (4), 473-491 (2020).
  3. Cowan, C. S., et al. Cell Types of the Human Retina and Its Organoids at Single-Cell Resolution. Cell. 182 (6), 1623-1640 (2020).
  4. Jin, Z. B., et al. Stemming retinal regeneration with pluripotent stem cells. Progress in Retinal and Eye Research. 69, 38-56 (2019).
  5. Nakano, T., et al. Self-formation of optic cups and storable stratified neural retina from human ESCs. Cell Stem Cell. 10 (6), 771-785 (2012).
  6. Pan, D., et al. COCO enhances the efficiency of photoreceptor precursor differentiation in early human embryonic stem cell-derived retinal organoids. Stem Cell Research and Therapy. 11 (1), 366(2020).
  7. Zhou, S., et al. Differentiation of human embryonic stem cells into cone photoreceptors through simultaneous inhibition of BMP, TGFbeta and Wnt signaling. Development. 142 (19), 3294-3306 (2015).
  8. Deng, W. L., et al. Gene Correction Reverses Ciliopathy and Photoreceptor Loss in iPSC-Derived Retinal Organoids from Retinitis Pigmentosa Patients. Stem Cell Reports. 10 (4), 1267-1281 (2018).
  9. Gao, M. L., et al. Patient-Specific Retinal Organoids Recapitulate Disease Features of Late-Onset Retinitis Pigmentosa. Frontiers in Cell and Developmental Biology. 8, 128(2020).
  10. Zhang, C. J., Ma, Y., Jin, Z. B. The road to restore vision with photoreceptor regeneration. Experimental Eye Research. 202, 108283(2020).
  11. Reichman, S., et al. From confluent human iPS cells to self-forming neural retina and retinal pigmented epithelium. Proceedings of the National Academy of Sciences of the U. S. A. 111 (23), 8518-8523 (2014).
  12. Kuwahara, A., et al. Generation of a ciliary margin-like stem cell niche from self-organizing human retinal tissue. Nature Communications. 6, 6286(2015).

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Herprints en machtigingen

Toestemming aanvragen om de tekst of afbeeldingen van dit JoVE-artikel te hergebruiken

Toestemming aanvragen

Trefwoorden

Retinale celtransplantatiefotoreceptorvoorlopersorgano d differentiatieopticuvezikelcelaggregatieziekte modelleringdrugscreeningCRX expressie

Gerelateerde artikelen